Ефекти времена контралатералне нефректомије и исхемијских стања на фиброзу бубрега након једностране исхемијско-реперфузијске повреде бубрега
Oct 27, 2023
Увод
Учесталостакутна повреда бубрега(АКИ) се драматично повећао широм света последњих година [1]. АКИ може бити узрокован трансплантацијом органа, постоперативном под перфузијом, крварењем, дехидрацијом, шоком и сепсом у клиничкој пракси [2]. Недавне епидемиолошке и експерименталне студије су показале да су тежина, учесталост и трајање АКИ уско повезани са накнадном инциденцомхронична болест бубрега(ЦКД). Фиброза бубрега након АКИ може довести до ЦКД или чакболест бубрега у завршној фази(ЕСКД) [3–5], што имплицира да су АКИ и ЦКД повезани синдроми [6]. Међутим, механизми који леже у основи преласка са АКИ на ЦКД остају непознати упркос бројним експерименталним и клиничким студијама. Животињски модели су важни алати за истраживање механизама помоћу којих АКИ доводи до ЦКД. Повреда исхемије и реперфузије бубрега (ИРИ) је један од главних узрока АКИ, а развијено је неколико животињских модела АКИ изазваног ИРИ [7], укључујући билатерални ИРИ (бИРИ) модел, једнострани ИРИ модел са интактним контралатералним бубрегом. , уИРИ модел са истовременом контралатералном нефректомијом и уИРИ модел са одложеном контралатералном нефректомијом.
Модел бИРИ је мање конзистентан јер када је исхемијска повреда оба бубрега сувише блага, нема значајних фиброзних промена на дужи рок. Када је АКИ преозбиљан, мишеви могу умријети у фази акутне повреде. Штавише, мале разлике у повреди два бубрега могу довести до значајних разлика у њиховој хроничној патологији бубрега након неколико недеља [8,9]. УИРИ модел са истовременом контралатералном нефротомијом је сличан моделу бИРИ јер остаје само повређени бубрег због нефректомије са друге стране [10]. У ИРИ моделу са интактним контралатералним бубрегом, фиброза исхемијског бубрега је тешка [11,12]. Овај модел је веома доследан и поуздан за дугорочно посматрање истраживача. Међутим, због присуства контралатералног неоштећеног бубрега, не може се користити за процену процењене брзине гломеруларне филтрације (еГФР), серумског креатинина (СЦр) и азота уреје у крви (БУН) [11–14]. У поређењу са два уИРИ модела поменута горе, уИРИ модел са одложеном контралатералном нефректомијом превазилази ове проблеме и може се користити и за дугорочна посматрања након АКИ и за праћење функције бубрега. Стога је овај модел погодан за проучавање АКИ-ЦКД транзиције [15].
КЛИКНИТЕ ОВДЕ ДА ДОБИЈЕТЕ ИЗВОД ЦИСТАНЦХЕ ЗААКУТНА ПОВРЕДА БУБРЕГА
Без обзира на то, различита исхемијска стања и интервал између контралатералне нефректомије и уИРИ могу имати значајан утицај на прогресију и тежину ЦКД након АКИ. Претходне студије су се фокусирале на ефекат трајања исхемије на фиброзу бубрега након АКИ и нису обраћале много пажње на температуру језгра тела током исхемије. На пример, Скрипник и др. [12] контролисао је температуру исхемије на 38 Ц помоћу система воденог купатила, са исхемијским трајањем од 30 мин, а контралатерални интактни бубрег је уклоњен 8 дана након уИРИ. Резултат је показао да је исхемијски бубрег имао значајне фиброзне промене 28 дана након уИРИ. Са истим исхемијским трајањем, Ксиао ет ал. [8] су показали да су се значајне фиброзне промене десиле 11 дана након уИРИ када је исхемијска температура контролисана на 37 Ц 38 Ц и временски интервал између уИРИ и контралатералне нефректомије био је 10 дана. Неки истраживачи, као што су Цоломбаро ет ал. [14] и Ли ет ал. [16] нису споменули исхемијску температуру у својим студијама.
У међувремену, мало људи је истраживало ефекат временског интервала између контралатералне нефректомије и уИРИ у овом моделу, што је резултирало веома различитим резултатима међу различитим лабораторијама, што је такође драматично утицало на накнадне експерименте. У овој студији смо истраживали ефекте главних фактора који утичу на фиброзу бубрега након АКИ, укључујући временски интервал између контралатералне нефректомије и уИРИ, температуру језгра тела током исхемије и трајање исхемије. Циљ нам је био да пружимо референцу за израду одговарајућег животињског модела за проучавање транзиције АКИ ЦКД
Материјали и методе Животињски модели
Мужјацима Ц57БЛ/6Ј мишева (8–10 недеља старости, тежине око 22 г; ГемПхарматецх Цо., Лтд., Нањинг, Кина) је обезбеђен бесплатан приступ храни и води у Центру за експерименте на животињама Медицинског универзитета Шанси. Услови узгоја су били следећи: влажност 40–70%, температура 23 Ц, класа чистоће ваздуха 7, контролисан циклус светлости/мрака 12-х у условима без патогена, зрачење хране Цо60 и пречишћена вода. Све процедуре за ову студију одобрио је Комитет за етику животиња Друге болнице Медицинског универзитета Шанси (етички број: ДВ2022028).
Протоколи
Узимајући у обзир да трајање исхемије, температуре језгра тела током исхемије и времена ресекције контралатералног неоштећеног бубрега могу имати утицаја на тежину АКИ-ја и каснију фиброзу бубрега, ми смо истраживали ефекте горња три фактора појединачно, док су остала два фиксна. Три експеримента су спроведена на следећи начин.
Протокол 1: Да би се посматрао ефекат интервала између контралатералне нефректомије и уИРИ на функцију бубрега и пост-АКИ фиброзу, исхемијско време левог бубрега је фиксирано на 24 минута, а основна телесна температура је фиксирана на 37 Ц током бубрега. исхемија у међувремену. Ресекција десног бубрега је спроведена 7., 10. и 14. дана (н=8 по групи) након ИРИ левог бубрега. Трајање исхемије и ресекције бубрега одредили смо на основу резултата претходних студија [8,10,12,15] и наших пре-експерименталних резултата. Погледајте слику 1 (А–Ц) за протокол студије.
Протокол 2: Да би се посматрао ефекат унутрашње телесне температуре током исхемије на АКИ-ЦКД транзицију, исхемијско време левог бубрега је фиксирано на 24 минута, а десни бубрег је уклоњен 14 дана након ИРИ левог бубрега. Температура језгра тела је контролисана на 36 Ц, 36,5 Ц, 37 Ц, 37,5 Ц и 38 Ц, респективно (н=8 по групи). Погледајте слику 1(Д) за протокол студије.
Протокол 3: Да би се посматрао ефекат трајања исхемије бубрега на прелазак са АКИ на ЦКД, основна телесна температура је фиксирана на 37 Ц током исхемије, а десни бубрег је уклоњен 14 дана након ИРИ левог бубрега. Изабрали смо ову временску тачку зато што је фиброза бубрега, која је била типична промена након АКИ у ЦКД, била веома очигледна према извештајима [8,10,12,15] и нашим пре-експерименталним резултатима. Време исхемије левог бубрега је контролисано на 21 мин, 24 мин, 27 мин и 30 мин, респективно (н=8 по групи). Видети слику 1(Е) за протокол студије.
Сви мишеви су еутаназирани 8 недеља након ИРИ левог бубрега. Део ткива левог бубрега је чуван на 70°Ц за накнадну РТ-ПЦР и Вестерн блот анализу, а други део је фиксиран у неутралном формалину за хистопатолошке анализе. Узорци крви су прикупљени преко ретро-орбиталног синуса за биохемијско тестирање.
Слика 1. Протоколи унилатералне исхемијско-реперфузијске повреде (уИРИ) са одложеном контралатералном нефректомијом. (А–Ц): Леви бубрег је подвргнут ИРИ дана 0, а ресекција десног бубрега је спроведена у различитим временским тачкама (дан 7, дан 10 и дан 14) са трајањем исхемије фиксиран на 24 мин са основном телесном температуром фиксираном на 37 Ц током исхемије бубрега. (Д): Леви бубрег је подвргнут ИРИ дана 0, а ресекција десног бубрега је спроведена под различитим температурама језгра тела (36 Ц, 36,5 Ц, 37 Ц, 37,5 Ц и 38 Ц) са исхемијом време левог бубрега фиксирано на 24 мин, а десни бубрег је уклоњен 14 дана након ИРИ левог бубрега. (Е): Леви бубрег је подвргнут ИРИ 0. дана, а ресекција десног бубрега је спроведена у различитим исхемијским трајањем (21 мин, 24 мин, 27 мин и 30 мин) са основном телесном температуром фиксираном на 37 Ц током бубрега исхемија, а десни бубрег је уклоњен 14 дана након ИРИ левог бубрега. Тежина бубрега, функција бубрега, хистолошка повреда бубрега и фиброза бубрега процењени су до 56. дана.
Хируршка процедура
Пре операције, сви мишеви су постили 12 х са слободним приступом води и интраперитонеално им је убризган 3% пентобарбитал натријум 50 мг/кг. Током анестезије, ректална температура је одржавана на 36 Ц, 36,5 Ц, 37 Ц, 37,5 Ц или 38 Ц, респективно, у различитим експерименталним групама. Да би се то постигло, миш је постављен леђима на подлогу за грејање (ЦВ{{10}}, БАРБАРОУС ГРОВТХ, Зхејианг, Кина) у положај са испруженом главом и вратом како би се осигурало да му дисајни пут остане неометано, а очи су прекривене топлом физиолошком газом како би се избегло сушење током поступка. Након анестезије, длака на левој страни миша је обријана машином за шишање. Кожа у хируршком подручју је затим обрисана тампоном са 75% алкохола. Генерално, телесна температура миша пада након бријања. Хируршки захват је спроведен када је температура тела постала константна, што је могло да траје око 15 мин. Леви бубрег се могао видети пресецањем леве леђне коже 0,5 цм поред средње линије и 0,5 цм на доњој ивици грудног коша миша. Затим смо једном руком стиснули леви стомак како бисмо леви бубрег извукли из телесне шупљине, подигли бубрег тупим закривљеним пинцетама (пазећи да не оштетимо бубрег), одвојили бубрежну педикулу и брзо је стегнули и поставили стезаљку. бубрег испод коже да би била топла и хидратизована. Успешну исхемију карактерисала је постепена промена боје бубрега од црвене до тамно љубичасте, која је трајала 21 мин, 24 мин, 27 мин и 30 мин, респективно, у различитим експерименталним групама. Боја бубрега се вратила у црвену у року од 2-5 минута након отпуштања стезаљке. Затим смо затворили трбушну дупљу слојевитим шавовима. Десна дорзална кожа и мишић су урезани 7, 10 и 14 дана након уИРИ, респективно, у различитим експерименталним групама, а десни бубрег је ресециран. Затим затворите рану стандардним шавовима. После сваке операције, 500 лЛ физиолошког раствора је убризгано интраперитонеално да би се надокнадио губитак течности током операције. Истовремено, миш је држан на јастучићу за грејање око 2-3 х док није дошао у потпуну свест пре него што је пребачен у кавез за становање. Лажна група није стезала бубрежну педикулу, а остале хируршке операције биле су исте као оне у уИРИ групи. Све хируршке операције радила је иста особа са више од 2 године искуства у раду овог модела.
Испитивање функције бубрега
Нивои СЦр су мерени помоћу комплета за креатинин (Јаффе Метход, 100020170, Биосино Биотецхнологи анд Сциенце). Нивои БУН су мерени помоћу уреа комплета (Метода уреаза-глутамат дехидрогеназе, Биосино Биотецхнологи анд Сциенце).
Тест тежине бубрега
Након мокрења, телесна тежина мишева је мерена прецизном електронском вагом. Свежи бубрези су три пута испрани у претходно охлађеном физиолошком раствору, а затим је вишак воде са бубрега уклоњен филтер папиром. Капсуле бубрега су ољуштене на леду и бубрези су одмах измерени. Однос тежине бубрега и телесне тежине израчунат је да би се проценила коригована тежина бубрега у мг/г.
Бојење хематоксилин-еозином (ХЕ) и оцена повреде бубрега
Неутрално формалином фиксирано бубрежно ткиво је рутински дехидрирано, уграђено у парафин, исечено (3 лм) и обојено ХЕ да би се посматрало оштећење ткива бубрега. Десет насумично одабраних поља кортекса бубрега сваке секције снимљено је светлосном микроскопијом при увећању од 400. Два патолога су посебно оценила повреду гломерула и бубрежних тубула. Повреда тубуле је оцењена на скали {{20}}}–4 коришћењем следећих критеријума [17]: 0, без повреде; 1, захвата 1-25% подручја бубрега; 2, захвата 26–50% подручја бубрега; 3, захвата 51–75% подручја бубрега; и 4, захватајући 75–100% подручја бубрега. Степен тубуларне повреде процењен је полуквантитативно израчунавањем површине тубуларне повреде бубрега. Повреда гломерула је процењена и оцењена на скали од 0–4 према процентуалној површини мезангијалне експанзије или склерозе применом следећих критеријума [17]: 0, нормални гломерули; 1, 1–25% површине повређених; 2, 26–50% површине повређено; 3, 51–75% површине повређено; и 4, 76–100% површине повређено. Коначни резултат оштећења гломерула ¼ 0 (% гломерула степена 0) þ 1 (% гломерула степена 1) þ 2 (% гломерула степена 2) þ 3 (% гломерула степена 3) þ 4 (% гломерула степена 4). Више од 50 гломерула је оцењено по мишу.
Массоново трихромно бојење
Неутрално формалином фиксирано бубрежно ткиво је рутински дехидрирано, уграђено у парафин, исечено (3 лм) и обојено Массоновим трихромом да би се посматрала фиброза бубрега. У Массоновим трихромом обојеним резовима, двадесет поља кортекса бубрега која се не преклапају су снимљена под увећањем од 200. Имаге-Про Плус софтвер за анализу слике коришћен је за аутоматско мерење и анализу. Проценат фиброзног подручја је коришћен за одређивање нивоа интерстицијалне фиброзе бубрега [8].
РТ-ПЦР
Укупна мРНА је екстрахована из ткива бубрега сваке групе помоћу Тризола и мерена је њена концентрација, а затим је конвертована у цДНК (Така Реверсе Транссцриптион Кит). Метода Такман флуоресценције (ТБ Греен Премик Ек Так ИИ РТ-ПЦР у реалном времену) је коришћена за квантификацију експресије РНК фибронектина (ФН) и колагена И (ЦОЛ-И) у ткивима бубрега. Специфични прајмери су коришћени за ФН (напред: 50 -ГГАГТГГЦАЦТГТЦААЦЦТЦ-30 и обрнуто: 50 -АЦТГГАТГГГГТГГГААТ-30), и ЦОЛ-И (напред: 50 -АЦАТГТТЦАГЦТТТГТГГАЦЦ{ {9}} и обрнуто: 50 -ТАГГЦЦАТТГТГТАТГЦАГЦ-30 ) [18] (обезбедио Сангон Биотецх Цо., Лтд., Шангај, Кина). Услови амплификације су следећи: 95 Ц за 30 с, 95 Ц за 5 с, 60 Ц за 30 с, 40 циклуса; 95 Ц за 10 с, 65 Ц за 5 с и 95 Ц/5 Ц. Након анализе криве амплификације и криве растворљивости производа, релативни нивои мРНА су одређени компаративном ЦТ методом (2-ДДЦт) са 18СрРНА (напред: 50 - ЦГГАЦАЦГГАЦАГ ГАТТГАЦАГ-30 и обрнуто: 50 -ААТЦГЦТЦЦАЦЦААЦТ ААГААЦГГ-30) као интерном референцом.
Вестерн блот
Радио-имуно-прецитатион-ассаи (РИПА) пуфер за лизу коришћен је за лизу ткива бубрега, а концентрација протеина је одређена БЦА методом. Градијентна гел електрофореза је коришћена да се одвоје протеини из 50 лг узорака. Затим су протеини пребачени на нитроцелулозну мембрану. Након блокирања са 5% немасног млека у трајању од 2 сата, мембране су блотиране преко ноћи на 4°Ц са зечјим антимишјим моноклоналним антителом против а-актина глатких мишића (а-СМА) (1:1000, бр.19245, технологија ћелијске сигнализације ), ФН (1:1000, бр.аб2413, АБЦам) или ЦОЛ-И (1:1000, бр.72026, технологија ћелијске сигнализације), респективно. Следећег дана, мембране су поново загрејане на собној температури 0,5 х. Након испирања са ТБСТ, мембране су инкубиране са ХРП коњугованим АффиниПуре козјим анти-зечјим ИгГ (Х þ Л) (1:1000, бр. БА1054, БОСТЕР биолошка технологија) током 2 х. Након што су поново испрани ТБСТ-ом, обојени су ултра-високо осетљивим ЕЦЛ хемилуминисценцијским реагенсом да би се визуелизовали имуноблотови. б-актин је мерен на истој мембрани као и интерна референца. Експресије протеина су одређене квантификацијом релативне експресије циљних протеина у односу на б-актин.
Подаци и статистичка анализа
Сви испитани подаци су изражени као средња вредност ± стандардна девијација. Поређењима између две групе приступио је независни т-тест. Поређењима између више група приступило се једносмерном АНОВА-ом када је дистрибуција података нормална, а варијанса хомогена, Велцх АНОВА је коришћена за процену статистичке значајности када је варијанса била хетерогена, након чега је уследио Тукијев пост хоц тест за вишеструка поређења. Све статистичке анализе су спроведене помоћу софтвера ГрапхПад Присм 8.0. п < 0.05 се сматрало статистички значајном.
Услуга подршке Вецистанцхе-а - највећи извозник цистанцхеа у Кини:
Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com
Вхатсапп/тел:+86 15292862950
Купите за више детаља о спецификацијама:
хттпс://ввв.кјцистанцхе.цом/цистанцхе-схоп
