Ефекти фенилетаноидних гликозида екстрахованих из херба циста на учење и памћење мишева са Алцхајмеровом болешћу

ali.ma@wecistanche.com

Јианхуа Ианг, 1 Бовеи Ју, 2,3 и Јунпинг Ху 2

Позадина.Да би се истражили ефектифенилетаноидгликозиди(ПхГс) екстраховани изХербаЦистанцхесна бихевиорални и когнитивни капацитет АПП/ПСИ трансгених мишева саАлцхајмерова болестболест(АД).

Методе.АД мишеви су насумично подељени у контролну групу, групу модела, донепезил групу, ПхГ групу и вербаскозну групу, респективно. Три недеље касније, животиње су биле подвргнуте процени понашања и когниције тестом гнежђења, Морисовим тестом воденог лавиринта и тестом спуштања.

Резултати.Капацитет спознаје у овим групама показао је значајно повећање у поређењу са оним у групи модела. Степ-довн тест је показао да су грешке изазване смањењем меморије у групама ПхГ и вербаскозној групи показале значајно смањење у поређењу са онима у групи модела (П <>

Закључци.ПхГс су ублажили карактеристике когнитивне дисфункције трансгеног гена АПП/ПСИ. Осим тога, ПхГ су биле активне компоненте за анти-АД активност Х. Цистанцхес.

Цистанцхе има анти-Алцхајмерова болестефекти.

1. Позадина

Алцхајмерова болест(АД) је дегенеративна болест централног нервног система (ЦНС) повезана са старењем коју карактерише прогресивна когнитивна дисфункција и оштећење памћења[1–3]. Са процесом старења и продужењем животног века широм света, преваленција АД је у растућем тренду, што резултира високим морбидитетом, дугим током болести и високим трошковима лечења. До данас, механизам АД још увек није добро дефинисан [4–7]. Због тога је хитно потребно истражити механизам АД и развити ефикасан метод за превенцију, контролу и лечење АД у складу с тим.

До данас, још увек не постоји ефикасан метод за превенцију и лечење АД, а већина средстава која се користе у клиничким условима користи се за симптоматско лечење. Одобрени агенси за АД од стране ФДА укључују инхибиторе холинестеразе (нпр. донепезил) и рецепторе ексцитаторних аминокиселина (нпр. мемантин) за које се сматра да ублажавају симптоме и побољшавају когнитивне/бихејвиоралне капацитете. Ипак, ефикасност није задовољавајућа због ограничених одговора на третман након примене [8–10]. Традиционална кинеска медицина, са дугом историјом, заснованом на хиљадама година искуства, показује опсежне изворе и неколико предности у поређењу са хемијским агенсима, укључујући вишеструке мете, одличну безбедност, неколико нуспојава и погодност за дуготрајну примену. Ови биљни лекови имају супериорност у односу на друге лекове у лечењу хроничних и рефракторних болести. Поред тога, забележена је велика потентност ових агенаса у лечењу АД [11–13]. Због тога су уложени све већи напори на развој нових агенаса за АД из биљних лекова заснованих на савременим техникама.

Кликните на Цистанцхе УК за Алцхајмерову болест

Херба Цистанцхес, позната као Роу Цонг-Ронг на кинеском, је угрожена дивља врста која је углавном распрострањена у сушним пределима и топлим пустињама северозападне Кине. Херба Цистанцхе се примењује као тоник и/или у формули за хроничне болести бубрега, импотенцију, и сенилни затвор са историјом од две хиљаде година. Хемијски састојци Херба Цистанцхе углавном се састоје од испарљивих уља, неиспарљивих фенилетаноидних гликозида (ПхГ), иридоида, лигнана, алдитола, олигосахарида и полисахарида. Постојао је све већи број студија које се фокусирају на антиагинг, посебно на животињским моделима који су успостављени коришћењем А 25-35, Д-галактозе, Ал2О3, хинолинске киселине и скополамина. Ове студије су показале да ПхГ могу допринети памћењу, смањењу оксидативног стреса у можданим ткивима, инхибицији апоптозе нервних ћелија и смањењу ацетилхолин естеразе[14–16].

У древним рецептима, Х. Цистанцхе је често за неговање бубрега и инхибицију процеса старења. У савремено доба, биљка је потврђена као ефикасна за лечење одређених болести са задовољавајућом безбедношћу. Осим тога, коришћен је код појединаца који живе у континенталној Кини[17]. ЦФСА је 2016. године одобрила безбедност извора хране Х. Цистанцхеин, а затим је 2018. године Национална здравствена комисија НР Кине објавила да може послужити као извор хране и кандидат за истраживање и развој нових лекова [18, 19 ]. Према нашим најбољим сазнањима, активне компоненте Х. Цистанцхеа су ПхГ, међу којима су ехинакозид и вербаскоза, који служе као најрепрезентативније компоненте, наведени као индекс квалитета за Х. Цистанцхе од стране Кинеске фармакопеје. На пример, ПхГ Х. Цис-танцхе могу послужити као адитив за храну након пречишћавања.

Наше претходне студије су показале да је ПхГ екстрахован из Х. Цистанцхе далеко више од 80 процената [11]. Осим тога, ПхГ мономер и вербаскоза су били високог садржаја и служили су као главне активне компоненте. Опсежне студије су показале да су укупни ПхГс и ПхГ мономер (нпр. вер-баскоза и ехинакозид) показали значајну анти-АД ефикасност. На пример, студије на животињама су показале да укупни ПхГ, вербаскоза и ехинакозид могу значајно допринети повећању капацитета за учење/памћење и когнитивног понашања, смањити оксидативни стрес у можданим ткивима, инхибирати апоптозу нервних ћелија и смањити генерисање А у мозгу. и активност ацетилхолин естеразе [20–25]. Ин витро експерименти су открили да ПхГ може да делује на АД ћелијски модел, да смањи оксидативни стрес, да уклони слободне радикале, да инхибира агрегацију амилоида и да смањи губитак неурона и апоптозу нервних ћелија [20, 25, 26]. Штавише, ПхГ би могли да ослабе когнитивну дисфункцију и стварање А 1-40 и А 1-42 у хипокампусу код АППсве/ПСИдЕ9 трансгених мишева. Може да регулише узводне и низводне мете инсулинског сигналног пута, што је затим побољшало пренос сигнала инсулина и регулисало енергетски метаболизам мозга, као и накнадни капацитет против АД [27].

Животињски модели су кључни за истраживања везана за болести и развој фармације. АД модел заснован на трансгеним животињама сматра се једним од најважнијих напретка јер је модел трансгених животиња АД могао да опонаша АД на молекуларном нивоу, што је представљало типичне симптоме и знаке. Осим тога, овај модел је супериорнији од осталих модела везаних за АД у стабилности и поузданости. До сада није спроведен ниједан трансгени АД модел да би се истражили ефекти ПхГ мономера на патогенезу АД. У овој студији, успостављен је АПП/ПСИ АД модел мишева, након чега је уследило одређивање анти-АД активности ПхГ мономера названог вербаскоза проценом теста гнежђења, Морисовог теста воденог лавиринта и теста снижења.

2. Методе

2.1. Агент.

ПхГ-ови Х. Цистанцхеа су припремљени према нашем конвенционалном опису [20]. Квалитет утврђен УВ методом био је до 87,6 одсто. Садржај ехинакозида и вербаскозе одређен ХПЛЦ био је 37,8 процената и 17,7 процената, респективно. Графичка формула за ПхГс, вербаскозу и ехинакозид приказана је на слици 1. Стабљике Ц. тубулоса (Сцхренк) Вигхт су сакупљене у октобру 2016. из Синђијанга, Кина. Биљку је идентификовао др. Јунпинг Ху. Сви ови узорци ваучера (бр. 201610) су депоновани у Хербаријум биљака, Фармацеутски факултет, Медицински универзитет у Синђангу, Синђанг, Кина.

екстракт цистанцхе

2.2. Животиње.

Десет мушких АПП/ПСИ трансгених мишева (3 месеца) и двадесет женки мишева (мужјаци: 10; женке: 10, 20-30 г) купљено је од Центра за истраживање модела животиња Универзитета Нањинг (СЦКСК 2015-0001, Нањинг, Кина). Животиње су храњене у посебним коморама без патогена (СПФ) у Центру за животиње Медицинског универзитета Ксињианг (СЦКСК 2011-0001, Ксињианг, Кина) на исхрани СПФ. Све животиње имају слободан приступ на храну и стерилисану воду. Протоколе студије је одобрио Етички комитет Медицинског универзитета Синђианг.

2.3. Пролиферација и идентификација АПП/ПСИ трансгених мишева.

Новорођени трансгени мишеви ({{0}} недеља) подвргнути су сечењу репа дужине 0,5 цм ради екстракције ДНК. Реп је стављен у Епендорфову епрувету, након чега је додавана пролеаза К до концентрације од 400 уг/ мл. Након тога, смеша је вортексана на 55 степени преко ноћи, а затим центрифугирана на 13,000 рпм током 10 минута на 4 степена да би се добио супернатант. Екстракција ДНК је изведена коришћењем комерцијалног комплета према упутствима произвођача (Киаген, Немачка).

За амплификацију ДНК, дизајнирани су специфични прајмери ​​за АПП иПСИ као што је поменуто у Табели 1. Амплификација је спроведена у укупној запремини од 20ул користећи следеће услове: 94 степена преданатурације током 5 минута, након чега следи 35 циклуса денатурације на 94 степена током 30 секунди ,65 степени за 35 секунди, и 72 степена за 45 секунди, као и 72 степена за 3 мин. Произведени ДНК производи су подвргнути агаросегел електрофорези при константном напону од 100В током 30 мин. Коначно, слике су визуелизоване коришћењем Цхеми-Доц МП система.

2.4. Груписање.

Користећи рандомизацију коју генерише софтвер СПСС18.0, АД мишеви су насумично подељени у (и) контролну групу (н=10, Ц57БЛ/6Ј мишеви); (ии) група модела (н=10); (иии) донепезил група (н=10, 0.65 мг/кг, интрагастрична примена); (ив) ПхГ групе које су подвргнуте ПхГ виалаваге са концентрацијом од 250 мг/кг (н=10), 125 мг/кг (н=10) и 62,5 мг/кг (н {{16} }); и (в) вербаскозна група (н=10, 125 мг/кг, интрагастрична примена). Животиње које су коришћене у групама (ии)-(в) биле су АППсве/ПСИдЕ9 трансгени мишеви. Испирање је обављено у доби од 6 месеци и трајало је 3 месеца са учесталошћу једном дневно. Животиње у контролној и моделној групи биле су подвргнуте ињекцији двоструко дестиловане воде интрагастрично.

2.5. Нестинг Тест.

Животиње су храњене одвојено најмање 24 х пре теста у стандардном кавезу (28 × 12 × 16 цм), напуњеном стерилизованим дрвеним струготинама дебљине 1 цм. У почетку, време кашњења је праћено на почетку теста, и добијено је укупно време од 120. Нестингсцоре је израчунат као што је претходно описано [28].

2.6. Тест Моррисовог воденог лавиринта.

Апарат се састојао од кружног базена испуњеног водом (23 ± 2 степена Ц и дубине 40 цм) који се налазио у просторији за тестирање са белим зидовима и неколико знакова на њима. Платформа (10 цм у пречнику) је уроњена 1 цм испод површине воде у једном од четири идентична квадранта. Локација платформе је фиксирана током покушаја аквизиције, током којих су мишеви појединачно стављени у воду окренуту према зиду базена како би се негирао било какав утицај правца. Дана 1. и 2. спроведен је пробни тест стицања, укључујући 4 сесије дневно током 6 узастопних дана. За сваку сесију, мишевима је дозвољено да побегну пливањем до невидљиве платформе, а латенција бекства (тј. време потребно за лоцирање и пењање на платформу) и брзина пливања су забележени са временским прекидом од 60 с. Мишеви који не успеју да пронађу платформу у року од 60 секунди, вођени су до платформе ручно и дозвољено им је да остану на њој 10 секунди. 11. дана, тест стицања теста је поново изведен последњих 6 узастопних дана након свих третмана лековима.

2.7. Степ-Довн Тест.

Отприлике 24 х након последњег лека, животиње су морале да буду у објекту за смањење и адаптивном окружењу 3 минута. Време је подешено на 5 мин, а напон је био 32 В. Након стимулације, мишеви су покушали да скоче на платформу, а затим су били темпирани у присуству промена сигнала инфрацрвеног детектора. Време кашњења је по први пут забележено као време од платформе до дна слота. У случајевима не скакања са платформе, време кашњења је забележено као 5 мин. Затим је забележена укупна фреквенција стимулације након фазе латенције. Тест је завршен за 2 дана. Учење и памћење су примећени првог и другог дана. Фаза кашњења и учесталост грешке су забележени за сваки миш.

2.8. Статистичка анализа.

За статистичку анализу је коришћен софтвер СПСС 18.0. Подаци су представљени као средња вредност ± стандардна девијација. За међугрупно поређење урађен је Студентов т-тест. П < 0:05="" се="" сматрало="" статистички="">

3. Резултати

3.1. Идентификација генотипа.

С обзиром на чињеницу да је геномеДНК служио као шаблон за амплификацију, у Ф1 генерацији су добијена два појаса дужине 344 кб и 608 кб. Ово је било у складу са дужином АПП гена и ПСИ гена (Слика 2).

3.2. Нестинг Сцоре.

Пет разреда је подељено у нестингсцоре (слика 3). У контролној групи, понашање гнежђења је примећено у року од неколико минута након стављања папира у кавез. У групи модела, истраживање мишева је било релативно смањено, а неке животиње могу чак имати и понашање повезано са анксиозношћу, као што је дотеривање и прање лица, што је изазвало кашњење у понашању гнежђења. Већина ових животиња је имала оцену од 1 или 2. Ипак, примећено је значајно повећање резултата гнежђења, који је представљен на начин који зависи од времена након третмана ПхГ (Слика 4).

3.3. Ефекти ПхГ на навигацију трансгених АД мишева у фази кашњења.

Са продужењем времена вежбања, време кашњења у свакој групи показало је значајно смањење. Прва 2 дана служила су као време за вежбу. Трећег дана, време кашњења у групи модела показало је значајно продужење у поређењу са оним у нормалној контроли (П < 0:01).="" слично,="" 4.="" и="" 5.="" дана,="" време="" кашњења="" у="" групи="" модела="" показало="" је="" значајно="" продужење="" у="" поређењу="" са="" оним="" у="" нормалној="" контроли="" (п="">< 0:0}5).="" трећег="" дана,="" време="" латенције="" у="" групама="" које="" су="" узимале="" донепезил="" показало="" је="" значајно="" смањење="" у="" поређењу="" са="" оним="" у="" групи="" модела="" (п=""><0:05). време="" латенције="" у="" групама="" пхг="" показало="" је="" значајно="" смањење="" у="" зависности="" од="" дозе="" у="" поређењу="" са="" оним="" у="" групи="" модела="" (п=""><0:05, табела="">

3.4. ПхГс су значајно ослабили трагове пливања трансгених АД мишева.

У групи модела, трагови пливања мишева били су на типичан начин маргиналног претраживања. У групама ПхГ и вербаскозној групи, траг пливања је био линеарног типа или типа тенденције. Ово указује да ПхГ може значајно да побољша специјалну меморију АПП/ПСИ трансгених АД мишева (Слика 5).

3.5. Ефекти ПхГ на специјално истраживање АД мишева.

Платформа је преузета 6. дана теста воденог лавиринта да би се истражио специјални капацитет истраживања. Учесталост проласка кроз платформу је забележена у року од 60 сек. Наши подаци су показали да је примећено значајно смањење учесталости проласка кроз платформу у групи модела, у поређењу са нормалном контролом (П < 0="" :01).="" у="" поређењу="" са="" моделном="" групом,="" примећено="" је="" значајно="" повећање="" учесталости="" проласка="" кроз="" платформу="" у="" пхг="" групама="" и="" вербаскозној="" групи="" (п="">< 0:05,="" табела="">

Како је платформа постављена на трећи квадрант, пропала је као циљни квадрант. Дуже задржавање у квадранту имплицирало је значајно побољшање у учењу и памћењу мишева након примене агенаса. Наши подаци су показали да је дошло до значајног смањења задржавања у објективном квадранту у групи модела у поређењу са нормалном контролом (П < {{{="" {2}}}}:01).="" у="" поређењу="" са="" моделном="" групом,="" примећено="" је="" значајно="" повећање="" ретенције="" у="" пхг="" групама,="" донепезил="" групи="" и="" вербаскозној="" групи="" (п=""><0:05, табела="">

3.6. Ефекти ПхГс на Степ-Довн тест код трансгених АДМице.

Време кашњења у групи модела било је знатно краће него у контролној групи (П < {{0}}:01).="" поред="" тога,="" донепезил="" би="" могао="" да="" изазове="" значајно="" повећање="" времена="" латенције="" (п=""><0:01). слично,="" пхг="" групе="" и="" вербаскозна="" група="" су="" такође="" показале="" значајно="" дуже="" време="" кашњења="" (п=""><0:01). штавише,="" пхг="" групе="" и="" вербаскозне="" групе="" показале="" су="" значајно="" смањење="" учесталости="" грешака="" у="" тесту="" снижавања="" изазваног="" памћењем="" и="" оштећењем="" учења=""><0:01). these="" indicated="" that="" phgs="" contributed="" to="" the="" improvement="" of="" memory="" and="" learning="" capacity="" of="" transgenic="" ad="" mice="" (table="">

4. Дискусија

АД је дегенеративна болест нервног система која се често јавља у старијој популацији. Нажалост, тачан механизам још увек није добро дефинисан, што у извесној мери ограничава скрининг лекова. До данас су спроведене опсежне студије о развоју лекова у погледу истраживања на животињама, а доступно је и неколико животињских модела АД, укључујући моделе засноване на А 25-35, Д-галактози, Ал2О3, хинолинској киселини и скополамину. Ови модели покрећу когнитивну дисфункцију, али представљају недостатке укључујући касни почетак болести, велике индивидуалне разлике и дуже трајање експеримента које ометају опонашање прогресивних и дегенеративних лезија [29–31]. Са напретком трансгене технике у успостављању животињских модела АД [27, 32, 33], направљени су велики кораци у разумевању патогенезе АД заједно са развојем нових лекова. Ипак, патогенеза АД је прилично сложена и само идентификовано је неколико мета гена одговорних за почетак АД [34–36]. На основу тога, трансгени АД модел заслужује даљу примену у развоју лекова. Идентификација генских места повезаних са АД на основу трансгеног АД модела коришћењем технике укрштања ће допринети лечењу АД у клиничким окружењима и успостављању нових АД модела који укључују више вируленцегена.

У овој студији, одабрани модел АППсве/ПСИдЕ9 значајно је допринео метаболизму АПП, развоју и патогенези АД, као и прогресији болести. За пролиферацију и идентификацију трансгених мишева, екстраховали смо ДНК из узорака крви и ткива, респективно. За узимање узорака крви, да би се обезбедио преживљавање животиња, узорак је узет са репа, што је било тешко извести са мањом запремином узорка. Осим тога, може изазвати повреду животиња и утицати на каснију анализу. Насупрот томе, екстракција ДНК из ткива се обично обављала у недељама 6-8, што је било лако извести и мање је нанело повреду расту животиња. Штавише, није било статистичких разлика у садржају ДНК и чистоћи између ове две методе. Стога је ДНК екстрахован из ткива за идентификацију генома трансгених мишева.

Типичне клиничке манифестације АД су прогресивно смањење учења и памћења. Стога је посматрање учења и памћења кључно за процену ефикасности лека. У овој студији, тест гнежђења је коришћен заједно са Моррисовим тестом воденог лавиринта и тестом степ-довн да би се истражили ефекти ПхГ на памћење и учење АПП/ПСИ трансгених мишева. У тесту навигације, време кашњења у групи модела је показало значајно повећање у поређењу са оним у нормалној контроли (П < 0:05).="" у="" међувремену,="" примећено="" је="" значајно="" смањење="" времена="" кашњења="" у="" групи="" са="" донепезилом="" у="" поређењу="" са="" групом="" модела="" (п="">< 0:05).="" у="" поређењу="" са="" моделном="" групом,="" време="" латенције="" у="" групама="" пхг="" је="" показало="" значајно="" смањење="" у="" зависности="" од="" дозе="" (п="">< {{10}}:05).="" у="" специјалном="" истраживању="" уочено="" је="" значајно="" смањење="" учесталости="" проласка="" кроз="" платформу="" у="" групи="" модела="" у="" поређењу="" са="" нормалном="" контролом="" (п="">< 0:01).="" у="" поређењу="" са="" моделном="" групом,="" учесталост="" проласка="" кроз="" платформу="" у="" групи="" пхг="" група="" и="" донепезила="" показала="" је="" значајно="" повећање="" (п="">< 0:05).="" у="" степ-довн="" тесту,="" учесталост="" искакања="" грешака="" изазваних="" памћењем="" и="" оштећењем="" учења="" је="" значајно="" смањена="" након="" примене="" пхгс="" (п="">< 0:01).="" тест="" понашања="" је="" открио="" да="" интерференција="" пхг="" може="" значајно="" побољшати="" памћење="" и="" учење="" апп/пси="" трансгених="" ад="">

Традиционална биљна медицина, са дугом историјом, често се користи у лечењу хроничних болести и рефракторних поремећаја. Тренутно је развој нових лекова на бази АД заснованих на биљној медицини у великој мери фокусиран на екстракцију активних компоненти и/или припрему једињења. У поређењу са активном компонентом за екстракцију, ова мономерна компонента показује различите предности као што је коришћење ниске концентрације, лако истраживање циљних места и бољи правац ефикасности. Вербаскоза је репрезентативан мономер ПхГс јер показује висок садржај и активност. У овој студији, група са вербаскозом показала је бољи анти-АД капацитет у поређењу са групама ПхГ. Ово подржава истраживање и развој анти-АД агенаса заснованих на вербаскози. Х. Цистанцхес показују дугу историју у коришћењу хране, која датира још од династије Хан. Модерне технике потврђују да су Х. Цистанцхес безбедни као храна. У овој студији смо одобрили потенцију Х. Цистанцхеса у области функционалне хране, развоја лекова и здравствене заштите, посебно код старије популације и особа које су уморне.

Цистанцхе отвара пут развоју нових лекова за лечење АД.

За више информација кликните на слику.

Животињски модел је кључан за истраживачке студије о болестима и развоју лекова. Недавно је коришћена трансгена техника за успостављање АД модела, који може опонашати патогенезу АД на молекуларним нивоима, заједно са типичним симптомима и виталним знацима. Ови модели су се показали ефикасним у стабилности и поузданости у поређењу са другим АД моделима. У овој студији је коришћен модел АПП/ПСИ трансгених мишева који је добро познат по опонашању патолошких процеса АД, који је представио карактеристике дисфункције понашања, когнитивног поремећаја, сенилних плакова, неурофибриларних заплета и неуронске смрти [37–39]. У овој студији, прво смо користили трансгене АД мишеве да бисмо истражили ефекте ПхГ на учење и памћење, што може пружити корисне информације за истраживање и развој анти-АД агенаса на бази ПхГ.

Укратко, ПхГ би могли да ублаже карактеристике когнитивне дисфункције АПП/ПСИ трансгеног гена. Наша студија је потврдила да су ПхГ активне компоненте за анти-АД активност Х. Цистанцхеса. То може отворити пут развоју нових лекова за лечење АД.