Егзогени азотни оксид стимулише рани излазак Спорозоита Еимериа Тенелла из примарних бубрежних ћелија пилића ин витро

За више информација. контактtina.xiang@wecistanche.com

Апстрактан-Егресс игра виталну улогу у животном циклусу паразита апикомплекса укључујући Еимериа тенелла, која привлачи пажњу различитих истраживачких група. Многа недавна истраживања су се фокусирала на рани излазак изазван имунолошким молекулима како би се развила нова метода елиминације паразита апикомплексана. У овој студији смо истражили да ли азотни оксид (НО), имуни молекул који производе различите врсте ћелија као одговор на стимулацију цитокина, може индуковати рани излазак америчких спорозоита ин витро. Спорозоити Еимериа тенелла су екстраховани и култивисани у примарним ћелијама бубрега пилића. Број спорозоита који су изашли из инфицираних ћелија анализиран је проточном цитометријом након третмана са НО ослобођеним натријум нитроферицијанидом (ИИ) дихидратом. Резултати су показали да егзогени НО стимулише брзи излазак спорозоита Е.тенелла из примарних ћелија бубрега пилића пре репликације паразита. Такође смо открили да је излазак зависио од нивоа интрапаразитских калцијумових јона (Ца2) и да није дошло до оштећења ћелија домаћина након изласка. Вируленца избачених спорозоита била је значајно нижа од оне код свежих спорозоита. Резултати ове студије доприносе новом пољу испитивање интеракције између паразита апикомплексана и њихових ћелија домаћина, као и клиренса интрацелуларних патогена од стране домаћинаИмуни систем.

Кључне речи: Егресс, Еимериа тенелла спорозоитес, Азот оксид.

Цистанцхе тубулосаје богатаехинакозидивербаскозид, па добро утиче на побољшање имунитета. Цистанцхе тубулоса је вредан лековити материјал који може да узбуђује хипофизу и кору надбубрежне жлезде или има хормонски ефекат сличан кортексу надбубрежне жлезде и регулише имунолошку функцију организма. Показано је да полисахариди Цистанцхе тубулоса могу побољшати имунолошку функцију организма; ефекат јачања имунитетаполисахаридакомпоненте могу играти главну улогу у јачању и тоничком ефекту Цистанцхе тубулоса. Вербасин, један од активних састојака Цистанцхе тубулоса, доказали су стручњаци и да позитивно утиче на регулацију имунитета. Према постојећим истраживачким подацима у академској заједници, може се сматрати да имуномодулаторна и лаксативна функција традиционалне кинеске медицине Цистанцхе има велики клинички значај за јачање имунитета организма и опоравак пацијената са ЦОВИД-19.

Кликните да научите Цистанцхе ноотропике

Увод

Чланови типа Апицомплекан су обавезни интрацелуларни патогени и укључују Токопласма Гонди, Пласмодиум спп., и Цриптоспоридиум спп., који инфицирају многе домаћине кичмењака, укључујући људе, изазивајући тешку болест [9,25,33]. Паразити апикомплекса пролазе кроз сложене процесе у својим асексуалним стадијумима укључујући инвазију, репликацију и излазак [28]. Међу овим процесима, излазак је витални корак који омогућава паразитима да нападну другу ћелију домаћина ради даљег развоја [14]. Излазак обично доводи до лизе ћелија домаћина, што доводи до штетних последица [5, 6]. Како је процес кључан и за патогене овог типа и за домаћине, многа истраживања су спроведена у овој области [29, 30]. Међутим, већина ових извештаја је ограничена на Пласмодиум спп. и Токопласма Гонди [6]. Еимериа спп. је још један важан род паразита апикомплексана који изазива озбиљне негативне утицаје на живинарску индустрију широм света, али се мало зна о процесу изласка овог рода [11].

Еимериа спп. може довести до тешких цревних болести код пилића, узрокујући глобалне губитке у живинарској индустрији од око 3 милијарде УСД годишње [16, 31]. Разумевање односа између Еимериа спп. а њихов домаћин је од великог интересовања за сузбијање кокцидиозе. Наша претходна студија је открила да је излучивање јона калцијума (Ца2т) и протеина микронема 2 (ЕтМиц 2) пресудно за излазак еимеријских паразита [35, 36].

Многа недавна истраживања су се фокусирала на индуцибилни излазак стимулисан имуним молекулима како би се развиле стратегије за лечење паразита апикомплексана [12,27,37]. На пример, ћелијска смрт изазвана интерфероном-и доводи до раног изласка Т. Гонди тахизоита, што може пореметити животни циклус ћелија домаћина и подстаћи елиминацију овог патогена [26]. Недавно смо известили да азот оксид (НО) може да стимулише брзи излазак Т. гондии тахизоита из инфицираних макрофага (имуних ћелија) и ћелија фибробласта препуцијума (неимуне ћелије)[19,34].

НО производе многе врсте ћелија, као што су дендритичне, мастне, природне ћелије убице и фагоцитне ћелије, као одговор на стимулацију цитокина и игра важну улогу у имунолошки посредованој заштити од многих врста патогена ин витро и на животињским моделима, укључујући протозое[10 ,17]. Током инфекције протозоама као што је Пласмодиум спп. и Токопласма Гонди повећана производња НО посредује у заштити домаћина или директно убија паразите или ограничава раст паразита [8]. Претходне студије су пријавиле већу производњу НО током примарне инфекције Е. тенелла, тако да НО делује као антикокцидијални ефектор [1]. Стога смо покушали да откријемо да ли НО може да стимулише рани излазак спорозоита Е. тенелла из ћелија домаћина ин витро да бисмо пружили више информација за проучавање Еимериа спп. егресс и представио нове увиде у клиренс интрацелуларних патогена од стране домаћина.

материјали и методе

Паразити, пилићи и ћелијска култура

Сој Е. тенелла М2е, трансгени сој који стабилно експримира појачани жути флуоресцентни протеин (ЕИФП)[21] коришћен у овој студији, одржаван је размножавањем у бројлерима Арбер Ацрес без кокцидијана који су купљени од Беијинг Арбор Ацрес Поултри Бреединг Цо. , Лтд.; Пекинг, Кина. Све птице су биле смештене у изолаторима како би се избегла контаминација другим врстама Еимериа спп. Изолација, пречишћавање и спорулација ооциста спроведени су према утврђеним протоколима [22]. Сви експерименти на животињама су спроведени у складу са етичким процедурама на животињама које је одобрила Лабораторија за добробит животиња и етичку инспекцију Кинеског пољопривредног универзитета (одобрење бр.20160921-2). Пречишћавање спорозоита је спроведено као што је претходно описано [35]. Свеже пречишћени спорозоити су суспендовани физиолошким раствором пуферованим фосфатом (ПБС) и број паразита је пребројан помоћу плоче за бројање крвних зрнаца. Примарне ћелије пилећег бубрега (ПЦК) су припремљене као што је претходно описано [12] и засејане у 24-плоче за културу са додатком Дулбеццо-овог модификованог Еагле медијума (ДМЕМ) који садржи фетални говеђи серум (10 процената, в/в), пеницилин( 200 У/мЛ) и стрептомицин (100 уг/мЛ). Густина ћелија је подешена на 1×10 степени ћелија/бунарићу.

Мерење концентрације НО

Концентрација НО који ослобађа СНП је процењена мерењем НО,/НО; однос Грисовом реакцијом коришћењем комплета за испитивање НО (Апплиген Тецх Инц., Пекинг, Кина), према упутствима произвођача.

НО-индуковани излазни тест

ПЦК-ови су култивисани на 41 степен и 5 процената ЦО, преко ноћи, након чега су уследила три испирања са ПБС-ом да би се уклониле ћелије које нису адхерентне. После 2 дана, ПЦК-ови су инкубирани са ЕтМ2е спорозоитима при многострукој инфекцији (МОИоф 2.0(однос паразит/ћелија 2:1) на 37 степени током 12 х. Неинвазивни спорозоити су уклоњени испирањем са ПБС. Ћелије су затим инкубиране или са различитим концентрацијама (10,20 и 40 мМ) натријум нитрофер-рицијанида (И) дихидрата (СНП; Сигма) или само са ДМЕМ носачем за различита времена третмана (10, 20 и 30). мин). После третмана, паразити који су изашли су суспендовани у 500 μЛ ДМЕМ, а суспензије од 10 уЛ су анализиране проточном цитометријом (Ц6, Аццури Цитометерс, Инц. Анн Арбор, МИ, Сједињене Државе).

Видео микроскопија

ПЦК су третирани са 40 мМ СНП после 12 х инкубације са ЕтМ2е спорозоитима при МОИ од 2,0. Прогресија изласка је забележена коришћењем светлосног микроскопа (Царл Зеисс, Олимпус).

Детекција утицаја на стадијум развоја паразита

Пре третмана са 40 мМ СНП током 30 минута, спорозоитима је дозвољено да се развију у ПЦК током 24 или 36 х, што је фаза трофозоита овог паразита. Након третмана, паразити који су изашли су суспендовани у 500 уЛ ДМЕМ, а суспензије од 10 μЛ су анализиране проточном цитометријом.

Одређивање виталности ћелије домаћина

ПЦК-ови су испрани након НО-индукованог изласка, инвазије спорозоита, третмана СНП-ом, и у нетретираној групи, респективно, а виталност ћелија је мерена коришћењем пропидијум јодида (ПИ; еБиосциенце). Укратко, ПЦК-ови у свакој групи су испрани ПБС-ом и нежно трипсинизовани након третмана, а појединачне ћелије су обојене ПИ, према упутствима произвођача. Проценат живих ћелија је анализиран проточном цитометријом.

Тест инхибиције

За тестове инхибиције, интра Ца2 плус хелатор БАПТА-АМ (Сигма, Ст. Лоуис, МО, Сједињене Државе) и фосфоинозитид специфичан инхибитор фосфолипазе Ц У-73122(Сигма) су коришћени да се процени ефекат Ца2 плус на спорозоит излаз. У другом експерименту, цитохалазин Д (ЦиоД; МерцкДармстадт. Немачка) је коришћен да блокира покретљивост паразита. Инфицирани ПЦК су претходно третирани са 10 μМ БАПТА-АМ. У-73122.или ЦитоД припремљен у диметил сулфоксиду (Сигма) током 30 мин. Затим су ћелијске културе инкубиране са 40 мМ СНП током 30 мин. а број избачених спорозоита је процењен као што је горе описано.

Вирулентност егресираних паразита

ПЦК су инкубирани са спорозоитима током 12 х, након чега је уследио третман са 40 мМ СНП током 30 минута. Медијум ћелијске културе који садржи слободне паразите након третмана СНП је сакупљен и испран три пута са ПБС. а одрживост паразита је тестирана коришћењем 4 процента искључења трипан плаве боје. Паразити који су изашли избројани су помоћу плоча за бројање крвних зрнаца. Да би се открила вируленција, тестиране су ре-инвазионе и репродуктивне способности паразита који су изашли након третмана са 40 мМ НО током 30 минута. ПЦК су инкубиране са паразитима који су изашли на

Вирулентност егресираних паразита

ПЦК су инкубирани са спорозоитима током 12 х, након чега је уследио третман са 40 мМ СНП током 30 минута. Медијум ћелијске културе који садржи слободне паразите након третмана СНП је сакупљен и испран три пута са ПБС. а одрживост паразита је тестирана коришћењем 4 процента искључења трипан плаве боје. Паразити који су изашли избројани су помоћу плоча за бројање крвних зрнаца. Да би се открила вируленција, тестиране су ре-инвазионе и репродуктивне способности паразита који су изашли након третмана са 40 мМ НО током 30 минута. ПЦК-ови су инкубирани са паразитима који су изашли и коришћени су као контрола. Да би се проценила репродуктивна способност домаћина, 2 × 10" свеже припремљених спорозоита и једнака количина паразита који су изашли инокулисани су у 3-недељне АА пилиће бројлера кроз клоакалну руту и ​​све птице су смештене у изолаторе [13 ]. Укупан излаз ооциста по птици је мерен коришћењем МцМастер коморе за бројање јаја на 6-9 дана након инфекције [15].

статистичке анализе

Софтвер СПСС 20.0 (СПСС Инц.) је коришћен за анализу разлика између третиране и контролне групе. Све остале статистичке анализе су обављене коришћењем софтвера ГрапхПад Присма 5.01 (Грапхпад Софтваре). Подаци су изражени као средња вредност ± стандардна грешка средње вредности (СЕМ). Експерименталне групе су упоређене коришћењем једносмерне анализе варијансе (АНОВА).

Статистичка значајност је процењена на нивоима п < 0.05 (значајан) и п<0.01 (highly="">

Резултати

Егзогени НО је стимулисао излазак спорОзоита Е. тенелла

Пре спровођења тестова излаза, проверили смо да ли се концентрација НО ослобођеног из СНП може одржати стабилном када се раствори у ДМЕМ у року од 30 минута Грисовом реакцијом (слика 1А). Затим смо инкубирали културе ћелија инфициране спорозоитом са различитим концентрацијама СНП током различитог трајања, као што је горе описано. Број слободних спорозоита се повећао када су инфицирани ПЦК инкубирани са СНП (слика 1Б). Такође смо посматрали процес изласка паразита путем видео снимања (слика 1Ц).

Утицај фазе развоја паразита на НО-стимулисан излаз

Занимало нас је да ли на излазак изазван НО може утицати развојни стадијум овог паразита у ПЦК. Пре третмана са 40 мМ СНП током 30 минута, дозволили смо да се спорозоити развију у ћелијама домаћина 24 или 36 х, што је фаза трофозоита овог паразитног места. Изненађујуће смо открили да је број паразита који су изашли значајно смањен са продужењем времена развоја паразита (слика 2), што указује да је развојна фаза паразита важан елемент изласка изазваног НО.

Излазак паразита зависи од паразитског Ца2 плус и мобилности

Претходна студија је показала да је интрапаразитски Ца2 играо виталну улогу током изласка спорозоита Е. тенелла [12, 34]. Извели смо експерименте да бисмо утврдили значај Ца2т у НО-индукованом изласку паразита. Као што је приказано на сликама 3А и 3Б, излазак изазван НО је блокиран претходним третманом са БАПТА-АМ и У-73122, што указује на виталну улогу интрапаразитског Ца2 плус и да је извор Ца2 плус у

ендоплазматски ретикулум (ЕР). Штавише, претходни третман са Цито-Д за блокирање мобилности паразита показао је сличне резултате (слике 4А и 4Б), што указује да је мобилност паразита још један важан фактор за излазак спорозоита.

Излазак паразита није повезан са оштећењем ћелије домаћина

Да би се истражила могућност да је НО-индукован излаз био токсичан за ћелије домаћина, виталност ћелије је мерена ПИ бојењем. Резултати су показали да се проценат ПИ ћелија повећао након третмана са СНП и да није било разлике између неинфицираних и инфицираних група, што указује да је инкубација СНП довела до оштећења ћелија, али не и до изласка паразита (Слике 5А и 5Б).

Вируленција паразита је смањена након изласка изазваног НО

Egressed parasites were collected and shown to remain viable by trypan blue exclusion (>85 посто одрживости). Затим смо додали паразите који су изашли у ПЦК или их инокулирали у 3-недељне АА пилиће бројлера појединачно путем клоакалног пута. Обе инвазивне ефикасности (стр<0.01)(fig.6a)and productivity="" in="" chickens=""><0.01)(fig.6b)of the="" parasites="" after="" no-induced="" egress="" decreased="" dramatically="" compared="" to="" that="" of="" freshly="" prepared="">

Дискусија

У овој студији смо открили да егзогени НО стимулише рани излазак спорозоита Е. тенелла из инфицираних ПЦК у процесу који зависи од Ца{0}}а. Излазак паразита није резултирао оштећењем ћелија домаћина, а реинвазивна способност и вируленција паразита који су изашли значајно су се смањили. Заједно, ови резултати сугеришу нови модел за проучавање механизма изласка еимеријских паразита и обезбеђују нову методу, посредовану НО, за смањење интрацелуларних патогена у ћелијама домаћина.

Излазак је важан процес који омогућава ајмеријским паразитима да изађу из ћелија домаћина и нападну суседне ћелије како би започели нови интрацелуларни животни циклус; стога, излаз игра кључну улогу у патогенези унутар домаћина. Наши претходни извештаји били су фокусирани на прелиминарне механичке студије излаза еимеријских паразита [35,36]. У овој студији, НО је укључен. Открили смо да НО може индуковати излазак паразита убрзо након завршетка инвазије, и много пре појаве зрелог изласка мерозоита, што је пореметило животни циклус овог патогена. У овој студији, инфицирани ПЦК нису претрпели оштећења током изласка, што се разликује од извештаја о некрози ћелије домаћина у сличним студијама изласка Т. Гонди тахизоита [19, 20]. Једно могуће објашњење за ову разлику је да се спорозоити нису реплицирали пре него што је спроведен тест излаза. Према томе, не више од два паразита насељавају ћелије домаћина, што је вредност много нижа од вредности тахизоита која је пријављена у претходним студијама [19, 32]. Друго могуће објашњење је да, за разлику од Т.гонди тахизоита или еимериан мерозоита, паразиту недостаје специфичан протеин који би уништио ћелије домаћина за природни излаз у фази спорозоита. Међутим, нисмо нашли никакве директне доказе који подржавају ове хипотезе. Наши резултати су показали значајно смањење вируленције егресираних спорозоита, за разлику од Т. Гонди тахизоита, који одржавају нормалну вируленцију након изласка [27, 37]. Претпостављамо да се паразит развијао од спорозоита до шизонта када је спроведен тест излаза и да се експресија гена која регулише протеине специфичне за стадијум паразита можда променила. За разлику од еимеријских спорозоита, Т. Гонди тахизоити подлежу бинарној фисији у ћелијама домаћинима, чиме се одржава нормална вирулентност. Стога смо мислили да ако постоје одређени стимулатори који би могли да изазову излазак Еимериа спп. након инвазије, паразити који су изашли нису могли да одрже своју нормалну вируленцију ин виво, као у ин витро експериментима. Овај имунолошки посредовани излаз може пореметити животни циклус паразита и на крају подстаћи уклањање паразита од стране имунолошких ћелија.

Недавне студије су откриле кључну улогу Ца2 у изласку патогена апикомплексана[7,18]. Секундарни гласник инозитол 1,4,5-трифосфат (ИП3) стимулише ослобађање Ца2 из ЕР у цитоплазму путем везивања за ИП3 рецептор [3]. Показало се да ИП3 индукује ослобађање Ца2 из интрацелуларних базена и код Т.гонди [24] и код Пласмодиум фалципарум [2]; међутим, мало се зна о геномском присуству ИП3 рецептора код апикомплексанских паразита [4,23]. У овој студији, интрацелуларни Ца² и ИП3 путеви су блокирани коришћењем БАПТА-АМ и У-73122 да би се тестирало да ли је НО-индукован излаз спорозоита зависан од Ца плус и да би се одредио извор Ца2т. Наши резултати су показали да је излазак био спутан и БАПТА-АМ и У-73122, што указује да интрацелуларни Ца игра виталну улогу у изласку спорозоита Е. тенелла. Иако смо показали да је интрацелуларни Ца2 плус виталан за излазак паразита, пут и функција сродних протеина захтевају даље проучавање коришћењем напреднијих и прецизнијих метода.

Укратко, резултати ове студије указују на то да НО може стимулисати рани излазак спорозоита Е. тенелла из инфицираних ПЦК и пружити прелиминарне информације о механизму овог изласка. У будућим студијама, настојаћемо да идентификујемо додатне имуне молекуле који индукују рани излазак спорозоита Е. тенелла и истражићемо да ли НО може индуковати рани излазак еимеријских паразита из епителних ћелија пилића ин витро и ин виво.