Истраживање улоге новог хомолога интерлеукина-17 из морске дагње бескичмењака Митилус Цорусцус у урођеном имунолошком одговору: да ли је негативна регулација Мц-Новел_миР_145 кључ?

Апстрактан: Интерлеукин-17 (ИЛ-17) представља класу проинфламаторних цитокина укључених у хроничне инфламаторне и дегенеративне поремећаје. Пре ове студије, било је предвиђено да би ИЛ-17 хомолог могао да буде мета Мц-новел_миР_145 да учествује у имунолошком одговору Митилус цорусцус. Ова студија је користила различите методе истраживања молекуларне и ћелијске биологије да би истражила повезаност између Мц-новел_миР_145 и ИЛ-17 хомолога и њихових имуномодулаторних ефеката. Биоинформатичко предвиђање је потврдило припадност хомолога ИЛ-17 са породицом ИЛ-17 дагњи, праћено квантитативним ПЦР тестовима у реалном времену (кПЦР) како би се показало да је МцИЛ-17-3 био високо изражен у имуно-повезаних ткива и одговорили на бактеријске изазове. Резултати тестова репортера луциферазе потврдили су потенцијал МцИЛ-17-3 да активира низводно НФ-κб и његово циљање помоћу Мц-новела_миР_145 у ћелијама ХЕК293. Студија је такође произвела МцИЛ-17-3 антисерум и открила да Мц-новел_миР_145 негативно регулише МцИЛ-17-3 путем вестерн блоттинг и кПЦР тестова. Штавише, анализа проточне цитометрије је показала да је Мц-новел_миР_145 негативно регулисао МцИЛ-17-3 да би ублажио апоптозу изазвану ЛПС-ом. Заједно, тренутни резултати су показали да је МцИЛ-17-3 играо важну улогу у имуној одбрани мекушаца од напада бактерија. Штавише, МцИЛ- 17-3 је негативно регулисан од стране Мц-новел_миР_145 да учествује у апоптози изазваној ЛПС-ом. Наши налази пружају нови увид у некодирајућу регулацију РНК у моделима бескичмењака.

цистанцхе користи за мушкарце - јача имуни систем

Кључне речи: Митилус цоусцоус; интерлеукин-17; микроРНА; апоптоза; урођен имунитет

1. Представљање

Имуни систем игра кључну улогу у одбрани организма од инвазије егзогених патогена. Конвенционално, систем одбране се дели на урођени имунитет и стечени имунитет. Урођени имунитет представља прву линију одбране тела од патогена, која може открити инвазију патогена и делимично их елиминисати [1]. Урођени имунитет је посредован великим бројем ћелија, укључујући природне ћелије убице, моноците, неутрофиле, еозинофиле, базофиле и циркулишуће дендритске ћелије, које су заједно познате као ћелије урођеног имунитета. Ове ћелије ослобађају велики број цитокина који су укључени у ћелијску комуникацију и на тај начин помажу у координацији имунолошких одговора [2]. У случају инфекције и упале, цитокини функционишу као модулатори: неки цитокини погоршавају болест (проинфламаторни), док други промовишу здравље (антиинфламаторно) [3]. Цитокини су подложни високим нивоима еволуционог притиска и стога показују диверсификацију секвенце [4], док породица ИЛ-17 цитокина показује високу очуваност, што се манифестује набором цистеинског чвора у функционалној архитектури формираној интеракцијом између четири конзервирани остаци цистеина [5]. Недавне студије су показале да је ИЛ-17 класа проинфламаторних цитокина укључених у хроничне инфламаторне и дегенеративне поремећаје [6]. ИЛ{10} функционише тако што се специфично везује за рецепторе како би подстакао развој упале, имунолошко одбацивање и хематопоезу. ИЛ-17 фамилија цитокина код људи састоји се од шест чланова (ИЛ-17А до ИЛ-17Ф), које производе активирани Т лимфоцити и друге урођене популације ћелија као одговор на ИЛ -1 и ИЛ-23 [7,8]. Међутим, све већи број доказа сугерише да је породица ИЛ-17 доживела значајну експанзију морских мекушаца и врста бодљокожаца. У геному љубичастог морског јежа Стронгилоцентротус пурпуратус откривено је око 30 ИЛ-17 гена [9]. Слично, 31 ген попут ИЛ-17- хоботнице пронађен је у колоидним главоношцима, при чему 27 гена има моћну експресију у сисавцима и кожи [10]. Сацо, ет ал. [11] је пронашао 379 јединствених ИЛ-17 секвенци из 15 поново секвенцираних генома дагњи ​​и референтног генома М. галлопровинциалис [12] и поделио их у 23 изоформе кроз филогенетску анализу. Даље, открили су да су изоформе ИЛ-17 из врста Митилидае сачуване међу појединцима и подељене међу блиско сродним врстама. Поред врста Митилидае, велике породице ИЛ-17 пронађене су и код других врста мекушаца, укључујући Црассостреа гигас, Мизухопецтен иессоенсис и Пинцтада фуцата мартенсии [13]. Морска вода врви од патогена, а морски мекушци су у сталном контакту са њима, па је стога потребан моћан арсенал имуних молекула, па ширење породице ИЛ-17 даје овим животињама ефикаснији имуни одговор.

Било је неколико студија које указују на значајну улогу коју ИЛ-17 играју у урођеном имунитету мекушаца. На пример, истраживање је открило да је након инфекције вирусом Вибрио харвеии ниво мРНК ИЛ-17Д у великој мери повећан у Тегиларца гранулоса [14], док је код Ц. гигас, ЦгИЛ17-5 показао изразита реакција на Вибрио сплендидус [15]. Поред тога, показало се да ИЛ-17 мекушаца реагују на многе молекуларне обрасце повезане са патогеном (ПАМП), као што су липополисахарид (ЛПС), полиинозинска: полицитидилна киселина (полиИ: Ц) и пептидогликан (ПГН). ЛПС је главна компонента спољашњег зида грам-негативних бактеријских ћелијских зидова и представља један од најчешће коришћених имунолошких стимуланса. С друге стране, полиИ: Ц је дволанчани аналог РНК који се често користи као симулатор вируса у научним истраживањима. Након стимулације ЛПС-ом, транскрипциона експресија гена породице ИЛ-17 брзо је покренута код пацифичке остриге Ц. гигас и бисерне остриге П. фуцата [16,17]. Утврђено је да је и код бисерних острига ПфИЛ-17 укључен у имуни одговор на стимулацију полиИ:Ц [17].

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

Поред тога, дуални тест луциферазе је показао да је ПфИЛ-17 био у стању да активира циљне гене кичмењака који садрже места везивања НФ-кБ и учествује у НФ-кБ сигналном путу у ћелијама ХЕК293 [17]. ПГН је присутан у ћелијском зиду Грам-позитивних бактерија и често се користи као имитација Грам-позитивних бактерија. Доказано је да рекомбинантни Ц. гигас ИЛ17-5 има јак афинитет према ПГН, што никада није забележено код интерлеукина кичмењака [18]. Ове студије су дале увод у откривање имуномодулаторне функције ИЛ-17 код мекушаца. Као класа проинфламаторних цитокина, прекомерна експресија ИЛ-17 може изазвати озбиљна оштећења ћелија. Организми су развили различите механизме за контролу прекомерне реакције ИЛ-17, од којих микроРНК (миРНА) представљају најмоћнију и добро проучену класу некодирајућих РНК. МиРНА су породица кратких РНК дужине око 22 нт које могу регулисати експресију циљних гена транслационом репресијом или деградацијом мРНК [19]. Садашња истраживања о регулацији ИЛ-17 миРНА углавном се фокусирају на њихове синергијске ефекте у људским аутоимуним болестима као што су мултипла склероза, реуматоидни артритис, псоријаза и друге [20]. Развој технике секвенционирања високе пропусности и биолошког израчунавања омогућава скенирање миРНА мекушаца на геномском нивоу, а велики број очуваних и нових миРНА је идентификован од врста мекушаца као што су равна острига Остреа едулис, пацифичка острига Ц. гигас , Лимнаеа стагналис, дагња М. галлопровинциалис, итд. [21–29]. Ове студије пружају основне податке и велику подршку за функционалну интерпретацију миРНА код мекушаца. У вези са имунорегулаторном улогом одређених миРНА у мекушцима, Тиан, ет ал. [30] открили су да Пм-миР-29а може позитивно да регулише ИЛ-17 у Пинцтада мартенсии; након прекомерне експресије Пм-миР-29а, експресија ИЛ-17 у омотачу и шкргама врсте је била повећана. Код Ц. гигас, цги-миР-2д је повећао фагоцитозу хемоцита острига негативном регулацијом ЦгИκБ2 [31] и негативном регулацијом експресије гена сличног холинском транспортеру у раној фази инфекције, који је био укључен у софистицирану имуномодулацију [32].

цистанцхе биљке које повећавају имуни систем

Кликните овде да видите производе Цистанцхе Енханце Иммунити

【Затражите више】 Е-пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Вхатс Апп: 0086 18599088692 / Вецхат: 18599088692

Током исушивања, откривено је да је цги-миР-365 индукована норепинефрином и да је директно промовисао експресију ЦгХСП90АА1 [33]. Недавне студије су показале да миРНА скела659_26519 циља на калмодулин да регулише експресију ИЛ-17 у раној фази имуног одговора Ц. гигас [34]. Поред тога, специфичне функције одређених миРНА су описане код других бескичмењака, као што су морски краставац Апостицхопус јапоницус [35–39] и козица Литопенаеус ваннамеи [40]. Ове студије су отвориле вео основним механизмима миРНА код бескичмењака и такође су пружиле техничке и методолошке референце за наше тренутно истраживање. У нашој претходној студији, 26 миРНА и 667 гена М. цорусцус су биолошки израчунати за диференцијалну експресију након изазова Вибрио алгинолитицус, од којих Мцновел_миР_145 може циљати ИЛ-17 хомолог и да буду укључени у имуни одговор на бактеријску инфекцију [41]. Циљ ове студије је да идентификује ИЛ-17 ген и истражи његову потенцијалну улогу у урођеном имунитету и његову регулацију помоћу миРНА Мцновел_миР_145 код М. цорусцус. Кроз ову студију, циљ нам је да боље разумемо механизме имунолошког одговора мекушаца и расветлимо молекуларну основу њихове имунолошке одбране од патогена. Ово истраживање такође може пружити увид у некодирајућу регулацију РНК у моделима бескичмењака.

2. Резултати

2.1. Карактеризација МцИЛ-а-17-3

МцИЛ-17-3 цДНК секвенца која садржи комплетан ОРФ, 30 -УТР и делимични 50 - УТР је ин силико клонирана из транскриптома пуне дужине М. цорусцус (приступни број: ПРЈНА798880, Ф{ {5}}транскрипт_12404). МцИЛ-17-3 садржи ОРФ регион од 585 бп који кодира 194 аминокиселине. Предвиђена молекулска тежина је 21,77 кДа, а изоелектрична тачка је 5,21. СМАРТ анализа је открила типичан ИЛ-17 домен у овом протеину (Слика 1А). Филогенетско стабло је конструисано регрутовањем ИЛ-17 чланова кичмењака и врста Митилидае, а ИЛ2 су коришћени као спољна група. Као што је приказано на слици 1Б, ови ИЛ-17и су скупљени у одређену грану да би се разликовали од ИЛ-2. Унутар ИЛ-17 кластера приказане су две очигледне кладе, једна сачињена од ИЛ-17 кичмењака, а друга од ИЛ-17 дагњи. У групи дагњи ​​ИЛ-17, МцИЛ-17-3 се прво груписао са одговарајућим молекулом из друге врсте Митилус, М. галлопровинциалис (Слика 1Б).

2.2. Вишеструко поравнање и предвиђање терцијарне структуре

Језгро МцИЛ-17-3 се састоји од два пара антипаралелних ланаца; један пар укључује праменове 1 (остаци 52–58) и 2 (остаци 66–72 и 77–79), док други укључује нити 3 (остаци 89–103) и 4 (остаци 110–125) (слика 2Б, Ц) . Два дисулфидна моста (Цис97/Цис134 и Цис125/Цис169) повезују нити 1 и 3, 2 и 4, респективно (Слика 2А, Ц). У складу са тим, други ИЛ-17 мекушаца такође поседују ова два дисулфидна моста између нити 1 и 3, 2 и 4 (Слика 2А, Ц). Приметно, иако ИЛ-17и кичмењака такође имају два дисулфидна моста, они постоје између 2 и 4 (Слика 2А, Ц).

2.3. Транскрипциона експресија МцИЛ-17-3

Профил дистрибуције ткива МцИЛ{{0}} транскрипата је процењен кПЦР. Транскрипти МцИЛ-17-3 су експримирани у свим тестираним ткивима, а нивои експресије у хемоцитима и шкргама били су значајно виши од оних у мишићима адуктора (Слика 3А). Такође је процењена временска експресија МцИЛ-17-3 транскрипата хемоцита као одговор на изазивање В. алгинолитицус. Ниво мРНА МцИЛ-17-3 је значајно повећан на 3 и 12 ХПЦ (3.13- или 4.{11}} пута повећање у поређењу са 0 ХПЦ, респективно), али није било очигледна временска правилност уопште (слика 3Б).

Слика 1. Молекуларна карактеризација МцИЛ-17-3. (А) Анализа архитектуре очуваних домена у МцИЛ-17-3 коришћењем СМАРТ-а. Приказан је очувани ИЛ-17 домен. (Б) Филогенетска анализа МцИЛ-17-3. Филогенетско стабло је конструисано коришћењем МЕГАКС софтвера са 2000 реплика покретања помоћу методе спајања суседа. МцИЛ-17-3 је означен зеленим троуглом. Све врсте укључене у филогенетско стабло су преузете из базе података Генебанке, а приступни бројеви су такође наведени у стаблу. Зелени троугао у име МцИЛ-17-3. (За тумачење референци на боју у овој легенди слике, читалац се упућује на веб верзију овог чланка.)

2.4. Активација низводне компаније МцИЛ-17-3

Као што је приказано на слици 4, рекомбинантни МцИЛ-17-3 повећава активност луциферазе пГЛНФ-κБ-луц на начин који зависи од дозе. На 0.5 и 1.0 µг/бунарићу, активност луциферазе пГЛНФ-κБ-луц се повећала 2.07- и 11.07- пута, респективно.

2.5. Потврда МцИЛ-17-3 као циљног гена Мц-романа_миР_145

Путем биоинформатичког предвиђања, ген МцИЛ{{0}} садржи стандардну циљну секвенцу за Мц-новел_миР_145 на свом 30 УТР (Слика 5А). Мц-новел_миР_145 имитатор и инхибитор су ко-трансфектовани са дивљим типом МцИЛ-17-3-30 УТР репортер плазмида у ћелије ХЕК293 да би се потврдила њихова корелација. Као што је приказано на слици 5Б, имитација Мц-новела_миР_145 може инхибирати активност луциферазе МцИЛ-17-3-30 УТР-ВТ (0.{{2{{58} }}} пута смањење у поређењу са контролом), док инхибитор Мц-новела_миР_145 значајно ублажава ефекте (1.64-вишеструко повећање у поређењу са Мц-новелом_ миР_145 опонаша као само додата група). Да бисмо проценили да ли Мц-новел{{30}}миР_145 директно циља на МцИЛ-17-3 ген преко циљног места у 30 УТР, конструисали смо мутантну верзију плазмида репортера луциферазе који је мутирао секвенце циљања Мц-роман_миР_145 у МцИЛ-17-3 30 УТР. Као што је приказано на слици 5Ц, Мц-новел_миР_145 имитација значајно је смањила активност луциферазе ћелија трансфицираних са МцИЛ-17-3-30 УТР-ВТ (0.27- пута смањење), док није примећена промена активности луциферазе у ћелијама трансфектованим са МцИЛ-17-3-30 УТР-МУТ. Поред тога, ефекти зависни од дозе Мц-новела_миР_145 опонашају инхибицију МцИЛ-17-3-30 УТР-ВТ луциферазне активности такође се могу приметити 24 сата након трансфекције (0 .71-, 0.43- и 0.20- пута смањење у поређењу са контролом, респективно, слика 5Д).

Слика 2. Вишеструка поравнања МцИЛ-17-3 са другим члановима ИЛ-17 породице. (А) Аминокиселинска секвенца МцИЛ-17-3 била је усклађена са секвенцом других ИЛ-17 добијених из дагњи ​​и кичмењака, укључујући мишеве и зебрице. Ови цистеини, који формирају канонски чвор, означени су зеленом бојом, а замењени остаци аминокиселина означени су црвеном бојом. Цистеински чвор је означен линијама у боји, плава значи њихово присуство у мекушцима, а црвена што значи њихово присуство код кичмењака. Напомена: Само друга половина поравнања секвенце је сачувана за визуелизацију. (Б) Терцијарна структура МцИЛ-17-3 протеина је предвиђена коришћењем швајцарског модела и пиМол софтвера. Ови цистеини, који формирају канонски чвор, су означени. (Ц) Цртани приказ канонског набора цистеинског чвора. Цистеински остаци су означени попуњеним круговима; они присутни у ИЛ-17 протеинима су били жути, док су два пропуштена била сива. (За тумачење референци на боју у овој легенди слике, читалац се упућује на веб верзију овог чланка.)

Слика 3. Анализа профила експресије МцИЛ-17-3 транскрипата. (А) Дистрибуција МцИЛ-17-3 транскрипата у ткивима обичних дагњи. (Б) Временске промене експресије МцИЛ-17-3 транскрипата као одговор на изазов В. алгинолитицус. Резултати су изражени као средња вредност ± СД (н=3, * п < 0.05, ** п < 0,01). (За тумачење референци на боју у овој легенди слике, читалац се упућује на веб верзију овог чланка.)

Слика 4. Активација НФ-κБ репортера од стране МцИЛ-17-3. Рекомбинантни вектор пЕГФП-МцИЛ- 17-3 у три концентрације (0.1, 0.5 и 1.{{10}} µг/бунарић) је котрансфектован у ћелије ХЕК293 користећи Липо6000ТМ током 24 х. Релативна активност луциферазе је израчуната нормализацијом на пРЛТК вредност. Експериментални резултати су изражени као нагомилане промене упоређивањем активности луциферазе рекомбинантних вектор-индукованих ћелија са ћелијама индукованих празним вектором у истој концентрацији. Свака вредност је приказана као средња вредност ± СД (н=3), а траке са симболом звездице су се значајно разликовале (* п < 0,05, ** п < 0,01).

Слика 5. Мц-роман_миР_145 циља МцИЛ-17-3. (А) МцИЛ-17-3 30 УТР секвенца је убачена у пмиР-РБ-Репорт™ вектор, респективно, конструисане плазмиде дивљег типа и мутантне плазмиде. Мцновел_миР{{10}} секвенца и МцИЛ-17-3-30 УТР циљно место и секвенца мутантног места су означене црвеним маркерима. (Б) МцИЛ-17-3-30 УТР-ВТ плазмид је ко-трансфектован са Мц-новел_миР_145 мимиком или Мц-новел_миР{{2{{37} }}} у ћелије ХЕК293. (Ц) ХЕК293 ћелије су трансфектоване са МцИЛ-17-3-30 УТР-ВТ или мутантним типом МцИЛ-17-3-30 УТР-МУТ, заједно са Мц-новел_миР_145 или НЦ , током 24 х. Активност луциферазе је мерена коришћењем дуал-луциферазе репортер система. (Д) Експерименти са градијентом концентрације су спроведени за Мц-новел_миР_145 трансфекцију. Сви подаци су представљени као средња вредност ± СД из најмање три независна трострука експеримента. **, п < 0,01, *, п < 0,05 у односу на контроле. (За тумачење референци на боју у овој легенди слике, читалац се упућује на веб верзију овог чланка.)

2.6. Мц-роман_миР_145 негативно регулише изражавање МцИЛ-17-3

Хемоцити М. цорусцус су трансфектовани са Мц-новел_миР_145 мимиком, Мцновел_миР_145 инхибитором и њиховим одговарајућим контролама и променама у МцИЛ{{ 5}} експресија је процењена на нивоу транскрипције и протеина. Као што је приказано на Слици 6А, експресија Мц-новела_миР_145 је била значајно повећана (883- пута повећање) због имитације и ниже регулисане ({{14 }}.41-смањење вишеструко) због његовог репресора у хемоцитима, што указује на ефикасне ефекте ових синтетичких једињења. На слици 6Б, експресија ендогеног МцИЛ-17-3 је била значајно инхибирана (0.51-путоструко смањење) мимиком Мц-новела_миР_145 на транскрипционом нивоу и значајно индукована (2.42-путоструко повећање) Мцновел_миР_145 инхибитором. Да би се истражили ефекти Мц-новела_миР_145 на експресију МцИЛ-17-3 на нивоу протеина, произведено је поликлонско антитело против МцИЛ-17-3. Као што је приказано у стазама 2 и 3 на слици 6Ц, рекомбинантни МцИЛ-17-3 протеин је успешно експримиран у Е. цоли. Специфичност антитела је испитивана са протеином дагње из хемоцита методом Вестерн блот. Уочена је једна трака од око 22 кДа, која одговара молекулској маси МцИЛ-17-3 (трака 4 на слици 6Ц). Резултати Вестерн блота на слици 6Д показали су негативну регулацију МцИЛ-17-3 на нивоу протеина од стране Мц-новела_миР_145.

Fслика 6. Мц-новел_миР_145 је инхибирао експресију МцИЛ-17-3 у хемоцитима М. цорусцус. (А) Експресија Мц-новел_миР_145 је процењена кПЦР-ом у хемоцитима трансфектованим са 145 мимика, 145 инхибитора и њиховом одговарајућом контролом. (Б) После трансфекције током 24 х, нивои транскрипције МцИЛ-17-3 су одређени кПЦР-ом. (Ц) Рекомбинантна експресија, пречишћавање и припрема антисерума за МцИЛ-17-3. Трака М, стандардни маркер молекулске тежине протеина. Трака 1, негативна контрола (без индукције). Трака 2, индуковани рекомбинантни протеин МцИЛ-17-3. Трака 3, пречишћени МцИЛ- 17-3. Трака 4, Вестерн блот са анти-МцИЛ{{20}} антителом у хемоцитима М. цорусцус. (Д) Након трансфекције током 24 х, нивои протеина МцИЛ-17-3 су одређени Вестерн блот-ом. ** п < 0,01 у односу на контроле

2.7. Апоптоза хемоцита

Стопа апоптозе хемоцита за четири групе, тј. НЦ+ЛПС, МцИЛ-17-3+ЛПС, Мцновел_миР_145+МцИЛ-17-3+ЛПС и Мц-новел{{6} }миР_145-и+МцИЛ-17-3+ЛПС је анализиран проточном цитометријом коришћењем двоструког бојења. Након што је МцИЛ-17-3 био прекомерно изражен, стопа апоптозе хемоцита изазваних ЛПС-ом је значајно повећана у поређењу са контролном групом (Слика 7А(а,б), Б). Када је МцИЛ-17-3 био котрансфициран са Мц-новел_миР_145, стопа апоптозе хемоцита изазвана ЛПС значајно се смањила у поређењу са стопом само трансфицираног МцИЛ-17-3 (слика 7А( б,ц), Б). Насупрот томе, стопа апоптозе хемоцита показала је значајно повећање у групи Мц-новел_миР_145-и+ МцИЛ-17-3+ЛПС у поређењу са групом МцИЛ-17-3+ЛПС (слика 7А (б,д), Б).

Слика 7. Стопа апоптозе хемоцита је процењена проточном цитометријом коришћењем пропидијум јодида (ПИ) и ФИТЦ-Анексин-В боје

3. Дискусија

ИЛ-17 је препозната као једна од важних фамилија проинфламаторних цитокина, која може ефикасно да учествује у патогенези различитих болести [42]. У нашој претходној студији, хомолог М. цорусцус ИЛ-17 показао је диференцијалну експресију пре и после инфекције В. алгинолитицус путем секвенцирања транскриптома [41], што указује на његову потенцијалну улогу у урођеном имунолошком одговору на бактеријски изазов. Овде смо окарактерисали овај ИЛ-17 хомолог и назвали га МцИЛ-17-3. Предвиђање функционалног домена открило је типичан ИЛ-17 домен, дајући тренутно идентификовану генску припадност породици ИЛ-17 цитокина. У филогенетском стаблу, овај нови ген ИЛ-17 показао је веома блиску сродност са ИЛ-17- 3 из друге врсте Митилус, М. галлопровинциалис. Поред тога, делили су веома висок идентитет аминокиселина од 95% и стога смо номиновали тренутни нови ген ИЛ-17 као МцИЛ-17-3 да бисмо пратили конвенцију именовања која се користи у врстама Митилус. Породица ИЛ-17 се састоји од шест чланова и пет рецептора код људи [43], али је доживела огромну генетску експанзију код морских бескичмењака, посебно код дагњи ​​[11]. На основу овога, наши подаци сугеришу да МцИЛ-17-3 није директно повезан са одређеним генима у породици ИЛ-17 људи. Набор цистеинског чвора који се налази на -листовима је типична карактеристика породице ИЛ-17 [5]. Очекивано, предвиђање терцијарне структуре је открило набор цистеинског чвора у МцИЛ-17-3 протеину, додатно продубљујући приписивање МцИЛ-17-3 породици ИЛ-17 цитокина. За даље истраживање диференцијације ИЛ{27}} аминокиселинских секвенци међу различитим врстама, неке типичне ИЛ-17 дагње и Мус мусцулус ИЛ-17-А до ИЛ-17-Ф и Данио рерио ИЛ-17-1 до ИЛ-17-3 су изабрани за обављање анализе вишеструког поравнања. Резултати су показали интересантан налаз да је дисулфидна веза ИЛ-17 код шкољки и кичмењака недоследна: ове две дисулфидне везе постојале су између -ланаца 1 и 3, 2 и 4, респективно, код дагњи, али само између -ланци 2 и 4 код кичмењака. На првом и четвртом месту цистеина, ИЛ-17 кичмењака замењују цистеин серином; насупрот томе, на другом месту цистеина, ИЛ-17 дагње замењују цистеин треонинентиацијом у вези са дисулфидом код дагњи ​​и кичмењака, а његов основни механизам је нејасан и захтева даље проучавање. С обзиром на полиморфизам ИЛ-17 у дагњама, дисулфидна веза између -ланаца 1 и 3 можда није тако јака као она између 2 и 4, што им даје већу пластичност код дагњи. У сваком случају, анализа функционалних домена и терцијарне структуре сугерише да је МцИЛ-17-3 који је тренутно идентификован типичан за цитокин ИЛ-17 дагње и да би могао да игра сличну функционалну улогу као и његови колеге код мекушаца. Експресија ИЛ-17 гена у људским ткивима веома варира, при чему су неки експримирани у само неколико ћелија, а други у великом броју ткива [44,45]. Већина студија на мекушцима је показала да ИЛ-17и имају конститутивни профил експресије [13,15,17,46,47]. Ипак, Ли, Зханг, Зханг, Ксианг, Тонг, Ку и Иу [47] су показали недоследан резултат у Ц. гигас ИЛ-17с: ЦгИЛ-17-2, -3, {{ 65}}, и -6 су били високо изражени у шкргама Ц. гигас, дигестивним жлездама и омотачу, али једва изражени у другим ткивима. Овде су транскрипти МцИЛ-17-3 пронађени у свим испитиваним ткивима, што указује на његову вишеструку функционалну улогу у различитим физиолошким активностима. Међутим, високи нивои експресије МцИЛ-17-3 у неким ткивима везаним за имунитет мекушаца, као што су хемоцити, шкрге и дигестивне жлезде, сугеришу његову ближу укљученост у имунолошки одговор. Након тога, његова брза реакција на напад В. алгинолитицус продубљује ову тачку. Ињекција В. алгинолитицус је значајно повећала експресију МцИЛ-17-3, а слични резултати су такође примећени код других ИЛ-17 мекушаца. Ињекција В. ангуилларум у Ц. гигас изазвала је брзо повећање количине транскрипта ЦгИЛ-17 у хемоцитима, што сугерише да је то био имуни ген ране фазе [46]. Када је Ц. гигас претрпео напад другог патогена, В. сплендидус, ниво мРНК ЦгИЛ-17-5 у хемоцитима је такође био значајно повишен [15]. Стимулација ЛПС-а, главне патогене компоненте бактерија, драматично је повећала експресију ПфИЛ-17 у дигестивним жлездама бисерне остриге П. фуцата [17]. Поред тога, ЛПС би могао да индукује експресију ЦгИЛ-17-3 у Ц. гигас [47] и ПмИЛ-17-2 у П. фуцата мартенсии [13]. Ови резултати заједно показују да је ИЛ-17 играо важну улогу у имуној одбрани мекушаца од напада бактерија. У овој студији, МцИЛ-17-3 је показао капацитет активације низводног НФ-κБ пута. Слични резултати су такође примећени код неких врста мекушаца. У бисерној остриги П. фуцата, ПфИЛ-17 је такође показао активацију НФ-κБ пута у ћелијама ХЕК293 помоћу тестова луциферазе репортер [17]. У Ц. гигас, ЦгИЛ-17-5 је промовисао активацију ЦгМАПК-а и нуклеарну транслокацију ЦгРел и ЦгАП-1 да би промовисао експресију мРНК цитокина и антибактеријских пептида [15]. Показало се да је начин деловања ИЛ-17 заснован на његовом уједињењу у димере (хомодимере или хетеродимере), чија активност у великој мери зависи од њиховог везивања за рецепторе (ИЛ-17Рс) које циљ. Ови рецептори садрже конзервирани цитоплазматски домен (СЕФИР) који ступа у интеракцију са адаптерским протеинима како би покренуо низводне путеве трансдукције сигнала за активирање фактора транскрипције као што је НФ-κБ и промовисање експресије имуних и проинфламаторних циљних гена, као што су цитокини и антимикробни пептиди [ 11,48,49].

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

Ови резултати сугеришу да ИЛ-17 мекушаца могу да имају исти начин деловања као и њихови колеге код кичмењака. Ово треба потврдити у будућим студијама. Корелације између миРНА и ИЛ-17 су пронађене у неколико модела људских болести. Ниимото, ет ал. [50] потврдио је позитивну корелацију између миР-146а и ИЛ-17а експресије у мононуклеарним ћелијама периферне крви и синовија пацијената са реуматоидним артритисом и сумирао виталну функцију миР-146а у диференцијација ћелија које производе ИЛ-17-. Код пацијената са псоријазом, миР-146а делује као снажан инхибитор упале коже изазване ИЛ-17-, а њени ниски нивои могу допринети раном почетку болести код генетски подложних појединаца [51]. МиР-146а може да ублажи пародонтитис тако што смањује експресију ИЛ-17 и инхибира пролиферацију матичних ћелија људског пародонталног лигамента [52]. МиР-155 негативно регулише експресију ИЛ-17 да би учествовао у имунолошком одговору домаћина на поствирусну бактеријску пнеумонију у плућима мишева; миР-155 инхибирани мишеви показују јачу експресију ИЛ-17 у плућима, праћену побољшаним клиренсом бактерија [53]. Ове студије сугеришу да ИЛ-17 регулише више миРНА и да варира у зависности од болести и типа ћелије [20]. У претходној студији, извршили смо интегрисану анализу миРНАоме и транскриптома да бисмо истражили интерактивну регулацију миРНА-мРНК од стране М. цорусцус као одговор на инфекцију В. алгинолитицус. Резултати су предвидели да би Мц-новел_миР_145 могао да циља МцИЛ-17-3 да учествује у урођеном имунолошком одговору на бактеријску инфекцију [41]. Са циљем да се детаљно истражи основни механизам Мцновел_миР_145 регулације МцИЛ-17-3, у овим студијама је спроведен низ лабораторијских експеримената. Прорачун је предвидео да би Мц-роман_миР_145 могао да циља 30 УТР МцИЛ-17-3. Следећи тестови репортера луциферазе изведени у ћелијама ХЕК293 ко-трансфектованим помоћу Мц-новел_миР_145 мимика, опонашања НЦ, инхибитора, инхибитора НЦ са МцИЛ-17-3-30 УТР-ВТ, -МУТ репортером плазмиди су додатно потврдили ову тачку. Даље, Мц-новел_миР_145 мимичар, мимички НЦ, инхибитор и инхибитор НЦ су трансфектовани у хемоците М. цорусцус да би се проценили њихови ефекти на експресију МцИЛ-17-3 на нивоима транскрипције и протеина . Експресија МцИЛ-17-3 је била значајно смањена у Мц-новел_миР_145 групи мимичке трансфекције, док је значајно повећана у Мц-роман_миР _145 група за трансфекцију инхибитора, што указује на негативну регулацију МцИЛ-17-3 од стране Мц-новела_миР_145. Тренутни резултати били су у супротности са претходном студијом. У Пинцтада мартенсии, Тиан, Зхенг, Хуанг, Јиао и Ду [30] су открили да иако Пм-миР-29а може циљати ИЛ-17, регулација је позитивна, као израз ИЛ{{ 65}} у омотачу и шкргама Пинцтада мартенсии је повећана после прекомерне експресије Пм-миР-29а. С обзиром на то да П. мартенсии и М. цорусцус припадају шкољкама и да су релативно блиско повезани, ови недоследни резултати сугеришу да регулација ИЛ-17 код мекушаца може да варира у зависности од миРНА. Осим овога, ниједна литература није известила о корелацији између миРНА и ИЛ-17 код мекушаца, па стога нема више паралелних студија за упоређивање тренутних резултата. Међутим, неколико студија је известило о циљаним односима између специфичних миРНА и специфичних гена повезаних са имунитетом код мекушаца.

На пример, цги-миР-2д повећава фагоцитозу хемоцита острига тако што негативно регулише ЦгИκБ2 у Црассостреа гигас [31]. Поред тога, цги-миР-2д такође негативно регулише експресију једног гена сличног транспортеру холина да учествује у софистицираној имуномодулацији хемоцита острига током ране фазе инфекције [32]. Ове студије барем сугеришу да миРНА играју потенцијалну улогу у урођеној имунолошкој сигнализацији циљајући специфичне гене код мекушаца, баш као што то раде код кичмењака. Затим смо покушали да истражимо потенцијалну функцију интеракције између Мцновел_миР_145 и МцИЛ{{10}} у урођеном имунитету М. цорусцус и њихову улогу у ЛПС-индукована апоптоза је у фокусу наше пажње. ЛПС је веома проинфламаторни молекул који је компонента спољашњег омотача свих грам-негативних бактерија. Показало се да ЛПС индукује апоптозу у различитим ћелијама и ткивима, као што су макрофаги [54], ендотелне ћелије [55] и плућа миша [56]. Прелиминарни експеримент је показао да излагање ЛПС-у при номиналној концентрацији од 0,1 мг/мЛ током 24 х значајно индукује апоптозу хемоцита из М. цорусцус. Након прекомерне експресије МцИЛ{19}}, ниво апоптозе хемоцита М. цорусцус је значајно повећан у поређењу са контролном групом, што сугерише да МцИЛ-17-3 може да појача апоптозу хемоцита изазвану ЛПС-ом у М. цорусцус. Садашњи резултати су били у складу са неким претходним студијама. У људским неутрофилима, ИЛ-17А може да умањи антиапоптотске ефекте посредоване фактором стимулације колоније макрофага гранулоцита [57]. ИЛ-17 индукује апоптозу васкуларних ендотелних ћелија, што је потенцијални механизам акутног коронарног синдрома [58]. Генетска делеција ИЛ-17А смањује апоптозу ћелија алвеоларног типа ИИ и на тај начин ублажава хроничну опструктивну болест плућа [59]. Међутим, и даље постоје неки супротни аргументи. Када су мишеви заражени Тајлеровим вирусом мишјег енцефаломијелитиса, ИЛ-6 и ИЛ-17 синергистички промовишу перзистентност вируса инхибирајући ћелијску апоптозу [60]. Ови сукоби сугеришу да је основни механизам апоптозе посредоване ИЛ{33}комплексним и да ИЛ-17е могу играти супротне функције у зависности од типа инфекције.

Када је МцИЛ-17-3 ко-трансфициран са Мц-новелом_миР_145, ниво апоптозе изазване ЛПС-ом је био значајно смањен у поређењу са јединим трансфицираним МцИЛ-17-3 групи, сходно томе, ниво апоптозе је значајно повећан након што је МцИЛ-17-3 ко-трансфектован са Мц-новел_миР_145 инхибитором. Показало се да Мц-новел_миР_145 негативно регулише МцИЛ-17-3, те смо стога закључили да је МцИЛ{17}} погоршао апоптозу хемоцита изазвану ЛПС-ом, док је Мц-новел _миР_145 је ублажио ефекте. Неколико миРНА за које се показало да су укључене у апоптозу људских и мишјих ћелија идентификовано је код мекушаца у последњих неколико година. На пример, миР-125б и миР- 335 су пронађени у равној остриги Остреа едулис [21], миР-184 је пронађен у хемоцитима остриге Црассостреа гигас [23], а миР{{ 26}}, -29, -96, -182 и -193 су пронађени у регенеришућем централном нервном систему Л. стагналис [25]. Ове миРНА повезане са апоптозом идентификоване путем секвенционирања високе пропусности и биолошких прорачуна потврђују постојање апоптозе посредоване миРНА у мекушцима. Цхен ет ал. пријавили су повећање миР-2д након изазивања Вибрио сплендидуса у хемоцитима Црассостреа гигас. Прекомерна експресија миР-2д била је у корелацији са смањеном експресијом ИκБ2 и значајним повећањем стопе фагоцитозе хемоцита, повезаним са супресијом апоптозе [31]. Резултати су били у складу са нашом тренутном студијом, заједно, чини се да имплицирају да миРНА врше инхибиторну функцију на ћелијску апоптозу код мекушаца. У ствари, већина миРНА повезаних са апоптозом код људи показала је инхибиторне ефекте на апоптозу. МиР-146 штити ћелије А549 и Х1975 од апоптозе изазване ЛПС-ом и повреде упале преко појачане регулације Сирт1, чиме блокира НФ-κБ и Нотцх путеве [61]. Штавише, миР-146 ублажава апоптозу хепатоцита изазвану зрачењем и ЛПС-ом кроз инхибицију ТЛР4 пута [62]. МиР-93 инхибира апоптозу хондроцита код остеоартритиса циљајући ТЛР4/НФ-κБ сигнални пут [63]. МиР-129-5п ублажава повреду кичмене мождине код мишева сузбијањем апоптозе кроз ХМГБ1/ТЛР4/НФ-κБ пут [64]. Међутим, још увек постоје неке специфичне миРНА које показују појачавајуће акције на апоптозу. На пример, пронађено је да миР-203 убрзава апоптозу изазвану ЛПС-ом циљањем на ПИК3ЦА у алвеоларним епителним ћелијама [65]. Ови резултати указују на сложеност основног механизма апоптозе посредоване миРНА.

4. Материјали и методе

4.1. Експериментални дизајн

Прво, МцИЛ-17-3 је идентификован и окарактерисан од М. цорусцус путем биоинформатичке анализе. Након тога, квантитативним ПЦР тестовима у реалном времену (кПЦР) процењени су дистрибуција МцИЛ-17-3 транскрипата у ткиву, као и његов одговор на бактеријски изазов. Затим је веза између МцИЛ-17-3 и Мц-новел_миР_145 одређена анализом репортера луциферазе обављеном у ћелијама ХЕК293 и хемоцитима М. цорусцус. Поред тога, њихова функционална улога у апоптози изазваној ЛПС процењена је проточном цитометријом.

4.2. Вештачка морска вода

После три дана аерације општинске воде из славине, додат је инстант морски кристал (Хаидинг ЛТД, Ји'ан, Кина), темељно промешан и отопљен да би се достигао салинитет од 30‰. Конфигурисану вештачку морску воду треба проветравати 2 х пре употребе.

4.3. Животиње

Дагња М. цорусцус (дужина шкољке, 9,82 ± 0, 53 цм; ширина љуске 4,68 ± 0, 45 цм; влажна тежина 71,2 ± 2,7 г) купљена је на пијаци Донгхе у Зхоусхану, провинција Зхејианг, Кина. Све дагње су држане у резервоарима напуњеним АСВ од око 25 ◦Ц и салинитетом од 30‰ више од недељу дана пре наредних експеримената.

4.4. МцИЛ-17-3 цДНК идентификација

ИЛ-17 хомолог (МцИЛ-17-3) је ин силицо клониран из транскриптома пуне дужине М. цорусцус (приступни број: ПРЈНА798880, Ф01_транскрипт_12404). Бласт процедура је спроведена да би се предвидела претпостављена МцИЛ-17-3 аминокиселинска секвенца, праћена функционалном анализом домена са СМАРТ и проценом филогенетског односа са МЕГА-Кс. Вишеструко поравнање је изведено коришћењем ЦлусталВ процедуре. Швајцарски модел и група су коришћени за предвиђање терцијарне структуре МцИЛ-17-3 протеина. Детаљан поступак је био према нашој претходној студији [66].

4.5. Квантитативни ПЦР тестови у реалном времену

Квантитативни ПЦР тестови у реалном времену (кПЦР) су моћно средство за откривање и мерење нивоа генске експресије. Овде је дистрибуција МцИЛ-17-3 у ткиву процењена коришћењем кПЦР методе. Поред тога, кПЦР-ом су откривене и промене у експресији МцИЛ-17-3 мРНА као одговор на бактеријску инфекцију. Профил дистрибуције ткива МцИЛ-17-3 одређен је у шкргама, омотачу, дигестивним жлездама, гонадама, адукторским мишићима и хемоцитима коришћењем кПЦР програмираног на 95 ◦Ц током 10 мин, након чега је уследило 40 циклуса од 95 ◦Ц за 10 с, 60 ◦Ц за 45 с. Ова ткива су сецирана од девет јединки дагњи ​​и спојена заједно да би се ублажила индивидуална диференцијација. У експерименту са бактеријским изазовом, живи В. алгинолитицус је коришћен као имуни стимуланс. Запремина од 100 µЛ бактерија растворених у морској води (1 × 108 ЦФУ мЛ-1) је убризгана у адуктор дагњи. Као контрола нису коришћене убризгане дагње. Девет дагњи ​​је насумично узорковано из сваке групе на 0, 3, 6, 12, 24 и 36 х након изазивања (хпц). Хемоцити из три дагње су спојени заједно да би се сматрали једним узорком, а било је три узорка за сваку временску тачку. МикроРНА су екстраховане коришћењем комплета за екстракцију миРНА (ХаиГЕНЕ, Кат. бр.: Б1802), а цДНК је синтетизована коришћењем миРцуте Плус миРНА Фирст-Странд цДНА комплета (Тианген, Кат. бр.: 4992786) и кПЦР је изведен коришћењем миРцуте Плус миРНА кПЦР комплет (Тианген, Кат. бр.: 4992887). У6 и -актин гени су коришћени као интерне референце за кПЦР и миРНА кПЦР, респективно. Специфични парови прајмера који су коришћени у овом експерименту су наведени у табели 1. Релативни нивои експресије су мерени коришћењем 2−∆∆Цт методе [67].

Табела 1. ПЦР парови прајмера су коришћени у овој студији.

4.6. Ћелијска култура

Ћелије ХЕК293 сисара (РибоБио Лтд., Гуангџоу, Кина) су коришћене за извођење тестова репортера луциферазе да би се утврдила активација низводно од стране МцИЛ- 17-3, као и повезаност између Мц-новела_миР{{ 4}} и МцИЛ-17-3. ХЕК293 ћелије су култивисане у ОПТИ-МЕМ медијуму (ГИБЦО) на 37 ◦Ц, 5% ЦО2. Да би се даље истражила регулација МцИЛ-17-3 од стране Мц-новела_миР_145 и њихова функционална улога у апоптози изазваној ЛПС-ом, хемоцити М. цорусцус су извучени из мишића адуктора сваког дагња са 0.5 мм пречника (25 Г) иглом за једнократну употребу која садржи 0.5 мЛ антикоагуланса. Хемоцити су сакупљени центрифугирањем током 5 минута на 3000 рпм, 4 ◦Ц и додат је 0,25% трипсина (Соларбио). Хемоцити су суспендовани у медијуму Л-15 који садржи 15% феталног говеђег серума (Соларбио) и култивисани на 26 ◦Ц са 5% ЦО2.

4.7. Синтеза миРНА мимика и инхибитора

Мц-роман_миР_145 мимичке, инхибиторне и контролне нуклеотиде саставила је ГенеПхарма (Шангај). Њихов редослед је следећи: Мц-роман_миР_145 мимиц, 52032- УЦЦАГААААГЦГЦУУЦГГАЦГ-30; Мц-новел_миР_145 инхибитор, 50 -ЦГУЦЦГААГЦГ ЦУУУУЦУГГА-30 (хемијски модификован са 20 Оме); негативна контрола мимика, 50 -УУГУА ЦУАЦАЦААААГУАЦУГ-30; и инхибитор негативне контроле, 50 -ЦАГУАЦУУУУГУГУ АГУАЦАА-30 (хемијски модификован са 20 Оме).

4.8. Анализа Луциферасе Репортер

Луциферазни репортерски тестови се широко користе за проучавање експресије гена и регулаторне активности. Количина произведене светлости је пропорционална количини произведеног ензима луциферазе, што заузврат одражава активност регулаторног елемента. Активност луциферазе се затим мери помоћу луминометра, а резултати се анализирају и тумаче да би се одредила регулаторна активност проучаваног елемента. Луциферазни репортерски тестови су коришћени за анализу низводне активације МцИЛ{{0}}. У овом експерименту, плазмид пЕГФП-МцИЛ-17-3 (0.1, 0.5 и 1.0 µг/бунарић) заједно са пГЛНФ-κб- луц репортер плазмид (0,25 µг/бунарићу) је котрансфектован у ћелије ХЕК293 коришћењем Липо6000ТМ током 24 х. Празан пЕГФП-Н1 плазмид је коришћен као контрола. Активност луциферазе је мерена коришћењем Дуал-Луциферасе® Репортер Ассаи система (Промега, Мадисон, ВИ, САД) према спецификацији, са Ренилла луциферазом коришћеном као интерконтролом. Мц-новел_миР_145 који циља МцИЛ-17-3 је такође потврђен тестовима луциферазе репортера. Биоинформатичка калкулација је предвидела да Мц-роман_миР_145 може да циља 30 -УТР оф МцИЛ-17-3, а затим је клонирала 30 -УТР оф МцИЛ{{ 29}} у пмиР-РБ-РепортТМ луциферазни репортерски вектор да се конструише дивљи МцИЛ-17-3-30 УТР-ВТ репортер плазмид. МцИЛ-17-3-30 УТР-МУТ репортер вектор мутантног типа је конструисан мутацијом нуклеотида на 1023–1040 места: ТЦЦГААГЦГЦТТТТЦТГГ до АГГЦТТЦГЦГААГАЦЦ. РНА олиго (Мц-новел_миР_196 НЦ, мимиц, НЦи, инхибитор) је трансфектован заједно са МцИЛ-17-3- 3 0 УТР-ВТ или МцИЛ-17-3-30 УТР-МУТ у ХЕК293 ћелије које користе Липо6000ТМ.

4.9. Рекомбинантна експресија, пречишћавање и припрема антисерума

Да би се проценио ефекат Мц-новел_миР_145 на експресију МцИЛ-17-3 протеина, припремљен је антисерум од МцИЛ-17-3. Фрагмент цДНК који покрива отворени оквир читања (ОРФ) МцИЛ-17-3 је амплификован са једним специфичним паром прајмера (Табела 1) и убачен у пЕТ-32вектор. Рекомбинантни плазмид пЕТ-32а-МцИЛ{{10}} је трансформисан у Есцхерицхиа цоли (ДЕ3) (Такара) и инкубиран у ЛБ медијуму (који садржи 50 мг Л−1 канамицин) на 37 ◦Ц уз мућкање на 130 о/мин током 4 х. Након што је оптичка густина достигла апсорбанцију 0.6 на 600 нм, изопропил-бета-Д-тиогалактопија унутра (ИПТГ) са коначном концентрацијом од 1 мМ је додата у бактеријски раствор да би се индуковала експресија рекомбинантног МцИЛ{ {24}} протеин (рМцИЛ-17-3). После инкубације на 37 ◦Ц током 6 х, медијум је центрифугиран на 8000 рпм током 30 минута да би се сакупиле бактерије, а затим је уследила суспензија у ТБС пуферу (20 мМ Трис-ХЦл, 150 мМ НаЦл, пХ 8,0). рМцИЛ-17-3 је пречишћен афинитетном хроматографијом Ни-нитрилотрисирћетне киселине (НИ-НТА), а пречишћени протеин је дијализован из имидазола током 24 х. Добијени протеин је изолован редукцијом 12% СДС-полиакриламид гел електрофорезе (СДС-ПАГЕ). Пречишћени протеин је поново савијен у градијентном уреа-ТБС глицерол пуферу (50 мМ Трис-ХЦл, 50 мМ НаЦл, 2 мМ редукованог глутатиона, 10% глицерола, 0,2 мМ оксид глутатиона, градијент концентрације урее од 6, 4, 3 , 1 и 0 М урее у сваком градијенту, пХ 7,4, сваки градијент на 4 ◦Ц током 12 х). Затим је добијени протеин коришћен за имунизацију 6-недељних мишева да би стекли поликлонска антитела.

4.10. Вестерн блоттинг

Узорци протеина су екстраховани из хемоцита РИПА пуфером за лизу (Беиотиме), а затим је концентрација детектована БЦА комплетом. Након изолације помоћу СДС-ПАГЕ, протеин је пребачен на ПВДФ мембране уз затварање 5% обраног млека у праху у ТБСТ (20 Мм Трис-ХЦл, 150 мМ НаЦл, 1% Твеен-20, пХ 8.0), након чега следи антитело против МцИЛ-17-3 инкубације преко ноћи. Након тога, мембране су инкубиране са разблаженим раствором козјег анти-мишјег ИгГ антитела и коњугата алкалне фосфатазе (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Кат. бр.: 31324) у секундарном пуферу за разблаживање антитела (Беиотиме, П0258) током 3 . Коначно, имунореактивни протеини су детектовани ЕЦЛ системом за детекцију.

4.11. Апоптоза

Апоптоза хемоцита је процењена коришћењем проточне цитометрије према приручнику ФИТЦ-Аннекин-В комплета за детекцију апоптозе (Беиотиме). Укратко, сакупљени хемоцити су третирани током 24 сата са ЛПС (0.1 мг/мЛ), 20 нМ пЕГФП-МцИЛ-17-3 плазмида, Мц новел_миР{{9} } мимиц и Мц-новел_миР_145 инхибитор. Након испирања са ПБС, ћелије су поново суспендоване у медијуму Л15 у коначној концентрацији од 1 × 106 ћелија мЛ-1 и обојене су са ФИТЦ-Аннекин-В и ПИ инкубацијом на собној температури 25 минута у мраку. . Коначно, инструмент за проточну цитометрију (Бецкман ЦитоФЛЕКС ФЦМ) је коришћен за откривање апоптозе ћелије, а подаци су анализирани коришћењем софтвера ФловЈоТМ 10. 4.12. Статистичка анализа Експериментални резултати су представљени као средња вредност ± стандардна девијација (СД). Резултати су обрађени коришћењем двосмерне АНОВА анализе варијансе са Тукијевим тестом вишеструких поређења, а софтвер Оригин2021 је коришћен за анализу података и конструисање фигура.

цистанцхе биљке које повећавају имуни систем

5. Закључци

У овој студији, нови хомолог ИЛ-17, МцИЛ-17-3, идентификован је из М. цорусцус и утврђено је да игра кључну улогу у имуној одбрани мекушаца од напада бактерија. Штавише, откривено је да МцИЛ-17-3 негативно регулише Мц-новел_миР_145, што доприноси његовом учешћу у апоптози изазваној ЛПС-ом. Резултати ове студије пружају вредан увид у регулаторну улогу ИЛ-17 у имунолошком одговору дагњи ​​и истичу потенцијал некодирајуће РНК у регулисању механизама имунолошке одбране бескичмењака. Међутим, важно је напоменути да постоје нека ограничења у овој студији. Конкретно, механизам који лежи у основи начина деловања МцИЛ-17-3 није проучаван и захтева даље истраживање. Поред тога, ова студија се фокусирала само на интеракцију између Мц-новел_миР_145 и МцИЛ-17-3 и није истраживала могуће учешће других миРНА у имунолошком одговору. Све у свему, ова студија наглашава важну улогу некодирајуће РНК у механизмима имунолошке одбране и сугерише да би њихова модулација могла послужити као потенцијална стратегија за циљане терапије за различите болести.

Референце

1. Меџитов, Р.; Јаневаи, Ц., Јр. Урођени имунитет. Н. Енгл. Ј. Мед. 2000, 343, 338–344. [ЦроссРеф] [ПубМед]

2. Лаци, П.; Стов, ЈЛ Ослобађање цитокина из урођених имуних ћелија: повезаност са различитим путевима трговине мембранама. Блоод Ј. Ам. Соц. Хематол. 2011, 118, 9–18. [ЦроссРеф] [ПубМед]

3. Динарелло, ЦА Проинфламаторни цитокини. Сандук 2000, 118, 503–508. [ЦроссРеф] [ПубМед]

4. Раута, ПР; Наиак, Б.; Дас, С. Имуни систем и имуни одговори код риба и њихова улога у компаративном проучавању имунитета: модел за више организме. Иммунол. Летт. 2012, 148, 23–33. [ЦроссРеф]

5. Химовитз, СГ; Филварофф, ЕХ; Иин, Ј.; Лее, Ј.; Цаи, Л.; Риссер, П.; Маруока, М.; Мао, В.; Фостер, Ј.; Келлеи, РФ ИЛ-17 усвајају цистински чвор: структура и активност новог цитокина, ИЛ-17Ф, и импликације на везивање рецептора. ЕМБО Ј. 2001, 20, 5332–5341. [ЦроссРеф]

6. Буцклеи, КМ; Хо, ЕЦХ; Хибино, Т.; Сцхранкел, ЦС; Сцхух, НВ; Ванг, ГЗ; Раст, фактори ЈП ИЛ17 су рани регулатори у епителу црева током инфламаторног одговора на Вибрио у ларви морског јежа. еЛифе 2017, 6, е23481. [ЦроссРеф]

7. Цуа, ДЈ; Тато, ЦМ урођене ћелије које производе ИЛ-17-: стражари имуног система. Нат. Рев. Иммунол. 2010, 10, 479–489. [ЦроссРеф]

8. Миллс, КХ ИЛ-17 и ИЛ-17-ћелије које производе у заштити од патологије. Нат. Рев. Иммунол. 2022, 10, 479–489. [ЦроссРеф]

9. Хибино, Т.; Лоза-Цолл, М.; Мессиер, Ц.; Мајеске, АЈ; Цохен, АХ; Тервиллигер, ДП; Буцклеи, КМ; Броцктон, В.; Наир, СВ; Бернеи, К. Репертоар имуног гена је кодиран у геному љубичастог морског јежа. Дев. Биол. 2006, 300, 349–365. [ЦроссРеф]

10. Албертин, ЦБ; Симаков, О.; Митрос, Т.; Ванг, ЗИ; Пунгор, ЈР; Едсингер-Гонзалес, Е.; Бреннер, С.; Рагсдале, ЦВ; Рокхсар, ДС Геном хоботнице и еволуција неуралних и морфолошких новина главоножаца. Природа 2015, 524, 220–224. [ЦроссРеф]

11. Сацо, А.; Реи-Цампос, М.; Росани, У.; Новоа, Б.; Фигуерас, А. Еволуција и разноврсност интерлеукина-17 наглашава експанзију морских бескичмењака и његову очувану улогу у имунитету слузокоже. Фронт. Иммунол. 2021, 12, 692997. [ЦроссРеф] [ПубМед]

12. Гердол, М.; Мореира, Р.; Цруз, Ф.; Гомез-Гарридо, Ј.; Власова, А.; Росани, У.; Вениер, П.; мр Нарањо-Ортиз; Мургарелла, М.; Грецо, С. Масивна варијација присутности и одсуства гена обликује отворени пан-геном у медитеранској дагњи. Геноме Биол. 2020, 21, 1–21. [ЦроссРеф]

13. Цао, И.; Ианг, С.; Фенг, Ц.; Зхан, В.; Зхенг, З.; Ванг, К.; Денг, И.; Јиао, И.; Ду, Кс. Еволуција и анализа функције гена интерлеукина-17 из Пинцтада фуцата мартенсии. Рибље шкољке Иммунол. 2019, 88, 102–110. [ЦроссРеф] [ПубМед]

14. Ванг, К.; Ксиао, Г.; Ху, Г.; Цхен, Р.; Ли, М.; Тенг, С. Интерлеукин-17Д посредује у променама изазваним инфекцијом Вибрио харвеии код Тегилларца гранулоса кроз активацију протеина активатора 1 ин виво. Аквакултура 2023, 566, 739178. [ЦроссРеф]

15. Лв, Кс.; Сун, Ј.; Ли, И.; Ианг, В.; Ванг, Л.; Ленг, Ј.; Иан, Кс.; Гуо, З.; Ианг, К.; Ванг, Л. ЦгИЛ17-5 регулише експресију мРНК имуних ефектора индукујући фосфорилацију ЦгМАПК и нуклеарну транслокацију ЦгРел и ЦгАП-1 у пацифичкој остриги Црассостреа гигас. Дев. Цомп. Иммунол. 2022, 127, 104263. [ЦроссРеф] [ПубМед]

16. Ванг, Л.; Сун, Ј.; Ву, З.; Лиан, Кс.; Хан, С.; Хуанг, С.; Ианг, Ц.; Ванг, Л.; Сонг, Л. АП-1 регулише експресију ИЛ17-4 и ИЛ17-5 у пацифичкој остриги Црассостреа гигас. Рибље шкољке Иммунол. 2020, 97, 554–563. [ЦроссРеф]

17. Ву, С.-З.; Хуанг, Кс.-Д.; Ли, К.; Он, М.-Кс. Интерлеукин-17 у бисерној остриги (Пинцтада фуцата): Молекуларно клонирање и функционална карактеризација. Рибље шкољке Иммунол. 2013, 34, 1050–1056. [ЦроссРеф]

18. Ксин, Л.; Зханг, Х.; Зханг, Р.; Ли, Х.; Ванг, В.; Ванг, Л.; Ванг, Х.; Киу, Л.; Сонг, Л. ЦгИЛ17-5, древни инфламаторни цитокин у Црассостреа гигас који показује функције хетерогености у поређењу са молекулима интерлеукина17 кичмењака. Дев. Цомп. Иммунол. 2015, 53, 339–348. [ЦроссРеф]

19. Денли АМ; Топс, ББ; Пластерк, РХ; Кеттинг, РФ; Ханнон, ГЈ Обрада примарних микроРНА од стране микропроцесорског комплекса. Природа 2004, 432, 231–235. [ЦроссРеф]

20. Кхан, Д.; Ансар Ахмед, С. Регулација ИЛ-17 код аутоимуних болести транскрипционим факторима и микроРНК. Фронт. Генет. 2015, 6, 236. [ЦроссРеф]

21. Мартин-Гомез, Л.; Виллалба, А.; Керкховен, РХ; Аполло, Е. Улога микроРНК у процесу имунитета равне остриге Остреа едулис против бона миозе. Инфецт. Генет. Евол. 2014, 27, 40–50. [ЦроссРеф] [ПубМед]

22. Ксу, Ф.; Ванг, Кс.; Фенг, И.; Хуанг, В.; Ванг, В.; Ли, Л.; Фанг, Кс.; Куе, Х.; Зханг, Г. Идентификација очуваних и нових микроРНК у пацифичкој остриги Црассостреа гигас дубоким секвенцирањем. ПЛоС ОНЕ 2014, 9, е104371. [ЦроссРеф]

23. Зхоу, З.; Ванг, Л.; Сонг, Л.; Лиу, Р.; Зханг, Х.; Хуанг, М.; Цхен, Х. Идентификација и карактеристике микроРНК повезаних са имунитетом у хемоцитима остриге Црассостреа гигас. ПЛоС ОНЕ 2014, 9, е88397. [ЦроссРеф] [ПубМед]

24. Бургос-Ацевес, МА; Цохен, А.; Смитх, И.; Фаггио, Ц. Потенцијална микроРНА регулација гена повезаних са имунитетом у хемоцитима бескичмењака. Сци. Тотал Енвирон. 2018, 621, 302–307. [ЦроссРеф]

25. Валкер, СЕ; Спенцер, ГЕ; Нецаков, А.; Царлоне, РЛ Идентификација и карактеризација микроРНА током регенерације централног нервног система мекушаца изазване ретиноинском киселином. Инт. Ј. Мол. Сци. 2018, 19, 2741. [ЦроссРеф] [ПубМед]

26. Або-Ал-Ела, ХГ; Фаггио, Ц. МикроРНА-посредовани одговор на стрес код врста шкољкаша. Ецотокицол. Енвирон. Саф. 2021, 208, 111442. [ЦроссРеф] [ПубМед]

27. Хуанг, С.; Иосхитаке, К.; Асадуззаман, М.; Киносхита, С.; Ватанабе, С.; Асакава, С. Откриће и функционално разумевање миРНА у мекушцима: приступ профилисању широм генома. РНА Биол. 2021, 18, 1702–1715. [ЦроссРеф]

28. Росани, У.; Бортолетто, Е.; Баи, Ц.-М.; Новоа, Б.; Фигуерас, А.; Вениер, П.; Фромм, Б. Копање миРНАома шкољки: између очувања и иновације. Пхилос. Транс. Р. Соц. Б 2021, 376, 20200165. [ЦроссРеф]

29. Сун, Кс.; Зханг, Т.; Ли, Л.; Ту, К.; Иу, Т.; Ву, Б.; Зхоу, Л.; Тиан, Ј.; Лиу, З. Потпис експресије микроРНА у пругастим и глатким адукторским мишићима Иессо капице Патинопецтен иессоенсис. Геномицс 2022, 114, 110409. [ЦроссРеф]

30. Тиан, Р.; Зхенг, З.; Хуанг, Р.; Јиао, И.; Ду, Кс. миР-29а је учествовао у формирању седефа и имунолошком одговору циљајући И2Р у Пинцтада мартенсии. Инт. Ј. Мол. Сци. 2015, 16, 29436–29445. [ЦроссРеф]

31. Цхен, Х.; Зхоу, З.; Ванг, Х.; Ванг, Л.; Ванг, В.; Лиу, Р.; Киу, Л.; Сонг, Л. МикроРНА специфична за бескичмењаке и имунолошки одговорна повећава фагоцитозу хемоцита острига циљајући ЦгИκБ2. Сци. Реп. 2016, 6, 1–10. [ЦроссРеф] [ПубМед]

32. Цхен, Х.; Зхоу, З.; Ванг, Л.; Ванг, Х.; Лиу, Р.; Зханг, Х.; Сонг, Л. МиРНА специфична за бескичмењаке циљала је на древни холинергични неуроендокрини систем острига. Отворите Биол. 2016, 6, 160059. [ЦроссРеф]

33. Цхен, Х.; Ксин, Л.; Сонг, Кс.; Ванг, Л.; Ванг, В.; Лиу, З.; Зханг, Х.; Ванг, Л.; Зхоу, З.; Киу, Л. МиРНА која реагује на норепинефрин директно промовише експресију ЦгХСП90АА1 у хемоцитима острига током исушивања. Рибље шкољке Иммунол. 2017, 64, 297–307. [ЦроссРеф] [ПубМед]

34. Хан, З.; Ли, Ј.; Ванг, В.; Ли, Ј.; Зхао, К.; Ли, М.; Ванг, Л.; Сонг, Л. Калмодулин на мети миРНА скеле659_26519 регулише експресију ИЛ-17 у раном имунолошком одговору острига Црассостреа гигас. Дев. Цомп. Иммунол. 2021, 124, 104180. [ЦроссРеф] [ПубМед]

35. Лв, З.; Ли, Ц.; Зханг, П.; Ванг, З.; Зханг, В.; Јин, Ц.-Х. миР-200 модулира антибактеријску активност целимоцита и ЛПС приминг путем циљања Толлип-а у Апостицхопус јапоницус. Рибље шкољке Иммунол. 2015, 45, 431–436. [ЦроссРеф]

36. Ли, Ц.; Зхао, М.; Зханг, Ц.; Зханг, В.; Зхао, Кс.; Дуан, Кс.; Ксу, В. миР210 модулира респираторни удар у целимоцитима Апостицхопус јапоницус преко циљаног рецептора сличног Толлу. Дев. Цомп. Иммунол. 2016, 65, 377–381. [ЦроссРеф]

37. Лв, М.; Цхен, Х.; Схао, И.; Ли, Ц.; Зханг, В.; Зхао, Кс.; Јин, Ц.; Ксионг, Ј. миР-92а регулише апоптозу целомоцита у морском краставцу Апостицхопус јапоницус циљањем на Ај14-3-3ζ ин виво. Рибље шкољке Иммунол. 2017, 69, 211–217. [ЦроссРеф]

38. Схао, И.; Ли, Ц.; Ксу, В.; Зханг, П.; Зханг, В.; Зхао, Кс. миР-31 повезује метаболизам липида и ћелијску апоптозу код Апостицхопус јапоницус изазваног бактеријама путем циљања ЦТРП9. Фронт. Иммунол. 2017, 8, 263. [ЦроссРеф]

39. Гуо, М.; Ванг, И.; Фу, Кс.; Тао, В.; Ли, Ц. цирцРНА1149 из Апостицхопус јапоницус потискује апоптозу целимоцита и делује као миР-92 сунђер за регулисање експресије Бак-а као одговор на инфекцију Вибрио сплендидус. Аквакултура 2023, 562, 738812. [ЦроссРеф]

40. Зуо, Х.; Венг, К.; Луо, М.; Ианг, Л.; Венг, С.; Хе, Ј.; Ксу, Кс. А МицроРНА-1-посредована инхибиција НФ-κБ пута путем ЈАК-СТАТ пута код бескичмењака Литопенаеус ваннамеи. Ј. Иммунол. 2020, 204, 2918–2930. [ЦроссРеф]

41. Ианг, Х.; Ксу, З.; Гуо, Б.; Зханг, Кс.; Лиао, З.; Ки, П.; Иан, Кс. Интегрисана анализа миРНАоме и транскриптома открива регулацију мреже миРНА-мРНК у дагњи ​​Митилус цорусцус зараженој дебелом шкољком Вибрио алгинолитицус. Мол. Иммунол. 2021, 132, 217–226. [ЦроссРеф] [ПубМед]

42. де Моралес, ЈМГР; Пуиг, Л.; Дауден, Е.; Цанете, ЈД; Паблос, ЈЛ; Мартин, АО; Јуанатеи, ЦГ; Адан, А.; Монталбан, Кс.; Борруел, Н. Критична улога интерлеукина (ИЛ)-17 у инфламаторним и имунолошким поремећајима: ажурирани преглед доказа који се фокусирају на контроверзе. Аутоиммун. Рев. 2020, 19, 102429. [ЦроссРеф] [ПубМед]

43. Кавагуцхи, М.; Адацхи, М.; Ода, Н.; Кокубу, Ф.; Хуанг, С.-К. ИЛ-17 породица цитокина. Ј. Аллерги Цлин. Иммунол. 2004, 114, 1265–1273. [ЦроссРеф] [ПубМед]

44. Старнес, Т.; Брокмеиер, ХЕ; Робертсон, МЈ; Хромас, Р. Врхунац: ИЛ-17Д, нови члан породице ИЛ-17, стимулише производњу цитокина и инхибира хемопоезу. Ј. Иммунол. 2002, 169, 642–646. [ЦроссРеф] [ПубМед]

45. Гаффен, СЛ; Крамер, ЈМ; Јеффреи, ЈИ; Схен, Ф. Породица ИЛ-17 цитокина. Витам. Хорм. 2006, 74, 255–282. [ПубМед]

46. ​​Робертс, С.; Гуегуен, И.; де Лоргерил, Ј.; Гоетз, Ф. Брзо накупљање транскрипта хомолога интерлеукина 17 у хемоцитима Црассостреа гигас након излагања бактеријама. Дев. Цомп. Иммунол. 2008, 32, 1099–1104. [ЦроссРеф] [ПубМед]

47. Ли, Ј.; Зханг, И.; Зханг, И.; Ксианг, З.; Тонг, И.; Ку, Ф.; Иу, З. Геномска карактеризација и анализа експресије пет нових ИЛ-17 гена у пацифичкој остриги, Црассостреа гигас. Рибље шкољке Иммунол. 2014, 40, 455–465. [ЦроссРеф]

48. Гаффен, СЛ Структура и сигнализација у породици ИЛ-17 рецептора. Нат. Рев. Иммунол. 2009, 9, 556–567. [ЦроссРеф]

49. Хата, К.; Андох, А.; Схимада, М.; Фујино, С.; Бамба, С.; Араки, И.; Окуно, Т.; Фујииама, И.; Бамба, Т. ИЛ-17 стимулише инфламаторне одговоре путем путева НФ-κБ и МАП киназе у хуманим миофибробластима дебелог црева. Сам. Ј. Пхисиол. -Гастроинтест. Ливер Пхисиол. 2002, 282, Г1035–Г1044. [ЦроссРеф]

50. Ниимото, Т.; Накаса, Т.; Исхикава, М.; Окухара, А.; Изуми, Б.; Деие, М.; Сузуки, О.; Адацхи, Н.; Оцхи, М. МикроРНА-146а експримира Т ћелије које производе интерлеукин-17 код пацијената са реуматоидним артритисом. БМЦ Мусцулоскелет. Дисорд. 2010, 11, 1–11. [ЦроссРеф]

52. Сривастава, А.; Никамо, П.; Лохцхароенкал, В.; Поклопац.; Меисген, Ф.; Ланден, НКС; Стахле, М.; Пиварцси, А.; Сонколи, Е. МицроРНА- 146а потискује ИЛ-17-посредовану упалу коже и генетски је повезана са псоријазом. Ј. Аллерги Цлин. Иммунол. 2017, 139, 550–561. [ЦроссРеф] [ПубМед]

52. Зхао, С.; Цхенг, И.; Ким, ЈГ микроРНА-146а смањује ниво ИЛ-17 и ИЛ-35 и инхибира пролиферацију матичних ћелија хуманог пародонталног лигамента. Ј. Целл. Биоцхем. 2019, 120, 13861–13866. [ЦроссРеф] [ПубМед]

53. Подсиад, А.; Стандифорд, ТЈ; Баллингер, МН; Еакин, Р.; Парк, П.; Кункел, СЛ; Мооре, ББ; Бхан, У. МикроРНА-155 регулише имуни одговор домаћина на поствирусну бактеријску пнеумонију путем ИЛ-23/ИЛ-17 пута. Сам. Ј. Пхисиол. -Плућна ћелија. Мол. Пхисиол. 2016, 310, Л465–Л475. [ЦроссРеф]

54. Ксаус, Ј.; Цомалада, М.; Валледор, АФ; Ллоберас, Ј.; Лопез-Сориано, Ф.; Аргилес, ЈМ; Богдан, Ц.; Целада, А. ЛПС индукује апоптозу у макрофагима углавном кроз аутокрину производњу ТНФ-а. Блоод Ј. Ам. Соц. Хематол. 2000, 95, 3823–3831.

55. Баннерман, ДД; Голдблум, СЕ Механизми ендотелне апоптозе изазване бактеријским липополисахаридом. Сам. Ј. Пхисиол.-Лунг Целл. Мол. Пхисиол. 2003, 284, Л899–Л914. [ЦроссРеф]

56. Брасс, ДМ; Холлингсвортх, ЈВ; Цинкуе, М.; Ли, З.; Поттс, Е.; Толоза, Е.; Фостер, ВМ; Сцхвартз, ДА Хронична инхалација ЛПС-а изазива промене налик емфизему у плућима миша које су повезане са апоптозом. Сам. Ј. Респир. Целл Мол. Биол. 2008, 39, 584–590. [ЦроссРеф]

57. Драгон, С.; Саффар, АС; Схан, Л.; Гоунни, АС ИЛ-17 умањује анти-апоптотичке ефекте ГМ-ЦСФ у људским неутрофилима. Мол. Иммунол. 2008, 45, 160–168. [ЦроссРеф] [ПубМед]

58. Зху, Ф.; Ванг, К.; Гуо, Ц.; Ванг, Кс.; Цао, Кс.; Схи, И.; Гао, Ф.; Ма, Ц.; Зханг, Л. ИЛ-17 индукује апоптозу васкуларних ендотелних ћелија – потенцијални механизам за хумани акутни коронарни синдром. Цлин. Иммунол. 2011, 141, 152–160. [ЦроссРеф]

59. Цханг, И.; Ал-Алван, Л.; Аудуссеау, С.; Цхоуиали, Ф.; Царлеваро-Фита, Ј.; Ивакура, И.; Баглоле, ЦЈ; Еиделман, ДХ; Хамид, К. Генетска делеција ИЛ-17А смањује упалу изазвану димом цигарете и апоптозу алвеоларних ћелија типа ИИ. Сам. Ј. Пхисиол. -Плућна ћелија. Мол. Пхисиол. 2014, 306, Л132–Л143. [ЦроссРеф]

60. Хоу, В.; Јин, И.-Х.; Канг, ХС; Ким, БС Интерлеукин-6 (ИЛ-6) и ИЛ-17 синергистички промовишу перзистентност вируса инхибирајући ћелијску апоптозу и функцију цитотоксичних Т ћелија. Ј. Вирол. 2014, 88, 8479–8489. [ЦроссРеф]

61. Ванг, К.; Поклопац.; Хан, И.; Динг, Кс.; Ксу, Т.; Танг, Б. МикроРНА-146 штити ћелије А549 и Х1975 од апоптозе изазване ЛПС-ом и повреде инфламације. Ј. Биосци. 2017, 42, 637–645. [ЦроссРеф] [ПубМед]

62. Цхен, И.; Ву, З.; Иуан, Б.; Донг, И.; Зханг, Л.; Зенг, З. МикроРНА-146а-5п смањује активацију звездастих ћелија јетре изазвану зрачењем и ЛПС-ом и апоптозу хепатоцита кроз инхибицију ТЛР4 пута. Целл Деатх Дис. 2018, 9, 1–16. [ЦроссРеф] [ПубМед]

63. Динг, И.; Ванг, Л.; Зхао, К.; Ву, З.; Конг, Л. МикроРНА-93 инхибира апоптозу и упалу хондроцита код остеоартритиса циљајући ТЛР4/НФ-κБ сигнални пут. Инт. Ј. Мол. Мед. 2019, 43, 779–790. [ЦроссРеф]

64. Ван, Г.; Било који.; Тао, Ј.; Ванг, И.; Зхоу, К.; Ианг, Р.; Лианг, К. МицроРНА-129-5п ублажава повреду кичмене мождине код мишева сузбијањем апоптозе и инфламаторног одговора путем ХМГБ1/ТЛР4/НФ-κБ пута. Биосци. Реп. 2020, 40, БСР20193315. [ЦроссРеф] [ПубМед]

65. Ке, Кс.-Ф.; Фанг, Ј.; Ву, Кс.-Н.; Иу, Ц.-Х. МикроРНА-203 убрзава апоптозу у алвеоларним епителним ћелијама стимулисаним ЛПС-ом циљајући ПИК3ЦА. Биоцхем. Биопхис. Рес. Цоммун. 2014, 450, 1297–1303. [ЦроссРеф] [ПубМед]

66. Ки, П.; Танг, З. Молекул Нрф2 покреће антиоксидативну одбрану од акутног излагања бензо(а)пирену у шкољки Митилус цорусцус. Акуат Токицол 2020, 226, 105554. [ЦроссРеф]

67. Сцхмиттген, ТД; Ливак, КЈ Анализа ПЦР података у реалном времену компаративном ЦТ методом. Нат. Протоц. 2008, 3, 1101–1108. [ЦроссРеф]