Експресија неуронске синтазе азот-оксида и ренина у диспластичним бубрезима младих паса

АПСТРАКТАН.

Ренин инеуронска синтаза азот оксидау бубрезима контролишуренин-ангиотензинитубулогломеруларни повратни системи. Ова студија је истраживала експресију ренина и неуронасинтаза азот оксидаудиспластични бубрезиод три млада пса. Ренинимунореактивност, која се јавља у јукстагломеруларним и тубуларним ћелијама диспластичних бубрега, није се разликовала од оне у нормалним бубрезима младих паса. Ћелије густе макуле у нормалним бубрезима показале су неуроналну имунореактивност синтазе азот оксида, али оне у диспластичним бубрезима нису показале очигледне сигнале. Ово запажање може бити повезано са патолошким механизмима бубрежне инсуфицијенције код младих паса.

КЉУЧНЕ РЕЧИ: хронична болест бубрега, диспластични бубрег, имунохистохемија, неуронска синтаза азот оксида, ренин

Отказивање бубрегаповремено се јавља код младих паса. У таквим случајевима, хистолошки преглед често показује диспластичне лезије бубрега. Међутим, патофизиолошки механизми који се јављају у диспластичним бубрезима паса остају нејасни. Недавно смо демонстрирали слабљење циклооксигеназе (ЦОКС)-2 код хроничних болести бубрега код младих паса са диспластичним бубрезима помоћу имунохистохемијске анализе [19].

Цистанцхе Супплемент СуппортДодатак за функцију бубрега

ЦОКС-2 је индуцибилни инфламаторни ензим који је неопходан за нормалан развој бубрега у феталном и неонаталном стадијуму [12, 15]. Након рођења, ЦОКС-2 је конститутивно изражен у бубрегу и концентрисан је у ограниченом подручју мацула денса (МД) дебелих узлазних удова [1, 4, 22]. МД је специјализована регија поред васкуларног пола гломерула. Он контролише секрецију ренина и тубулогломеруларни систем повратне спреге (ТГФ). ЦОКС-2 експримиран у МД ћелијама регулише ове механизме [6, 8]. Поред ЦОКС-2, неуронска синтаза азот оксида (нНОС), која је такође експримирана у МД ћелијама, позната је као главни регулатор ТГФ система [3, 18]. Познато је да ова два молекула, који су ко-експримирани у МД, међусобно делују [2, 5, 9]. У овој студији, истраживали смо експресију ренина и нНОС у диспластичним бубрезима имунохистохемијом да бисмо утврдили да ли слабљење ЦОКС-2 у диспластичним бубрезима изазива поремећај ренин-ангиотензин система и ТГФ система код младих паса.

Формалином фиксирани парафински блокови диспластичних бубрега младих паса (н=3), нормалних бубрега младих паса (н=3) и нормалних бубрега одраслих паса (н=4) су исти као они коришћени у нашој претходној студији, у којој су претходно описани клиничка историја и припрема ткива [19]. Студију је одобрио Комитет за експериментисање на животињама Универзитета Кагошима, Јапан (ВМ15020). Секције су припремљене дебљине 3-µм, а имунохистохемијска анализа на ренин и нНОС је обављена према следећим протоколима: (1) депарафинизација; (2) узимање антигена микроталасним загревањем у 10 мМ цитратног пуфера (пХ 6,0) за нНОС; (3) инкубација са 3% Х2О2 током 30 мин; (4) блокирање са 3% говеђег серумског албумина (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, УСА) за ренин или 0,25% казеина (Сигма-Алдрицх) за нНОС, разблаженог у физиолошком раствору пуферованог фосфатом, током 30 мин; (5) инкубација преко ноћи на 4 степена са 1:3,000 разблажењем зечјег антирекомбинантног ренин поликлонског антисерума (добавља др Мураками, Универзитет Цукуба, Јапан) или 1:3,{{32 }} разблаживање зечјег анти-нНОС поликлонског антисерума (Цаиман Цхемицал, Анн Арбор, МИ, САД), у раствору за блокирање; (6) инкубација 30 минута на собној температури са универзалним антителом коњугованим пероксидазом-полимером (анти-мишји имуноглобулин (Иг) Г и анти-зечји ИгГ; једноставна боја МАКС-ПО [МУЛТИ]; Ницхиреи Биосциенцес, Токио, Јапан) ; и (7) детекција имуносигнала коришћењем 3,3'-диаминобензидин система (3,3'-диаминобензидин пуфер таблета; Мерцк, Дармстадт, Немачка). За секције негативне контроле, нормалан зечји ИгГ (Лаб Висион, Фремонт, Калифорнија, САД) је коришћен уместо примарног антитела.

Слика 1. Имунохистохемија за ренин у диспластичном псећем бубрегу. О: Ренин-позитивни сигнали су примећени у јукстагломеруларним ћелијама близу васкуларних полова и неким гломеруларним ћелијама (стрелице). Шипка: 50 µм. Б: Различити регион пресека је приказан на панелу А. Тубули у неидентификованом сегменту нефрона показују имунореактивност на ренин. Шипка: 50 µм.

Рандомизована морфометријска анализа имунореактивности ренина урађена је према претходно описаној методи [20]. Укратко, ренин индекс је дефинисан као однос укупног броја ренин позитивних артериола према укупном броју гломерула и изражен на 100 гломерула. Разлике између група су анализиране коришћењем Бонферонијеве методе вишеструког поређења са СПСС верзијом 24 (ИБМ СПСС Статистицс, Армонк, Њујорк, САД).

Хистопатолошка дијагноза је урађена према микроскопским критеријумима дисплазије бубрега код паса Пицута и Левиса [14]. Хистолошки пресеци сва три случаја су показали асинхрону диференцијацију, што указује на присуство лезија са феталним/незрелим гломерулима. Секундарне промене променљиве тежине, као што су оштећење тубула, интерстицијална фиброза и склеротични гломерули, примећене су у зрелим бубрежним ткивима.

У диспластичним бубрезима, сигнали ренин-имунореактивности су примећени у јукстагломеруларним ћелијама (ЈГЦ) (слика 1А), а тубуларне ћелије су лоциране у дисталним нефронима (слика 1Б). У неким гломерулима, неколико ћелија је показало ренин-позитивне сигнале у близини васкуларних полова (слика 1А). У младим контролним бубрезима, сигнали ренина су такође откривени у ЈГЦ и дисталним тубулима, укључујући МД ћелије. У контролним бубрезима одраслих, ренин-позитивни сигнали су били ограничени на ЈГЦ. Статистички, број ренин-позитивних подручја у диспластичним бубрезима није показао значајне разлике у односу на оне код младих и одраслих бубрега.

Познато је да стимулација производње ренина игра улогу у ЦОКС-2 сигнализацији, а претходне студије су показале да су активност и концентрација ренина у плазми смањене након давања инхибитора ЦОКС-2 или у нокауту ЦОКС -2 ген [10, 11]. Пошто диспластични бубрези испитани у овој студији нису показали експресију реналног ЦОКС-2 [19], на смањење имуносигнала ренина у ЈГЦ се првобитно сумњало као могућа физиолошка абнормалност у диспластичним бубрезима. Међутим, садашња имунохистохемијска анализа није могла потврдити ову хипотезу и није предложено очигледно смањење ренина у ЈГЦ. Иако физиолошка улога тубуларног ренина није раније разјашњена, бубрежно руковање натријумом може бити могућа улога тубуларног ренина, пошто је појачање експресије ренина индуковано у дисталном нефрону након храњења пацова исхраном са мало соли. [16], а диспластични бубрези паса који су испитивани у овој студији можда су одржавали ову тубуларну функцију.

ЦОКС-2 је такође важан у регулацији ТГФ система, који је важан за одржавање брзине гломеруларне филтрације. Студија на пацовима методом микропунктуре показала је супресију ТГФ одговора након третмана ЦОКС-2 инхибитором [2]. ТГФ одговор у диспластичним бубрезима може бити ослабљен услед недостатка експресије ЦОКС-2 у бубрезима. Међутим, никакви релевантни налази нису раније пријављени. У бубрезима, нНОС се експримира у МД ћелијама и помаже у регулацији ТГФ система [18].

У садашњој нНОС анализи, нису откривени очигледни сигнали у МД регионима свих случајева (слика 2). Ово смањење нНОС се сматрало етиопатогеним догађајем у диспластичним бубрезима, а не стеченим након бубрежне инсуфицијенције у случајевима. Наша претходна студија која је користила ОЛЕТФ (Отсука Лонг-Еванс Токусхима Фатти) пацове, као модел дијабетеса типа 2, показала је да је нНОС прекомерно експримиран у МД и око тубуларних ћелија у каснијој фази дијабетичке нефропатије [21]. У регулацији ТГФ система, функција нНОС је слична и у интеракцији је са функцијом ЦОКС-2. Неке студије сугеришу да је нНОС позициониран узводно од сигналног пута и стимулише експресију ЦОКС-2 [5, 9]. С друге стране, друге студије сугеришу супротно да је ЦОКС-2 позициониран узводно од НОС [2, 13]. Без обзира на разлику у сигналном путу, недостатак нНОС-имуносигнала у МД ћелијама може изазвати смањење експресије ЦОКС-2 бубрега у диспластичним бубрезима.