ФГИН-1-27 је синтетички рецептор за инхибитор везивања митохондрија диазепама (МДР)агонист који је показао про-апоптотичку, анти-анксиозну и стероидогену активносту разним студијама. Овде извештавамо, запрвивреме, анти-меланогена ефикасностофФГИН{0}}ин витроиин виво. ФГИН-1-27 значајноинхибирани базални и - хормон који стимулише меланоците ( -МСХ)-, 1-Олеоил-2-ацетил-сн-глицерол (ОАГ)-и меланогенеза изазвана ендотелином-1 (ЕТ-1) без ћелијске токсичности.Тест активности тирозиназе печурака показао је да ФГИН-1-27 није директно инхибираоактивност тирозиназе, што сугерише да ФГИН-1-27 није био директан инхибитор тирозиназе. Иако није могао да модулише каталитичку активносттирозиназа печуракаин витро, ФГИН{0}} је смањио нивое експресијекључни протеини који функционишу у меланогенези. ФГИН-1-27 је играо ове функцијепотискивањем ПКА/ЦРЕБ, ПКЦ- , и МАПК путеви. Једном деактивиран, онсмањио експресију МИТФ, тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2 и инхибираоактивност тирозиназе,коначноинхибирање меланогенезе. У токуин вивоексперименти,ФГИН-1-27 је инхибирао пигментацију тела зебрицеи смањене УВБ-индукованехиперпигментација на кожи заморца, али не и смањење броја меланоцита.Нашеналазимапоказало је да ФГИН-1-27 не показује цитотоксичност и инхибирамеланогенеза у обаин витроиин вивомодели. Може се показати прилично корисним као асигурније средство за избељивање коже.

Према релевантним студијама,цистанцхеје уобичајена биљка која је позната као "чудотворна биљка која продужава живот". Његова главна компонента је цистанозид, који има различите ефекте као нпрантиоксиданс, антиинфламаторнои унапређење имунолошке функције. Механизам између цистанче иизбељивање кожележи у антиоксидативном дејству цистанх гликозида.Меланину људској кожи настаје оксидацијом тирозина катализованом одтирозиназе, а реакција оксидације захтева учешће кисеоника, тако да радикали без кисеоника у телу постају важан фактор који утиче на производњу меланина. Цистанцхе садржи цистанозид, који је антиоксидант и може смањити стварање слободних радикала у телу, такоинхибирање производње меланина.

Кликните на Цистанцхе Тубулоса

За више информација: david.deng@wecistanche.com ВхатАпп:86 13632399501

УВОД

Меланогенеза је најважнија функција меланоцита у кожи. Неколико критичних фактора који укључују меланогенезу је разјашњено (Рапосо и Маркс, 2007; Ногуцхи ет ал., 2014). Кључни ензим који регулише меланогенезу је тирозиназа и делује са протеином 1 (ТРП1) и протеином 2 (ТРП2) сродним тирозинази (Зху ет ал., 2015). Други важан фактор укључен у пигментацију је фактор транскрипције повезан са микрофталмијом (МИТФ), који не само да регулише пролиферацију и преживљавање меланоцита, већ и регулише експресију тирозиназе, ТРП1 и ТРП2 (Кавасаки ет ал., 2008; Леви и Фисхер, 2011. ). Еколошки стимуланси, као што је ултраљубичасто (УВ) зрачење, играју кључну улогу у меланогенези (Абдел-Насер ет ал., 2003). Након излагања УВ зрачењу, активирани кератиноцити и меланоцити производе хормон који стимулише меланоците (-МСХ), диацилглицерол (ДАГ) и ендотелин-1 (ЕТ-1) (Д'Мелло ет ал., 2016; Бае Харбое и Парк, 2012). Када се -меланоцит-стимулишући хормон (-МСХ) веже за меланокортин-1 рецептор (МЦ1Р) у меланоцитима, може повећати интрацелуларне нивое цикличног аденозин монофосфата (цАМП) и активирати протеин киназу А (ПКА)/ (ЦРЕБ ) пут, коначно промовишући меланогенезу (Цорре ет ал., 2004; Рзепка ет ал., 2016). Диацилглицерол (ДАГ) је неопходан за активацију протеин киназе Ц- (ПКЦ-) у меланоцитима, што повећава активност тирозиназе и изазива пигментацију (Ким ет ал., 2006; Кавагуцхи ет ал., 2012; Иуан и Јин, 2018. ). 1-Олеоил-2- ацетил-сн-глицерол (ОАГ) је синтетички, мембрански пермеабилни ДАГ аналог који се интензивно користи као фармаколошки активатор ПКЦ- (Раинбов ет ал., 2011). Ендотелин-1 (ЕТ- 1) индукује меланогенезу у меланоцитима путем активације пута протеин киназе активиране митогеном (МАПК) (Парк ет ал., 2015; Регаззетти ет ал., 2015).

Меланин игра важну улогу у заштити коже од штетних ефеката ултраљубичастог зрачења, као што су рак коже и старење (Сломински ет ал., 2004). Ипак, прекомерна производња и абнормална акумулација меланина доводе до естетских проблема на кожи, као што су мелазма, пеге и тамне флеке (Јадотте и Сцхвартз, 2010). Неколико активних једињења за избељивање, укључујући којичну киселину и арбутин, већ су одобрени као козметички адитиви (Ким ет ал., 2008). Међутим, пријављено је да арбутин има цитотоксичне ефекте и којична киселина може да изазове рак (Сингх ет ал., 2016). Стога је откриће ефикаснијих и сигурнијих средстава за избељивање коже најважније.

Рецептор инхибитора везивања митохондрија диазепама (МДР) игра централну улогу у регулацији синтезе липида и стероида и широко је дистрибуиран у периферним ткивима укључујући кожу (Алхо ет ал., 1993). У нашим претходним студијама, диазепам, један МДР агонист, регулисао је пигментацију путем ПКА/ЦРЕБ пута (Лв ет ал., 2019). Штавише, недавни налази сугеришу да је активација МДР-а незнатно повећала број нових меланоцита код зебрица (Аллен ет ал., 2020). У поређењу са диазепамом, ФГИН-1-27 (Н,Н-дихексил-2-(4-флуорофенил)индол-3- ацетамид) показује релативно већи афинитет и специфичност за МДР (Фрееман и Иоунг, 2000). ФГИН-1–27 је показао про-апоптотичку и стероидогену активност (Лацапере и Пападопоулос, 2003). Недавно је објављено да је ФГИН-1-27 произвео анти-анксиозне и антипаничне ефекте ин виво (Лима-Макимино ет ал., 2018). Међутим, ефекат ФГИН-1-27 на пигментацију ин витро и ин виво није пријављен.

МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДЕ

Материјали

ФГИН-1-27(Н,Н-дихексил-2-(4-флуорофенил)индол-3-ацетамид), ОАГ (1-Олеоил-2-ацетил-сн -глицерол), и антитела против ПКЦ- (1:200), п-ПКА мачка (фосфо Т197)(1:200), ПКА мачка (1:500), п-ЦРЕБ (1:200), ЦРЕБ(1:200), п-ЕРК(1:200), ЕРК (1:200), п-п38 (1:200), п38 (1:200), п-ЈНК (1:200),и ЈНК (1:200) добијени су од Санта Цруз Биотецхнологи(Калифорнија, САД). тирозиназа из печурака, -МСХ, ЕТ-1(Ендотелин-1) и ПТУ(Н-фенилтиоуреа) су добијенииз Аладина (Шангај, Кина). Антитела противтирозиназа (1:1,000), ТРП-1(1:1,000), ТРП-2 (1:1,000), МИТФ(1:2000), и -актин (1:3,000) добијени су од Абцам-а(Кембриџ, Велика Британија). Массон-Фонтана раствор за бојење меланинаје купљен од СенБеиЈиа Биологицал Тецхнологи (Нањинг,Кина). РТ-кПЦР комплети су купљени од Такара БиомедицалТехнологија (Пекинг, Кина). Пуфер за лизу ћелија и БЦА протеинкомплет за тестирање добијен је од Беиотиме Биотецхнологи (Шангај,Кина).

Целлс Цултуре

Тест виталности ћелија

Вијабилност СК-МЕЛ-2 ћелија и ХЕМ мерена је МТТ тестом (Зхоу ет ал., 2014). СК-МЕЛ-2 ћелије и ХЕМ су респективно постављене у плоче са 96-бунарићима при густини од 2×104 ћелија по бунарчићу. ФГИН-1-27 (0, 1, 2, 4, 8, 16 μМ) је примењен на СК-МЕЛ-2 ћелије и ХЕМ током 48 сати. МТТ раствор (20 μЛ) је додат у сваки бунар 96- плоче бунара још 4 х. Након уклањања раствора, ДМСО (200 μЛ) је додат у сваки бунар и апсорбанца је испитана на 570 нм коришћењем спектрофотометра за микроплоче (БиоТек Инструментс).

Меланин Ассаи

СК-МЕЛ-2 ћелије и ХЕМ су респективно постављене у 6-плоче у концентрацији од 5×105 ћелија по бунарчићу. После 24 х инкубације на 37 степени, ФГИН-1-27 (0, 1, 2, 4 μМ) је примењен на СК-МЕЛ-2 ћелије и ХЕМ. Ћелије су инкубиране још 48 х, испране са ПБС, након чега је уследила лиза са пуфером за лизу ћелија током 20 минута на 4 степена Ц, а лизати су центрифугирани на 13,000 рпм током 10 минута на 4 степена Ц. Укупни меланин у ћелијској пелети је растворен у 100 μЛ раствора НаОХ (1 мол/Л, који садржи 10 процената ДМСО) на 80 степени Ц током 1 х (Лв ет ал., 2015). Оптичка апсорбанца је мерена на 405 нм коришћењем спектрофотометра за микроплоче (БиоТек Инструментс).

Тест активности тирозиназе

Активност ћелијске тирозиназе је спроведена као што је претходно описано (Лв ет ал., 2020). СК-МЕЛ-2 ћелије су инкубиране са различитим концентрацијама ФГИН-1-27 (0, 1, 2, 4 μМ) или ОАГ (200 μМ) током 12 х или 48 х, а затим лизиране са пуфером за лизу ћелија. Ћелијски лизати су центрифугирани на 13,000 рпм током 10 минута на 4 степена Ц да би се добио супернатант за тест активности тирозиназе. Концентрације протеина су одређене помоћу БЦА комплета са говеђим серум албумином (БСА) као стандардом. 100 μЛ ПБС (0,1 М, пХ 6,5) који садржи 30 уг протеина помешаних са 100 μЛ Л-ДОПА (0,1 проценат ) и затим инкубирано на 37 степени. Ц током 1 х. Оптичка апсорбанца је мерена на 475 нм коришћењем спектрофотометра за микроплоче (БиоТек Инструментс).

Директан ефекат ФГИН{{0}} на активност тирозиназе спроведен је у складу са претходном методом (Томита ет ал., 2010; Лв ет ал., 2020). 100 μЛ ПБС (0,1 М, пХ 6,5) који садржи различите концентрације ФГИН-1-27 помешаног са тирозиназом печурака (10 јединица) и 50 μЛ Л-тирозина (0,05 процената) и затим инкубирано на 37 степени током 10 минута. Оптичка апсорбанца је мерена на 475 нм коришћењем спектрофотометра за микроплоче (БиоТек Инструментс).

Массон–Фонтана бојање сребром амонијаком

За детекцију пигмента меланина, ћелије СК-МЕЛ-2 су постављене на 6-плочу са бунарчићима која садржи 13-мм покровне стакалце у 2.0 мл медијума за културу (10 процента феталног говеђег серума) у сваки бунар. 48 х након примене, ћелије су фиксиране са формалином (10 посто неутралног пуфера) током 20 мин.

Ћелије и предмети коже су обојени према Массон–Фонтана методи бојења амонијачним сребром (Лее ет ал., 2013). Ћелије и плочице коже су инкубиране са Массон-Фонтана раствором за бојење меланина 16 х на собној температури. Затим су ћелије и плочице коже испране дестилованом водом 3 пута и инкубиране са хипо раствором 7 минута. Након темељног прања у дестилованој води, ћелије и стакалца коже су обојени неутралном црвеном мрљом током 7 минута. Ћелије и препарати коже су посматрани помоћу Никон Ти2-У микроскопа.

Имунохистохемија за С-100

С-100 имунохистохемија је спроведена као што је претходно описано (Лее ет ал., 2013). Ставке су блокиране са 5 процената БСА током 1 сата на собној температури, а затим инкубиране у анти-С-100 примарном антителу (Дако, Царпентариа, ЦА) разблаженим у раствору за блокирање преко ноћи на 4 степена Ц. Следећег дана, слајдови су су опрани ТБСТ 4 пута и инкубирани са секундарним антителом (Дако, Царпентариа, ЦА). Затим су дијапозитиви третирани аминоетил карбазолом да би се развили пресеци. Стакалца коже су посматрана коришћењем Никон Ти2-У микроскопа.

Реверзна транскрипција – квантитативни ПЦР (РТ-кПЦР)

РТ-кПЦР је спроведен као што је претходно описано (Лв ет ал., 2020). Укратко, укупна РНК ћелија СК-МЕЛ-2 је екстрахована коришћењем ТРИзол реагенса и квантификована спектрофотометријски. Једноланчана цДНК је синтетизована коришћењем СуперСцрипт ИИ реверзне транскриптазе према упутствима произвођача. СИБР-Греен квантитативна ПЦР анализа је изведена са АБИ ПРИСМ системом за детекцију секвенци (Апплиед Биосистемс) и претходно валидираним сетовима прајмера. Сви узорци су рађени у три примерка. Циклуси прага су смештени у логаритамски део криве амплификације, а резултати су нормализовани на ГАПДХ. Разлика у прегибу између два узорка одређена је делта-делта Цк методом. Секвенце прајмера Митф гена су 5′-АГАГЦАГГГЦАГАГАГТГАГТГ-3′, 5′-ААЦТТГАТТ ЦЦАГГЦТГАТГАТГТЦ-3′.

Вестерн блот анализа

Суспензија протеина је добијена према горе поменутом поступку. Екстраховани интрацелуларни протеини (30 уг) су раздвојени помоћу СДС-ПАГЕ (10 процената) и затим пребачени на мембрану од поливинилиден Л флуорида (ПВДФ), пратећи стандардни протокол за влажни трансфер. Мембрана је блокирана коришћењем 2,5 процената БСА на собној температури током 1 х, изложена одговарајућим примарним антителима на 4 степена Ц преко ноћи и испрана ТБСТ 4 пута. Мембране су биле изложене ХРП-означеним козјим анти-зечјим ИгГ (1:1,000) или козјим анти-мишјим ИгГ (1:1,000) на собној температури 1 х и испране са ТБСТ 4 пута (Лиао ет ал., 2017). Мембране су затим визуализоване коришћењем мултифункционалног система за хемилуминисценцију (Танон 4600). Унутрашње контроле из истог блота испитане су антиактином.

Процена заснована на фенотипу и одређивање садржаја меланина у зебри

Одрасле зебрице су држане у резервоару са следећим условима: 28,5 степени, са циклусом светлости/мрака од 14/10 х. Ембриони су добијени природним мријешћењем које је индуковано ујутру паљењем свјетла. Сакупљање ембриона је завршено у року од 30 минута. Процена заснована на фенотипу је спроведена као што је претходно описано (Цхои ет ал., 2007). Укратко, синхронизовани ембриони су сакупљени и поређани пипетом (3-4 ембриона по бунарчићу у 96- плочама са бунарима које садрже 200 ул медијума ембриона). ФГИН-1-27 и ПТУ су растворени у 0,1 проценту ДМСО, а затим додати у медијум ембриона од 35 до 60 х (излагање 25 х). Под стереомикроскопом уочени су ефекти на меланогенезу зебрице.

Модел заморца изазване хиперпигментацијом изазване УВБ зракама

Осам смеђих замораца (6 недеља, отприлике 300 г) добијено је са Института за лабораторијске науке о животињама (Пекинг, Кина). Заморци су смештени појединачно у просторији са контролисаном температуром у стандардним лабораторијским условима, са циклусом од 12 х светлости/12 х таме (светла од 9:00 до 21:00 поподне) са константна температура (23 ± 3 степена) и влажност (50 ± 10 процената). Одвојене области (круг дијаметра 1 цм) леђа сваке животиње су биле изложене 500 мЈ/цм2 УВБ (Сигма СХ-4, Шангај, Кина) једном дневно током 1 недеље (Фујимото ет ал., 1988; Лее ет ал., 2013). Затим су носач (ПЕГ400/ ЕтОХ 7:3) и ФГИН-1-27 (1 проценат) давани хиперпигментираним подручјима (20 ул раствора по кругу) два пута дневно током 3 недеље. Степен пигментације је мерен спектрофотометром (ИС3010, 3нх, Шенжен, Кина). ΔЛ-вредност је одређена према Л-вредности измереној спектрофотометром, на следећи начин: ΔЛ Л (сваког мереног дана)-Л (на дан 0). Све процедуре на животињама за ову студију спроведене су у складу са "Водичем за негу и употребу лабораторијских животиња" и одобрене од стране одбора за негу и употребу животиња Универзитета Чангџоу.

Статистичка анализа

РЕЗУЛТАТИ

ФГИН-1-27 инхибирана синтеза меланина индукована -МСХ, ОАГ или ЕТ-1- у СК-МЕЛ-2 ћелијама

Пре истраживања ефеката ФГИН-1-27 (Слика 1А) на пигментацију, извршен је тест виталности ћелија да би се испитали ефекти ФГИН-1-27 на раст ћелија СК-МЕЛ-2. Као што је приказано на слици 1Б, ФГИН-1-27 није имао утицаја на раст СК-МЕЛ- 2 ћелија у опсегу дозирања од 1–16 μМ након 48 х. У тесту садржаја меланина, ФГИН-1-27 је инхибирао базалну меланогенезу (слика 1Ц). -МСХ је подизач интрацелуларног цАМП, који значајно индукује меланогенезу (Рзепка ет ал., 2016; Цорре ет ал., 2004; Лее ет ал., 2013). ФГИН-1-27 је такође инхибирао -МСХ-индуковану синтезу меланина (Слика 1Ц). Доследно, Массон–Фонтана амонијачно сребрно бојење је показало да је ФГИН-1-27 значајно смањио концентрацију меланина у СК-МЕЛ-2 ћелијама са или без -МСХ (Слика 1Д). Штавише, ОАГ је подизач ПКЦ, а ЕТ-1 је активатор МАПК пута, а оба могу да промовишу синтезу меланина (Ким ет ал., 2006; Парк ет ал., 2015; Регаззетти ет ал., 2015). Као што је приказано на сликама 1Е и 1Ф, ФГИН-1-27 је такође значајно инхибирао ОАГ или ЕТ-1-индуковану меланогенезу.

ФГИН-1-27 је потиснуо експресију тирозиназе, ТРП-1, ТРП-2 и смањио активност ћелијске тирозиназе

Меланогенезу контролишу три критична ензима: тирозиназа, ТРП-1 и ТРП-2 (Зху ет ал., 2015). -МСХ и ЕТ-1 су промовисали синтезу меланина повећањем експресије три кључна меланогена ензима (Регаззетти ет ал., 2015; Лее ет ал., 2013). Да бисмо истражили да ли су ефекти избељивања ФГИН-1-27 повезани са експресијом ових протеина, проучавали смо ефекат ФГИН-1-27 на експресију тирозиназе, ТРП-1 и ТРП{{10 }} путем Вестерн-блот анализе. Као што је приказано на слици 2А, ФГИН-1-27 је потиснуо експресију тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2 са или без -МСХ. ФГИН-1-27 је такође доследно преокренуо повећање експресије тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2 изазване ЕТ-1- (слика 2Б). За разлику од -МСХ и ЕТ-1, ОАГ је промовисао меланогенезу директним повећањем активности ћелијске тирозиназе (Д'Мелло ет ал., 2016). Као што је приказано на сликама 2Ц и 2Д, третман ФГИН-1-27 током 12 х инхибирао је повећање активности ћелијске тирозиназе изазвано ОАГ-ом и није утицао на експресију тирозиназе. Поред тога, спроведен је тест активности тирозиназе у печуркама да би се испитали директни ефекти ФГИН-1-27 на активност тирозиназе. Као што је приказано на слици 2Е, ФГИН-1-27 није утицао на ензимске активности тирозиназе печурака. Ови резултати сугеришу да је ФГИН-1-27 потиснуо експресију тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2 и смањио активност ћелијске тирозиназе, али није имао директан утицај на ензимске активности тирозиназе.

ФГИН{0}} је смањио МИТФ израз

МИТФ је главни транскрипциони фактор који индукује експресију тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2 (Кавасаки ет ал., 2008; Леви и Фисхер, 2011). Као што је приказано на слици 3А, ФГИН-1-27 је инхибирао МИТФ транскрипцију. Такође смо измерили експресију МИТФ након што су СК-МЕЛ-2 ћелије третиране са -МСХ у присуству или одсуству ФГИН-1-27. Као што је приказано на слици 3Б, -МСХ је значајно промовисао експресију МИТФ. Занимљиво је да се експресија МИТФ-а значајно смањила у присуству ФГИН-1-27. ФГИН-1-27 је такође доследно потискивао повећање МИТФ експресије изазвано ЕТ-1- (слика 3Ц). Ови резултати сугеришу да је ФГИН{16}} инхибирао експресију МИТФ-а.

ФГИН-1-27 је смањио експресију ПКЦ-, п-ПКА Цат, п-ЦРЕБ, п-п38 и п-ЕРК

ПКА, ПКЦ и МАПК су критични путеви трансдукције у меланогенези (Д'Мелло ет ал., 2016). Други гласник цАМП би могао да активира ПКА, који фосфорилише ЦРЕБ, коначно промовишући експресију МИТФ (Цорре ет ал., 2004; Рзепка ет ал., 2016). Пут зависан од ПКЦ- -регулише меланогенезу кроз активацију тирозиназе (Ким ет ал., 2006; Кавагуцхи ет ал., 2012; Иуан и Јин, 2018). МАПК, укључујући п38, протеин киназу регулисану екстрацелуларним сигналом (ЕРК) и ц-јун Н-терминалну киназу (ЈНК), пријављено је да регулише пигментацију (Зхоу ет ал., 2014). Да бисмо даље разумели молекуларне механизме регулације меланогенезе помоћу ФГИН-1-27, измерили смо путеве трансдукције укључене у пигментацију. Као што је приказано на слици 4, ФГИН-1-27 је значајно смањио експресију ПКЦ-, п-ПКА цат, п-ЦРЕБ, п-п38 и п-ЕРК.

ФГИН{0}} је инхибирао меланогенезу у људским меланоцитима

Инхибиција ФГИН-1-27 на меланогенезу је процењена у меланоцитима хумане епидерме (ХЕМ). Као што је приказано на додатној слици С1, ФГИН-1-27 није имао утицаја на раст ХЕМ у опсегу дозирања од 1–16 μМ након 48 х. Као што је приказано на слици 5А, ФГИН-1-27 значајно инхибира меланогенезу у ХЕМ. Вестерн блоттинг анализа је сугерисала да ФГИН-1-27 смањује нивое експресије тирозиназе, ТРП-1 и ТРП-2 у ХЕМ (Слика 5Б). Као што је приказано на додатној слици С2, третман ФГИН- 1-27 током 12 х инхибирао је повећање активности ћелијске тирозиназе изазвано ОАГ у ХЕМ. Поред тога, измерили смо експресију МИТФ-а након ХЕМ третмана са -МСХ у присуству или одсуству ФГИН-1-27. Као што је приказано на слици 5Ц, експресија МИТФ се значајно смањила у присуству ФГИН-1-27. Штавише, као иу СК-МЕЛ-2 ћелијама, учешће ПКЦ-, ПКА и МАПК у ФГИН-1-27-посредованом антимеланогеном је такође потврђено у ХЕМ (Слика 5Д).

За више информација: david.deng@wecistanche.com ВхатАпп:86 13632399501