Гастроинтестинални епителни урођени имунитет—регионализација и органоиди као нови модел

Људски гастроинтестинални тракт је у сталном контакту са микробним стимулансима. Његове баријере морају да обезбеде коегзистенцију са комензалним бактеријама, истовремено омогућавајући надзор интрудних патогена. У центру интеракције лежи епителни слој, који означава границе тела. Опремљен је мноштвом различитих сензора урођеног имунитета, као што су рецептори слични Толл-у, за постављање инфламаторних одговора на микробе. Дисфункција овог сложеног система доводи до патологија повезаних са упалом, као што је инфламаторна болест црева. Међутим, сложеност ћелијских интеракција, њихова молекуларна основа и њихов развој остају слабо схваћени. Последњих година, органоиди добијени из матичних ћелија привукли су све већу пажњу као обећавајући модели како за развој тако и за широк спектар патологија, укључујући заразне болести. Поред тога, органоиди омогућавају проучавање епителног урођеног имунитета ин витро. У овом прегледу фокусирамо се на гастроинтестиналну епителну баријеру и њену регионалну организацију да бисмо разговарали о урођеном имунолошком сензору и развоју.

Изложеност микробним стимулансима може побољшати имунитет, јер микробни стимуланси могу стимулисати тело да производи имуне ћелије и имуне молекуле, чиме се стимулише имуни одговор тела. Конкретно, излагање микробним стимулансима може активирати имуне ћелије као што су макрофаги, дендритске ћелије и природне ћелије убице, убрзати пролиферацију и диференцијацију имуних ћелија и побољшати виталност и отпорност имуних ћелија на болести. Поред тога, микробни стимуланси такође могу подстаћи инфламаторне одговоре и регулацију имунитета и побољшати имунолошку одбрану тела од патогена. Стога, разумно излагање микробним стимулансима може унапредити побољшање људског имунитета. Види се да треба побољшати имунитет. Цистанцхе може значајно побољшати имунитет. Месни пепео садржи различите биолошки активне састојке, као што су полисахариди, две печурке, Хуанг Ли итд. Ови састојци могу да стимулишу различите врсте меса у имунолошком систему. ћелије, повећавајући њихову имунолошку одрживост.

Кликните на здравствене предности цистанцхеа

Кључне речи

Гастроинтестиналног тракта. Имунитет. Регионализација и органоиди.

Увод

Гастроинтестинални (ГИ) тракт је потребан за варење хране и креће се од усне дупље преко једњака, желуца, танког и дебелог црева до ануса. Лумен ГИ је колонизован великим бројем комензала, симбионта и повремено патогена. Колонизација микроба прати градијент са мање од 103 микроба/мл у желуцу до 103-107 микроба/мл у танком цреву и 1011-1012 микроба/мл у дебелом цреву (прегледано у [1-3]). Од жлезданог желуца па надаље, ГИ тракт је обложен једним слојем колонастих епителних ћелија. Овај епителни слој се састоји од различитих специјализованих ћелија, чврсто повезаних спојним протеинским комплексима, јачајући физичку баријеру (слика 1).

Интеракција између цревне микробиоте, као и прогутаних патогена и епителних ћелија посредована је рецепторима за препознавање образаца (ПРРс), укључујући Толл-лике рецепторе (ТЛР), нуклеотид-везујући домен олигомеризације (НОД)-сличне рецепторе (НЛР) и друге цитосолне рецепторе (слика 2, прегледана у [7, 11]). Ови ПРР играју кључну улогу у препознавању молекуларних образаца повезаних са микробом (МАМП) и молекуларних образаца повезаних са оштећењем (ДАМП). Након активације ПРР у епителним ћелијама, низводне сигналне каскаде индукују експресију различитих цитокина и хемокина путем инфламаторних путева, као што је НФ-κБ пут, да усмере професионалне имуне ћелије (прегледано у [8, 12–16]). Поред класичних ПРР, недавно су откривени даљи сензори бактеријске активности, као што је алфа-киназа 1 (АЛПК1) [17–19]. Инфламазоми, цитоплазматски комплекси састављени од НЛР протеина, препознају додатне молекуларне обрасце, као што су бактеријски метаболити (прегледано у [7, 9]).

Гастроинтестинални урођени имуни одговори, укључујући ПРР сенсинг, морају уравнотежити потребу за заштитом од потенцијално штетних патогена са способношћу да толеришу излагање разноврсном луминалном микробиому. Стога се очекује да ће експресија и функција ПРР сигнализације имати велики утицај не само на откривање патогена већ и на хомеостазу ткива (Оквир 1) и инфламаторне болести укључујући акутни гастроентеритис, гастритис и инфламаторне болести црева (ИБД) (прегледано у [ 12, 13, 20, 21]). Иако свака од ових болести има потпуно различите патогенезе, оне деле критичну особину: веза између животне средине и тела је значајно поремећена. Међутим, у току је дебата о томе да ли су промене у слоју цревног епитела, посебно оне које утичу на његову урођену имунолошку функцију, узрок или последица горе наведених болести.

Већина знања о ПРР сигнализацији прикупљена је из истраживања хематопоетских ћелија. Био је изазов разликовати функције ПРР сигнализације у епителним ћелијама од функција инфилтрирајућих имуних ћелија. Главне препреке укључују потешкоће у изоловању чистих епителних ћелија и подизању поузданих антитела против ПРР-а. Са напретком органоида који потичу из цревних епителних матичних ћелија, сада је доступан редукционистички експериментални модел који омогућава истраживања урођеног имунолошког одговора примарних епителних ћелија. Органоиди се дефинишу као 3- димензионалне ћелијске културе изведене из матичних ћелија које имају способност самоорганизовања и задржавају неке од функција првобитног органа (нпр. секреција, филтрација, апсорпција, контракција). Пошто се органоиди могу узгајати или из одраслих матичних ћелија (АСЦ) које живе у ткиву или из плурипотентних матичних ћелија (ПСЦ), ћелије нису трансформисане. Заједно, ова два типа органоида покривају обиман репертоар органа који се могу опонашати (прегледано у [4, 22, 23]). Обе технологије имају своје предности (преглед у [4, 22, 23]). На пример, културе органоида добијених из АСЦ имају огроман потенцијал експанзије и релативно су хомогене, а ПСЦ-изведени органоиди су сложенији у смислу да комбинују ћелије веома различитог развојног порекла (нпр. епителне и мезенхимске ћелије). Органоиди добијени из ПСЦ омогућавају анализу развојних корака, али можда неће достићи пуни ниво диференцијације у епителни слој као што је пронађено ин виво [24]. Органоиди добијени из АСЦ-а настали из феталних ткива могу такође омогућити проучавање сазревања феталног епитела пошто они старе у култури [24, 25].

Овај преглед ће нагласити увиде из студија које користе органоиде и размотрити потенцијал ове технологије за проучавање урођеног имунитета епитела. Фокусирамо се на регионалну организацију у гастроинтестиналном тракту.

Регионални идентитет и урођена имунолошка сигнализација у ГИ тракту

Када се посматрају гастроинтестиналне болести, важно је напоменути да су неке од њих ограничене на одређени део гастроинтестиналног тракта. ИБД укључује Црохнову болест (ЦД) и улцерозни колитис (УЦ), који показују диференцијални и специфичан образац упале: док УЦ почиње у ректуму и налази се у дебелом цреву, ЦД може утицати на све делове ГИ тракта од усне дупље до ануса. Надаље, ЦД карактерише сегментална, дисконтинуирана упала унутар ГИ тракта, док се УЦ обично описује као континуирана упала дебелог црева (прегледано у [26, 27]). У једњаку, желуцу и дебелом цреву, инциденција рака је висока, а инфекција и запаљење могу подстаћи развој и напредовање ових карцинома (прегледано у [28, 29]). Насупрот томе, малигна трансформација у танком цреву је веома ретка (прегледано у [30]). Очигледна сегментна специфичност ових болести у ГИ тракту остаје загонетна, али је примамљиво спекулисати да је њихово порекло специфично за регион укорењено у поремећајима који су специфични за регион, у чврсто избалансираном систему функције епителне баријере, урођеног имунитета и регенерације слузокоже. . Стога је занимљиво истаћи разлике у сегментима унутар ГИ тракта.

ГИ тракт се састоји од неколико анатомски дефинисаних сегмената са веома различитим физичким функцијама (прегледано у [31]). Главна функција желуца је варење хране и елиминација долазних патогена помоћу желудачне киселине. Хранљиве материје не морају да стигну до епителног слоја желуца; стога, тело у великој мери улаже у заштитну баријеру слузи, штитећи епителне ћелије не само од његове киселине већ и од садржаја лумина (прегледано у [32, 33]). Насупрот томе, главна функција танког црева није само варење већ и унос хранљивих материја. У складу са овим, танко црево има значајно повећану површину због ресица које вире у лумен црева, где површине ћелија долазе у блиски контакт са хранљивим материјама. Већина варења се одвија у проксималном танком цреву, дуоденуму и јејунуму, где су ресице дугачке и танке. Јејунум има највећи однос Панетхових ћелија које луче антимикробне пептиде [34], који украшавају прилично лабаву слуз, чиме чувају епителни слој и одржавају крипте стерилним (прегледано у [35]).

Ресице постају све краће и шире према илеуму (прегледано у [36]), где опет слуз преузима важан део заштите: са највећим односом пехарастих ћелија, илеум има дебљи слој слузи и нижи слој. брзина варења и апсорпције од јејунума [34] (прегледано у [31]). Коначно, дебело црево поново апсорбује воду и улаже у обиман, дебео и двослојни омотач слузи да би могао безбедно да садржи трилионе комензалних бактерија. Дебело црево нема ресице и крипте су мање од оних у танком цреву. Нема Панетових ћелија, а однос пехарастих ћелија може бити и до 25 процената епителног слоја [37]. Дакле, три сегмента црева имају различите стратегије за одржавање безбедне удаљености између епителних ћелија и микробиоте. Препознавање МАМП и активација имуних путева је још један слој ове интеракције и стога је разумно да су они такође структурирани дуж ГИ тракта (прегледано у [38]). Међутим, остаје фасцинантна загонетка о томе шта тачно обликује структуру ПРР организације.

Иако је интуитивно да гени важни за регионалне функције, као што су варење и узимање хранљивих материја, прате просторну компартментализацију дуж цефалокаудалне осе (прегледано у [39]), таква организација се није очекивала за епителну урођену имунолошку сигнализацију. Претходне студије су пријавиле регулацију ПРР сигнализације као одговор на стимулацију са МАМП. На пример, одзив на ТЛР4 се смањује након рођења, вероватно због изложености ЛПС током порођаја и накнадне колонизације црева [40]. Такође, стимулација ТЛР9 са његовим лигандом ЦпГ-ДНК доводи до смањења експресије Тлр4 и инхибира ТЛР4 сигнализацију [41]. Стога се очекивало да ће контакт са микроорганизмима, њиховим молекулима и метаболитима у ГИ тракту довести до утишавања експресије ПРР према лумену црева (прегледано у [14]). Међутим, контрадикторни резултати, узроковани техничким потешкоћама као што су непоуздана антитела која циљају ТЛР, довели су до конфузије на терену и било је нејасно да ли је одређени ПРР изражен или не (прегледано у [42]). Рани Нортхерн блотови за мРНА Тлр2 и Тлр4 ин ек виво изолованих епителних ћелија су показали да су нивои експресије ова два Тлр молекула специфични за сегменте: Тлр2 је експримиран углавном у дебелом цреву, док је Тлр4 углавном био експримиран у желуцу и дебелом цреву. Аутори су ово назвали " стратешка компартментализација“ ових ТЛР-а [43]. Недавне студије су сада откриле да се овај принцип експресије специфичне за сегмент протеже даље од ова два ТЛР-а, и разоткрио је веома сложену регионалну организацију ПРР сигнализације која не прати увек микробно оптерећење [44, 45].

Прва од две студије дошла је из групе Бартон и открила је неколико нивоа организације ТЛР експресије. Група је створила пет сојева репортерских мишева, што је омогућило анализу експресије ТЛР2, 4, 5, 7 и 9, респективно. ТЛР2 и 5 су експримирани у танком цреву и проксималном цреву, ТЛР4 је експримиран у дебелом цреву, а ТЛР7 и 9 нису експримирани. Експресија репортера у органоидима ових мишева је уско опонашала експресију ин виво, што указује да је експресија независна од контакта са микробиотом или са имуним ћелијама [45].

Друга студија је користила биобанку свеже генерисаних људских и мишјих органоида који покривају различите сегменте ГИ тракта: корпус, пилорус, дуоденум, јејунум, илеум и дебело црево. Транскрипциона анализа органоида потврдила је обрасце експресије за ТЛР-ове које је пријавила Бартон група, али је поред тога открила велики степен диференцијалне експресије ТЛР-а, НЛР-а, компоненти инфламасома и других гена повезаних са урођеним имунитетом (Слике 3 и [44 ]). На пример, Нод2 је углавном био експримиран у желуцу, док су експресије неколико компоненти пута инфламасома као што су Нлрп1б, Нлрп6 и Аим2 биле ограничене на црева. Различити рецептори су били униформно изражени; на пример, експресија Тлр3 је откривена у сваком сегменту мишјег ГИ тракта у великим количинама, док је Тлр5 експримиран у сваком сегменту, али у малим количинама [44]. Као резултат, чини се да сваки сегмент има свој сопствени, специфичан комплемент урођених имуних рецептора и компоненти сигнализације.

Поређење мишјих са људским гастроинтестиналним органоидима показало је да је код обе врсте принцип комплексне организације ПРР сигналних компоненти исти, али појединачни профили експресије ПРР могу да се разликују. Неки ПРР, попут ТЛР4 и НЛРП6, имали су сличан узорак дуж ГИ тракта обе врсте. ТЛР4 је био изражен претежно у желуцу и дебелом цреву, а експресија НЛРП6 је била ограничена на сегменте црева. С друге стране, неколико ПРР-ова као што су ТЛР1 и ТЛР2 показало је обрасце који су се разликовали између обе врсте. Док је код мишјих органоида експресија оба повећана дуж ГИ тракта и била је највећа у дебелом цреву, код хуманих органоида експресија је била највећа у желуцу и смањена дуж ГИ тракта [44]. Штавише, експресија ТЛР5 је била већа у људским органоидима, са највишим нивоима уоченим у желуцу [44].

Као што је горе поменуто, органоиди такође омогућавају тестирање да ли је одређени пут функционалан додавањем лиганда и накнадном анализом експресије циљног гена низводно. Допуњујући анализу експресије специфичне за регион, студија је такође открила да људски и мишји органоиди показују функцију специфичну за регион: мишји стомак је реаговао на ТЛР4 лиганд ЛПС, али не и на ТЛР2 лиганд ПАМ3ЦСК4 или ТЛР5 лиганд флагелин, повећањем НФ- κБ циљни ген Цкцл2. Мишји јејунум је повећао Цкцл2 као одговор на ПАМ3ЦСК4 и флагелин, али не као одговор на ЛПС. Поред тога, дебело црево је експримирало Цкцл2 као одговор на сва ова 3 тестирана лиганда [44]. Насупрот томе, људски органоиди из свих региона су експримирали хумани Цкцл2 аналог ИЛ-8 као одговор на флагелин, али не као одговор на ЛПС и ПАМ3ЦСК [44]. Дакле, не само експресија већ и функција ПРР у цревима је високо организована и специфична за сегмент. Ови експерименти су спроведени додавањем стимулуса у органоидни медијум, чиме је стимулисана само базална страна, пошто је апикална страна окренута ка затвореном лумену органоида. Други експерименти су показали да постоји још виши ниво организације пошто ПРР експресија унутар сегмента може бити ограничена на специфичне типове ћелија или чак субцелуларне локације, као што је само базални одељак. Они су детаљније наведени у наставку.

Сваки регион ГИ тракта изражава свој специфични скуп урођених имуних гена. Иако је генерализација тешка, тренутни подаци сугеришу да су ТЛР највише експримирани у желуцу и дебелом цреву, док танко црево карактерише експресија инфламазомских компоненти. Тренутно, основни молекуларни механизам и еволуциона корист су нејасни.

Претпостављамо да физичке и хемијске баријере које покривају епителне слојеве у различитим сегментима црева захтевају праћење специфичних претњи. На пример, стомак и дебело црево имају двослојни, дебели слој слузи са унутрашњим слојем слузи који је чврсто причвршћен за епителни слој, док је танко црево прекривено танким, вискозним слојем слузи [46]. Различите конституције слојева слузи су заузврат вероватно због различитих функција одговарајућих сегмената црева (варење наспрам узимања хранљивих материја наспрам ресорпције воде). Могуће је да дебљина слузи утиче на тип ПРР-а неопходних на одређеним местима.

Специјализоване ћелије са имунолошком функцијом у епителу

Дугогодишњи концепт епителног урођеног имунитета је постојање урођеног имунолошког препознавања специфичног за тип ћелије. Прототипови специјализованих епителних ћелија са одбрамбеном функцијом су ћелије микронабора (М) и Панетх ћелије—недавно допуњене специјализованом пехарастом ћелијом, сентинел пехаратом ћелијом. Постојање таквих специјализованих ћелија наглашава сложене и сувишне системе који обезбеђују равнотежу уношења хранљивих материја, коегзистенцију са микробиотом и праћење могућих нападача. Усмерена диференцијација органоида сада такође омогућава проучавање ових ћелија у ћелијској култури.

М ћелије се налазе у епителу повезаном са фоликулом који покрива Пеиерове закрпе. Имају јединствену морфологију са неправилним ивицама четкице и смањеним структурама микроресица. Њихова улога је да транспортују антигене у лумену црева преко епителног слоја до испод лежећег лимфоидног ткива ради регулације имунолошких одговора [47]. Показало се да саме М ћелије, као и епител повезан са фоликулима, експримирају неколико ТЛР-а [48] (прегледано у [14]). Међутим, М ћелије је било тешко проучавати јер их нема много у епителном ткиву и налазе се само у близини сложене структуре Пеиерових закрпа [47]. Ипак, М ћелије се могу генерисати у органоидним културама коришћењем усмерене диференцијације. За ово, активатор рецептора НФ-κБ лиганда (РАНКЛ) се додаје у медијум, који појачава регулацију транскрипционог фактора СпиБ, који је карактеристичан за диференцијацију М ћелија [49]. Органоиди добијени од мишева генетски дефицитарних за НФ-κБ подјединицу РелБ нису у стању да производе М ћелије након стимулације са РАНКЛ, што указује да је активација НФ-κБ неопходна за развој М ћелија [50]. У људској органоидној култури, поред РАНКЛ, лимфотоксин и ретиноична киселина су кључни за изазивање диференцијације према М ћелијама. Ове М ћелије специфично преузимају ентеричне вирусе попут ротавируса и реовируса, што указује на исправно фенокопирање функције природних М ћелија такође у органоидним културама [51]. Будући органоидни рад ће морати да настави да разоткрива међусобну везу епителне НФ-κБ сигнализације, развоја М ћелија и комуникације са имуним ћелијама.

Панетх ћелије су помешане са цревним матичним ћелијама у дну крипте и дуго су се сматрале чуварима одељења матичних ћелија јер луче антимикробне пептиде. На пример, Панетх ћелије луче алфа-дефензине, процес за који се показало да је регулисан микробним обрасцима и урођеним имунолошким механизмима [52, 53]. Поред тога, НОД2, који је први пут откривен у крипти танког црева миша [54], регулише лучење неколико алфа-дефензина од стране Панетових ћелија, што заузврат доводи до активације адаптивног имунитета. Панетх ћелије такође експримирају ТЛР5, а органоиди обогаћени Панетх ћелијама изражавају посебно високе нивое ТЛР5. Секвенцирање РНК након стимулације открива да док нормални органоиди танког црева изражавају само умерене нивое ТЛР5 низводних циљних гена као одговор на стимулацију флагелином, као што су цитокини индуковани НФ-кБ, органоиди усмерени да садрже велики број Панетових ћелија се много јаче постављају. одговор, што указује да су Панетх ћелије главни одговорни на флагелин у танком цреву [44, 45]. За разлику од експресије циљног гена, најдраматичнији одговор Панетх ћелија (дегранулација, екструзија и ћелијска смрт) није покренут стимулацијом ТЛР лигандима, већ захтева стимулацију професионалним цитокин интерферон-гама добијеним из имунолошких ћелија [55]. Ови резултати из органоида су у сагласности са запажањима која показују дегранулацију и екструзију Панетових ћелија после стимулације интерфероном-гама ин виво [55]. Ово елегантно подвлачи систем контроле и равнотеже у епителном слоју.

Пехарасте ћелије су важне за одбрану епитела јер производе гликозиловане муцине кључне за формирање мукусне баријере на епителном слоју (прегледано у [56]). Код мишева, недостатак МУЦ2 доводи до спонтане упале и повећава подложност инфекцији [57, 58]. Недавно је у дебелом цреву миша описана подскупина пехарастих ћелија под називом сентинел пехарасте ћелије. Користећи експлантате ткива, студија је идентификовала задебљање слоја слузи као одговор на излагање ТЛР1/2, 4 и 5 лигандима, али не и ТЛР9, НОД1 и НОД2 лигандима [59], у складу са претходним извештајем о Тлр 2 ,4 и 5 се експримирају у пехарастим ћелијама [60]. Аутори су утврдили да одговор такође зависи од присуства инфламасома Нлрп6 и да је независан од мукозних лимфоцита користећи ткива из низа нокаут мишева [59]. Такође, претходни извештај је показао значај инфламасома НЛРП6 за секрецију слузи пехарастим ћелијама [61]. Снимање је открило да специфичне пехарасте ћелије лоциране у апикалним регионима крипте ендоцитозирају флуоресцентно обележен ЛПС [59]. Ове новоназване сентинел пехарасте ћелије не само да пролазе кроз брзу дегранулацију и избацивање епитела након третмана са ТЛР лигандима, већ и преносе сигнал калцијума суседним ћелијама преко међућелијских цитоплазматских мостова формираних од спојева, вероватно стимулишући друге пехарасте ћелије да повећају лучење слузи [59] . И пехарасте ћелије и Панетове ћелије припадају секреторној линији. Органоиди омогућавају усмерену диференцијацију ка идентитетима обе ћелије, дајући органоиде који су јако обогаћени или пехарастим или Панетовим ћелијама [62]. Поређење транскриптома ових искривљених органоида помогло је да се идентификују кључни регулатори пута диференцијације [63]. Даља анализа података омике, као и функционална анализа ових органоида, омогућиће боље разумевање улоге оба типа ћелија у урођеној имунолошкој одбрани.

На крају, такође је пријављено да саме матичне ћелије експримирају специфичне ПРР као што је ТЛР4 [64, 65], који се не налазе на ресицама танког црева миша или Панетовим ћелијама [66]. Поред тога, чини се да је већина експресије Нод2 у мишјим криптама ограничена на матичне ћелије [67]. Стимулација са НОД2 лигандом повећала је преживљавање матичних ћелија и формирање органоида, што указује да стимулација ПРР-а такође може директно регулисати регенерацију епитела црева.

Без сумње, тренутни напори да се генеришу атласи експресије гена који покривају сваки тип ћелије све детаљније ће ускоро дати потпунију слику о ћелијској организацији урођене имунолошке сигнализације у цревима, као иу целом телу [68–71]. ].

Поларитет ћелија и споредни урођени имуни одговори

Коначно, такође је релевантно узети у обзир да су ћелије гастроинтестиналног епитела високо поларизоване, са специјализованом апикалном страном окренутом ка лумену црева са његовом микробиотом, а базолатералном страном окренутом према ткиву. Под хомеостазом, МАМП стижу само до апикалне стране. Међутим, када је епителна баријера пробијена, микроорганизми могу изазвати и базолатералну страну. Стога је претпостављена хипотеза да епителне ћелије могу селективно покренути проинфламаторни одговор само када су стимулисане са базолатералне стране, како би одговарале претњи коју представља сигнал. На пример, показало се да ТЛР9 индукује различите сигналне путеве када је стимулисан са апикалне или базолатералне стране у ћелијским линијама рака [72], а ТЛР5 индукује само НФ-κБ ген одговора ИЛ-8 када је стимулисан са базалне стране [73]. ].
Док су раније студије које су користиле обележавање антитела против ТЛР-а пријавиле специфичну експресију само на једној страни (прегледано у [14, 16]), анализа ТЛР репортерских мишева коришћењем бојења ХА ознаке то није потврдила, већ је уместо тога показала ТЛР2, 4 и 5 рецепторе на апикалним и базалним странама проксималног колона, као и неке интрацелуларне ТЛР4 [45]. Ове очигледне разлике су вероватно због различитих техничких приступа.

Органоиди сада омогућавају директно функционално тестирање бочно-специфичних имуних одговора, пошто се ћелијска поларизација задржава у органоидима. У стандардним условима када се органоиди узгајају у екстрацелуларном матриксу, апикална страна је окренута ка лумену органоида, а базална страна према екстрацелуларном матриксу [74–76]. Када се узгаја изван екстрацелуларног матрикса, поларитет се може обрнути [77, 78]. Када се ћелије из органоида засеју на стандардне површине ћелијске културе, као што су посуде за културу или трансвеллови, апикална страна је окренута ка лумену бунара [44, 79–82].

Неколико студија је користило органоиде за тестирање опште функције одређених ПРР-а без разматрања специфичних разлика између апикалне и базалне стимулације. Ове студије су укључивале стимулус у медијуму органоида, који под стандардним условима стимулише базалну страну ћелије. Користећи ову технику, идентификована је регулација НФ-κБ низводних циљних гена након базалне стимулације лигандима ТЛР4 у желуцу, ТЛР2 и 3 у танком цреву и ТЛР2, 3, 4 и 5 у дебелом цреву мишева [44, 45, 83] и на лиганде ТЛР2 и 5 у желуцу и ТЛР5 у танком и дебелом цреву човека [44]. Штавише, базална стимулација органоида мишјег дебелог црева са агонистима ТЛР4 изазвала је ћелијску диференцијацију, посебно према секреторној линији [64], док су НОД2 агонисти изазвали повећано преживљавање матичних ћелија [67, 84], а таурин је стимулисао НЛРП{20}}зависну регулацију циљног гена инфламасома низводно ИЛ-18 [85]. У свим овим студијама апикална стимулација није тестирана.

Само неколико студија бавило се споредним функцијама ПРР-а. Важно је напоменути да за разлику од студија које су користиле поларизоване ћелијске линије рака, до сада, ниједна студија која је користила органоиде није идентификовала бочно-специфичну активацију типичног проинфламаторног гена зависног од НФ-κБ. Трансвелл монослојеви изведени из органоида људског дебелог црева изражавају сличне нивое НФ-κБ циљног гена ИЛ-6 када су стимулисани са апикалне или базалне стране лигандима ТЛР1/2, 3, 4, 5, 7/8 и 9 [82]. Мишји желучани органоиди су такође реаговали на апикалну стимулацију са ТЛР4 лигандом ЛПС у неколико тестова, укључујући трансбулање и микроињекцију ЛПС-а у лумен органоида [44]. Епителне ћелије танког црева мишева нису експримирале циљни ген НФ-κБ ицам1 као одговор на низ лиганада, без обзира да ли су додати интактним органоидима, стимулишући на тај начин базалну страну, или додати појединачним, дисоцираним ћелијама, чиме су стимулисали све стране [55].

Међутим, гледајући даље од НФ-κБ одговора, недавна студија је идентификовала споредну функцију ТЛР3 и њен значај у вирусној инфекцији [82]. Резултати експеримената са монослојевима добијеним од органоида хуманог дебелог црева показали су да је експресија критичних гена за одбрану вируса типа И и интерферона типа ИИИ повећана након базалне стимулације агонистом ТЛР3, али не и након стимулације другим ТЛР агонистима. Када су инфицирани вирусом, сходно томе, интерферонски одговор органоида био је много јачи када су инфицирани са базалне стране у поређењу са инфекцијом са апикалне стране. Ово је било видљиво у монослојевима изведеним из органоида, као и у органоидима микроињектираним вирусом. Студија је даље идентификовала адаптер за сортирање клатрина АП-1Б као молекул одговоран за поларизовану експресију ТЛР3. Сходно томе, мишеви са недостатком Ап-1б показали су појачан имуни одговор након вирусне инфекције [82]. Ово потврђује поларизовану функцију ПРР-а и наглашава важност овог нивоа регулације у даљем модулирању препознавања и одбране патогена.

До сада, не постоји „једна величина за све“ одговор на питање поларитета, а решавање природе ПРР сигнализације специфичне за локацију остаје технички изазован задатак за будућност.

Толеранција као одговор на колонизацију и као подразумевани развојни програм

Механизми који доприносе организовању епителног урођеног имунитета су још увек нејасни. Главни концепт у овом погледу је индукција толеранције након колонизације стерилног црева током порођаја, такозваног прозора могућности (прегледано у [86–88]). Овај концепт постулира почетни период урођеног и адаптивног имуног система након рођења, који поставља сцену за имунолошку хомеостазу и накнадне интеракције домаћин-микроб.

Неонатални имуни систем и епителни урођени имунитет су јединствено опремљени да савладају овај прелаз од стерилитета до коегзистенције са микробиотом. При рођењу, људско неонатално црево је потпуно зрело са цревним ресицама и криптама које садрже Панетх ћелије. Мишји неонатални цревни епителни слој је незрелији и пролази кроз драматичне промене мерљиве на нивоу транскриптома упоређујући различите фазе развоја [89] и видљиве у архитектури ткива и диференцијацији ћелија: Оса крипта-вилус још није формирана и пролиферација ћелија је ниже, без миграције ћелија или пилинга. Не садржи зреле Панетове ћелије; међутим, ентероцити производе антимикробни пептид сличан кателицидину (ЦРАМП) [90]. Панетх ћелије се појављују када се крипте формирају 2 недеље након рођења [91]. У време одбијања, епител је потпуно формиран са криптама и ресицама, ентероцитима, пехарастим ћелијама и ентероендокриним ћелијама; Панетх ћелије су преузеле производњу антимикробних пептида; а пехарасте ћелије су повећале производњу муцина да би се формирао слој слузи (прегледано у [92]).

Ова транзиција епитела зависна од старости иде руку под руку са постепеним смањењем експресије ТЛР5 у епителу танког црева. Истовремено, експресија ТЛР3 се повећава током неонаталног периода. Други ПРР, као што су ТЛР2, 4 и 9, експримирани су на сличним нивоима код неонаталних и одраслих мишева [45, 93].

Механизми који доводе до регулације експресије и функције ПРР након рођења остају нејасни. Као што је горе поменуто, неколико студија је предложило допринос животне средине, посебно колонизације микроба, регулацији експресије ПРР након рођења [40, 41] (прегледано у [14]). Међутим, мишеви без клица у односу на специфичне патогене нису показали разлике у експресији ТЛР ни у танком цреву ни у дебелом цреву, што указује да ни појачана регулација ТЛР3 ни смањење ТЛР5 у овом раном периоду не зависе од микробиоте [45, 93]. Такође, у органоидима, експресија многих, али не свих, ПРР сигналних компоненти је већ дефинисана у органоидима из ткива која никада нису била у контакту са микробним производима [44]. Ово указује да је велики део организације урођених имунолошких сигналних путева дефинисан независно од контакта са микробиотом и изгледа да је одређен подразумеваним развојним процесима, као што су они горе наведени, који обликују општи идентитет ткива дуж ГИ тракта. . Ово не искључује даље фино подешавање експресије ПРР факторима средине током одраслог доба.

Важност правовремене регулације епителних микробних интеракција постаје јасна када се незрели епител прерано суочи са микробном колонизацијом: недоношчад су склона развоју некротизирајућег ентероколитиса (НЕЦ), који карактерише некроза црева, системска сепса и вишеорганска. неуспех. Иако се патогенеза сматра мултифакторском, неколико студија је показало да се развија као одговор на неравнотежу између проинфламаторне сигнализације и механизама поправке у прераним цревима (прегледано у [94]) и предложен је допринос ПРР-а [41, 65, 95 –97]. Неколико студија је користило органоиде хуманог фетуса [24, 98, 99], нормалне мишје органоиде изложене бактеријама и хипоксији за модел НЕЦ [100], или органоиде из модела мишјег НЕЦ, као и од НЕЦ пацијената [101]. Будуће студије ће користити ове успостављене и нове органоидне моделе за даље дефинисање доприноса епитела у НЕЦ-у.

Моделирање аспеката ИБД зависних од епитела са органоидима

Губитак интегритета цревне епителне баријере је дефинишућа карактеристика ИБД-а, тј. ЦД-а и УЦ-а, и чини се да је узрокован мултифакторском интеракцијом генетске предиспозиције, фактора животне средине, промена цревне микробиоте и промена локалног и системског имунолошког одговора (прегледано у [27]). Тренутни терапеутици су углавном усмерени на (аберантне) имуне одговоре код ИБД, који су повезани са високим стопама нереаговања и нежељених ефеката (прегледано у [27]). Потребно је побољшано разумевање доприноса специфичног за епител патофизиологији ИБД-а да би се идентификовали нови терапеутски циљеви који такође могу бити у стању да директно утичу на обнављање цревне епителне баријере, а тиме и на зарастање слузокоже.

Да би стекли увид у епителну патологију, неколико група је успоставило живе биобанке које се састоје од органоида генерисаних од појединачних пацијената са УЦ или ЦД. Иако је овај приступ очигледан, до сада је само неколико студија известило о резултатима органоида добијених од ове групе пацијената [102–104]. Ово се може објаснити запажањем да је органоиде од пацијената са ИБД теже генерисати. Наше искуство је да органоиди добијени од пацијената са ЦД-ом расту спорије током првих пасажа и да су неки узорци изгубљени – што је било повезано са већом стопом бактеријске контаминације у културама [105].

Карактеризација органоида добијених од пацијената са ИБД открила је фенотип са смањеном величином и капацитетом пупољка, повећаном стопом ћелијске смрти, луминалним остацима и делимично инвертираном поларизацијом епителних ћелија [106]. Глобално поређење органоида код пацијената са УЦ или ЦД и здравих контрола показало је да су разлике у транскрипцији и метилацији уочене у цревном епителу одржане ин витро [102, 103, 107]. Такође, ранија студија органоида генерисаних од пацијената са ЦД сугерисала је трајне промене цревних матичних ћелија код ИБД. Ово је засновано на запажању да органоиди генерисани из активних лезија ЦД-а одржавају високе нивое експресије маркера интестиналних епителних матичних ћелија [108]. Ово је донекле потврђено у недавној студији у којој су органоиди дебелог црева добијени од педијатријских пацијената са ИБД показали продужену експресију гена који представљају антиген [109].

Фокусирајући се на промене у функцији цревне епителне баријере, укључујући губитак чврстих спојева и дезмозома, који се обично налазе код ИБД [110], показало се да органоиди пацијената са ЦД-ом одржавају овај фенотип спојних промена у условима културе [105]. Ово је посебно био случај када су органоиди генерисани из места тешке упале [105]. Смањење спојних протеина такође може бити изазвано у органоидима од здравих донора применом проинфламаторног цитокина ТНФ- и/или ИФН- [106, 111]. Међутим, фиксни образац промена спојних протеина у органоидима код пацијената са ИБД примећен је само на нивоу протеина, али не и на нивоу мРНК [105].

Ова запажања сугеришу да је неколико промена фиксирано у органоидима код пацијената са ИБД. Опажање да су неке, али не све, трајне промене видљиве само на нивоу протеина, али не и на нивоу РНК, сугерише да постоје трајне промене у пост-транскрипционим модификацијама или деградацији протеина у органоидима код пацијената са ИБД. Ово, међутим, остаје да се детаљно истражи.

Нејасно је шта тачно изазива трајне промене у обрасцима експресије запаљеног епитела. Дуго се сумњало на ефекат микробиоте; међутим, недавна студија је показала да се ефекат микробиоте на епител временом губи [112]. Студија је упоредила неколико објеката за мишеве јер су различити састави микробиома колонија миша идентификовани као збуњујући фактори ин виво студија. Да би се разјаснио овај ефекат, студија је упоредила епителне изолате и органоидне културе мишева без клица и две одвојене колоније миша без специфичних патогена са различитом микробиотом. Док је свеже изоловани епител показао отисак изложености микробиоти на нивоима РНК и протеина, овај ефекат је изгубљен након неколико недеља културе органоида танког црева [112]. Такође, глобално поређење генске експресије органоида генерисаних из запаљених или неупаљених региона истих пацијената са ИБД је показало да су органоиди ИБД у запаљеним регионима изгубили експресију инфламаторног гена већ након неколико недеља у култури. Транскриптоми органоида су затим групирани по пацијенту; тако су остале трајне разлике између ИБД и здравих контрола. Инфламаторни фенотип у органоидима ИБД-а могао би се затим поново индуковати додавањем коктела цитокина [107]. Све у свему, ово сугерише да су трајне промене уочене у органоидима код пацијената са ИБД независне од контакта са микробиотом или цитокинима.

Стога, иако је разумно спекулисати да неке од трајних промена у ћелијама цревног епитела код пацијената са ИБД могу бити узроковане променама у урођеној имунолошкој сигнализацији, докази за то су тренутно оскудни. Поред тога, нису све епителне промене примећене у запаљеним регионима у цревима трајно очуване у пречишћеном епителу, што указује на важан допринос локалног окружења. У будућности, нове студије са сложенијим органоидним моделима, које такође укључују имуне ћелије, стимулацију инфламаторних цитокина и ко-културе са микроорганизмима, требало би да помогну да се ова хипотеза детаљније разјасни.

Закључци, будуће перспективе и изгледи

Укратко, док многе болести унутар ГИ тракта остају непотпуно схваћене, све већи број доказа указује на критичну улогу гастроинтестиналног епитела у патогенези многих од њих - иако његова специфична улога остаје нејасна.

Ограничено знање о урођеној имунолошкој функцији гастроинтестиналног епитела приписано је недостатку одговарајућих експерименталних модела. Применом органоидне технологије направљен је велики корак у превазилажењу овог проблема. Органоиди генерисани из сваког региона гастроинтестиналног тракта значајно ће допринети постојећем знању. Као што су откриле претходне студије, стварање органоида пружа кључну предност у могућности да се посматрају одговори примарних гастроинтестиналних ћелија за разлику од трансформисаних ћелијских линија, које се углавном генеришу од малигних тумора гастроинтестиналног тракта. Једна од најфасцинантнијих карактеристика органоида је да они одржавају специфичне карактеристике сегмента гастроинтестиналног тракта из којег су настали као део њиховог ћелијског идентитета током одраслог доба. Према тренутним експерименталним студијама, регионални идентитет је фиксиран у гастроинтестиналним матичним ћелијама. У овом контексту, преостало питање ће бити да се тачно утврди како и када током развоја долази до овог унутрашњег програмирања.

Када се посматрају специфични концепти о томе како епител може да реагује на околину или да ступи у интеракцију са околином, органоидна технологија је сада омогућила осветљавање диференцијалне и сегментно специфичне експресије и функције ПРР унутар гастроинтестиналног епитела. Укупне функционалне последице за сложене регулаторне системе у целом гастроинтестиналном тракту су још увек нејасне и мораће да се решавају у будућности. За ово ће такође бити важно кокултурисати органоиде са имуним ћелијама (прегледано у [113]), ћелијама ентеричког нервног система [114] и луминалним факторима као што су бактеријске кокултуре (прегледано у [115]) (Сл. . 4).

Даљи важан аспект је да органоиди настали из ткива пацијента погођеног ГИ болестима као што је ИБД задржавају неке од карактеристика које се виде у одговарајућим узорцима ткива из којих су изведени. Ово нуди јединствену могућност даљег откривања доприноса специфичног за епител и болест патогенези ГИ болести - не само оних које укључују промене изазване упалом, већ и оних које укључују промене у малигним болестима. Може се испоставити да оба укључују специфичан допринос урођеног имунитета који потиче од епитела. За ово би систематско успостављање "живих биобанка" био важан корак. Као визија за будућност, такве живе биобанке би могле да се прикаче на већ постојеће биобанке, које тренутно пружају искључиво "мртве" биоматеријале. Ово би представљало још један важан корак не само за истраживање већ и за омогућавање индивидуализоване дијагностике и терапије за пацијенте.

Оквир 1. Урођени имунитет и епителне ћелије у ГИ тракту није јасно да ли је уочени утицај последица сигнализације урођеног имунитета у епителним ћелијама или професионалним имуним ћелијама.

Да би се раздвојила интеракција професионалних имуних ћелија и епителних ћелија, неколико студија је користило нокауте специфичне за епител, или у скорије време, епителне органоиде. У моделима миша, ниједно од епително-специфичних делеција ПРР-а не доводи до спонтане упале. Међутим, мишеви са епително-специфичним нокаутом МиД88 су подложнији експерименталном колитису и показују озбиљне поремећаје баријере, оштећене одговоре пехара и Панетових ћелија [121] и смањену производњу муцина и антимикробних пептида [121, 122]. Органоиди танког црева не изазивају инфламаторни одговор на неколико пречишћених ПРР лиганда [55], иако се то не може генерализовати и зависи од врсте, локације и старости ткива из којег се органоиди стварају [44, 45].

Одсуство спонтаног инфламаторног фенотипа у моделима нокаутирања ПРР специфичних за епителне ћелије подржава хипотезу да фактори осим општег инфламаторног одговора епитела имају утицај на епителну хомеостазу. На пример, стимулација НОД2 агонистом мурамил дипептида (МДП) повећала је број органоида који расту из изолованих матичних ћелија, што указује да урођена имунолошка сигнализација подржава преживљавање матичних ћелија [67, 84]. Штавише, подаци од мишева наглашавају важност анти-апоптотичких ефеката НФ-κБ сигнализације као одговор на друге стимулусе, као што је ТНФ- [123]. Занимљиво је да су код људи полиморфизми у генима урођеног имунитета, укључујући НОД2 и ТЛР4, повезани са повећаним ризиком од развоја ИБД-а [124], а блокада ТНФ-а је тренутно најефикаснији третман за ИБД код неких пацијената (прегледано у [125]).

Појављује се слика у којој је низак ниво урођене имунолошке стимулације важан за лучење слузи, интегритет баријере и опстанак епителних ћелија. Његово оштећење може омогућити транслокацију цревних бактерија из лумена у субепително ткиво, што доводи до упале.

Признања

Захваљујемо Омер Каиа на помоћи око илустрација и Рике Зиетлов за уређивање.

Допринос аутора

Идеја: СБ Почетни концепт: СБ и О.К.; претрага литературе: О.К., НС и СБ; Првобитни нацрт: О.К. Ревизија, преписивање, додавање одељака: НС, СБ Сви аутори су критички ревидирали коначни рукопис.

Финансирање

Финансирање отвореног приступа омогућено и организовано од стране Пројект ДЕАЛ. Овај рад је подржао Деутсцхе Форсцхунгсгемеинсцхафт (ДФГ ГРК 2157; 3Д модели ткива за проучавање микробних инфекција људским патогенима, пројекат 10, СБ), Интердисциплинарни центар за клиничка истраживања (ИЗКФ; ввв.мед.уни-вуерзбург.де/изк /стартсеите) у Вирцбургу (Грант АД-427 за НС и СБ), и ДФГ СПП1982 СЦХЛ1962/5-2 за НС.

Декларације

Сукоб интереса

Аутори изјављују да нема супротстављених интереса.

Отворен приступ

Овај чланак је лиценциран под међународном лиценцом Цреативе Цоммонс Аттрибутион 4.0, која дозвољава коришћење, дељење, прилагођавање, дистрибуцију и репродукцију у било ком медију или формату, под условом да дате одговарајуће признање оригиналном(има) аутору(има) ) и извор, наведите везу до Цреативе Цоммонс лиценце и назначите да ли су измене направљене. Слике или други материјал треће стране у овом чланку су укључени у Цреативе Цоммонс лиценцу за чланак осим ако није другачије назначено у кредитној линији за материјал. Ако материјал није укључен у Цреативе Цоммонс лиценцу за чланак и ваша намеравана употреба није дозвољена законским прописима или премашује дозвољену употребу, мораћете да добијете дозволу директно од носиоца ауторских права.

Референце

1. Гоодвин ЦС (1984) Микроби и инфекције црева

2. Секиров И, Русселл СЛ, Антунес ЛЦМ, Финлаи ББ (2010) Микробиота црева у здрављу и болести. Пхисиол Рев 90:859–904

3. Симон ГЛ, Горбацх СЛ (1986) Људска цревна микрофлора. Диг Дис Сци 31:147С–162С

4. Бартфелд С, Цлеверс Х (2017) Органоиди добијени из матичних ћелија и њихова примена за медицинска истраживања и лечење пацијената. Ј Мол Мед: 1–10. хттпс://дои.орг/10.1007/с00109-017-1531-7

5. Баркер Н (2014) Интестиналне матичне ћелије одраслих: критични покретачи епителне хомеостазе и регенерације. Нат Рев Мол Целл Биол 15:19–33

6. Бартфелд С, Коо БК (2017) Матичне ћелије желуца одраслих и њихове нише. Вилеи Интердисцип Рев Дев Биол 6:е261. хттпс://дои.орг/ 10.1002/вдев.261

7. Ливински Т, Зхенг Д, Елинав Е (2020) Микробиом и цитосолни урођени имуни рецептори. Иммунол Рев 297:1–18

8. Бургуено ЈФ, Абреу МТ (2020) Епителни рецептори слични Толлу и њихова улога у хомеостази и болести црева. Нат Рев Гастроентерол Хепатол 17:263–278

9. Цхристиан С, Каннеганти ТД (2020) Инфламасомес и фина линија између одбране и болести. Цурр Опин Иммунол 62:39–44

10. Иинг Л, Ферреро РЛ (2019) Улога НОД1 и АЛПК1/ТИФА сигнализације у урођеном имунитету против Хелицобацтер пилори. Инфекција стр: 159–177

11. Такеуцхи О, Акира С (2010) Рецептори за препознавање узорака и инфламација. Целл 140: 805–820

12. Петерсон ЛВ, Артис Д (2014) Интестиналне епителне ћелије: регулатори функције баријере и имунолошке хомеостазе. Нат Рев Иммунол 14:141–153

13. Потт Ј, Хорнеф М (2012) Урођена имунолошка сигнализација у интестиналном епителу у хомеостази и болести. ЕМБО Реп. 13:684–698

14. Абреу МТ (2010) Толл-лике рецептор сигнализација у цревном епителу: како бактеријско препознавање обликује функцију црева. Нат Рев Иммунол 10:131–144

15. Зханг К, Хорнеф МВ, Дупонт А (2015) Интестинални епител као чувар интегритета баријере црева. Целл Мицробиол 17: 1561–1569

16. Иу С, Гао Н (2015) Компартментализинг интестинал епителна целл целл-лике рецепторс толл-лике рецепторс фор имуни надзор. Целл Мол Лифе Сци 72: 3343–3353

17. Зхоу П, Схе И, Донг Н, Ли П, Хе Х, Борио А, Ву К, Лу С, Динг Кс, Цао И, Ксу И, Гао В, Донг М, Динг Ј, Ванг ДЦ, Замиатина А, Схао Ф (2018) Алфа-киназа 1 је цитосолни урођени имуни рецептор за бактеријску АДП-хептозу. Природа. 561:122–126

18. Миливојевић М, Дангеард АС, Каспер ЦА, Тсцхон Т, Емменлауер М, Пикуе Ц, Сцхнупф П, Гуигнот Ј, Арриеумерлоу Ц (2017) АЛПК1 контролише ТИФА/ТРАФ6-зависни урођени имунитет против хептозе{{5} },7-бисфосфат грам-негативних бактерија. ПЛоС Патхог 13:е1006224. хттпс://дои.орг/10.1371/јоурнал.ппат. 1006224

19. Зиммерманн С, Пфаннкуцх Л, Ал-Зеер МА ет ал (2017) АЛПК1- и ТИФА-зависни урођени имуни одговор покренут системом секреције хелицобацтер пилори типа ИВ. Целл Реп 20:2384–2395

20. Абреу МТ, Фуката М, Ардити М (2005) ТЛР сигнализација у цревима у здрављу и болести. Ј Иммунол 174:4453–4460 174/8/4453 [пии]

For more information:1950477648nn@gamil.com