Клонирање гена, функционална идентификација, структура и анализа експресије сахарозе синтазе из Цистанцхе Тубулоса

Апстракт:Сахароза синтаза игра кључну улогу у путу метаболизма биљног шећера катализујући производњу уридин дифосфат (УДП)-глукозе, која служи као биоактивни донор гликозила за различите метаболичке процесе. У овој студији, клониран је ген сахарозе синтазе по имену ЦтСусЦистанцхе тубулоса, традиционална кинеска медицина позната по свом богатомсадржај различитих гликозида, на основу резултата анализе транскриптома. Оквир отвореног читања ЦтСус-а био је дуг 2 418 бп и кодирао је 805 аминокиселина. Анализа секвенце открила је очуване домене повезане са фамилијом биљне сахарозе синтазе на Н-терминалном и Ц-терминалном региону ЦтСус протеина. Филогенетска анализа је показала да ЦтСус дели блиску еволуциону везу сасахарозне синтазеод других биљака у оквиру истог реда. Функционална идентификација ЦтСус је изведена кроз катализу целе ћелије са УГТ71БД1, карактеризованим ензимом гликозилтрансферазе. Резултати су показали да је увођење ЦтСус значајно повећало стопу конверзије гликозилације коју катализује УГТ71БД1. Растворљива експресија ЦтСус у Есцхерицхиа цоли је даље постигнута коришћењем пЦолд™ ТФ експресионог вектора. Ензимски тест ин витро је показао активност ЦтСус да катализује формирање УДП-глукозе у присуству сахарозе и УДП. Резултати ланчане реакције квантитативне полимеразе у реалном времену су показали да су обрасци експресије гена ЦтСус у различитим деловима Ц. тубулоса и суспензијских ћелијских култура Ц. тубулоса под стресом од суше у корелацији са обрасцима акумулације уоченим за фенилетанол гликозиде, респективно. Надаље, кључне аминокиселине и њихове интеракције између ензима и супстрата су истражене на основу предвиђања структуре протеина и резултата молекуларног спајања. Све у свему, наши налази идентификују сахарозу синтазу ЦтСус одговорну за снабдевање активног донора гликозила УДП-глукозе током биосинтезе гликозидних производа у Ц. тубулоса и такође су обезбедили генски елемент који се може користити у инжењерској конструкцији соја за производњу гликозидних производа.

Кључне речи: Цистанцхе тубулоса; сахароза синтаза; гликозиди; УДП-глукоза; ензимска катализа

ДИЦХЕН ЦИСТАНЦХЕ НЕГА БАЗЕ У ЈУТИЈАНУ, ХОТАН, КСИЊИАНГУ

Услуга подршке Вецистанцхе-а - највећи извозник цистанцхеа у Кини:

Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com

Вхатсапп/тел:+86 15292862950

Цистанцхе тубулоса (Сцхенк) Р. Вигхтје вишегодишња зељаста паразитска биљка из рода Цистанцхе из породице Оробанцхацеае. То је традиционални редак и драгоцен кинески медицински материјал, пореклом из Синђианга и Унутрашње Монголије. Слатке је, слане и топле природе и има функцијетонизирајући бубрег јанг, благотворна суштина и крв, и влажење црева иублажавање опстипације. Познато је као "пустињски гинсенг“ [1]. Савремена истраживања су то открилаЦистанцхе тубулосасадржиразне хемијске компонентекао што суфенилетаноидни гликозиди, иридоидни етар терпении њихови гликозиди, лигнани и њихови гликозиди, естри олигосахарида, полисахариди, полиоли, олигосахариди, стероли и њихови гликозиди, монотерпеноидни гликозиди, шећери, аминокиселине и испарљива уља [2,3], посебно гликозидна једињења су најважнији активни састојци. Међу њима, једињења фенилетаноидних гликозида имају највећи садржај у оригиналном медицинском материјалу и имају широк спектар фармаколошких активности као што су неуропротекција и анти-агинг [4]. Биосинтеза горе наведених гликозидних једињења укључује вишеструке кораке реакција гликозилације, које катализујугликозилтрансферазе у биљкама, и тхеобезбеђивање активних донора гликозилаје од суштинског значаја у овом процесу. Уобичајени активни донатори шећера у организмима укључују уридин дифосфат (УДП), тимидин дифосфат (ТДП) и гванозин дифосфат (ГДП). Међу њима, УДП-глукоза је најчешћи активни донор гликозила у биљкама. Не само да се може директно препознати помоћу глукозилтрансферазе да катализује реакцију трансфера глукозила, већ се може користити и као прекурсор за учешће у синтези других врста гликозил донора. На пример, УДП-глукоза се може користити као супстрат за генерисање УДП-рамнозе под катализом 4,6-дехидратазе, 3,5-изомеразе и 4-редуктазе[5]; УДП-глукоза се може користити као супстрат за катализацију синтезе УДП-ксилозе преко УДП-глукоза дехидрогеназе и УДП-ксилозе синтазе; УДП-ксилозу може даље катализирати УДП-ксилоза епимераза да би се створила УДП-арабиноза[6]; УДП-глукоза и УДП-галактоза су дијастереомери и могу се конвертовати један у други преко епимеразе[7,8]. Дакле, синтеза УДП-глукозе има важан утицај на снабдевање активним донорима гликозила у биљкама и модификацију гликозилације секундарних метаболита.

Синтеза УДП-глукозе у биљкама може се постићи путем синтазног, фосфорилазног и киназног пута. Међу њима, сахароза синтаза може директно катализовати реакцију између УДП и сахарозе за стварање УДП-глукозе и фруктозе, као и обрнуту реакцију [9]. У ширем смислу, сахароза синтаза припада подфамилији гликозилтрансфераза-4, која укључује низ гликозилтрансфераза, као што су фосфатаза синтезе сахарозе, трехалоза синтаза и трехалоза фосфорилаза [10]. Сахароза синтаза је први пут идентификована у пшеничним клицама [11]. Од тада, истраживачи су идентификовали стотине гена сахарозе синтазе из разних биљака као што су пасуљ мунг (Вигна радиата), пиринач (Ориза сатива), кукуруз (Зеа маис), соја (Глицине мак) и бресква (Амигдалус персица). Они су укључени у више метаболичких процеса у биљкама, укључујући транспорт и дистрибуцију сахарозе, синтезу скроба, синтезу целулозе и састав ћелијског зида, биотички и абиотички стрес, итд., И играју кључну регулаторну улогу у алокацији извора угљеника у биљци [12]. Осим тога, на основу проучавања физиолошких функција, истраживачи су такође користили добијену сахарозу синтазу као генски елемент за ензимску синтезу гликозидних једињења и постигли идеалне резултате. На пример, Масада ет ал. [13] ко-експримирао ген сахарозе синтазе АтСус-1 из Арабидопсис тхалиана и ген гликозилтрансферазе ЦаУГТ2 из Цатхарантхус росеус ин витро, и користио двоструки ензимски систем у једној посуди да катализује реакцију гликозилације куркумина, што је повећало принос куркумин гликозида за 7 пута. Истовремено, количина коришћеног донора УДП-глукозе била је само једна десетина почетне количине.

Бунгаруанг и др. [14] су конструисали спрегнути каталитички систем користећи сахарозу синтазу ГмСуСи из соје и гликозилтрансферазу ОсУГТ из пиринча. Они су постигли модификацију гликозилације нотофагина додавањем само мале количине УДП (1.0 ммол·Л-1) и сахарозе. У поређењу са једном ензимском катализом ОсУГТ, производња продуката гликозилације порасла је за три реда величине, од μмол·Л-1 до мол·Л-1.

Богатство и разноврсност гликозидних једињења у Цистанцхе тубулоса сугерише да би требало да садржи моћну сахарозу синтазу повезану са модификацијом гликозилације секундарних метаболита, али овај ензим није пријављен у биљкама из рода Цистанцхе. У овом раду као материјал је коришћен Цистанцхе тубулоса, медицински материјал укључен у фармакопеју. Кроз анализу транскриптома и компаративну анализу транскриптома различитих делова, коришћене су технике молекуларне биологије за ископавање и идентификацију гена сахарозе синтазе ЦтСус. Биоинформатичка анализа, биотрансформација целе ћелије, прокариотска експресија и пречишћавање, ин витро анализа каталитичке активности ензима и анализа експресије гена у различитим деловима система Цистанцхе тубулоса и културе биљног ткива под стресом од суше су спроведене да би се истражила функција ЦтСус и његова корелација са биосинтеза гликозидних једињења у Цистанцхе тубулоса, постављајући основу за проучавање биосинтетског пута гликозидних једињења у Цистанцхе тубулоса.

Материјали и методе

Материјали Свеже биљке Цистанцхе тубулоса су сакупљене из града Хотан, Ксињианг, Кина, а биолошку идентификацију је извршио професор Ту Пенгфеи са Универзитета у Пекингу; систем ћелијске културе суспензије Цистанцхе тубулоса успоставила је наша истраживачка група у раној фази [15]; Е. цолиФаст-Т1 је купљен од Нањинг Новозимес Биотецх Цо., Лтд.; Е. цоли БЛ21 (ДЕ3) је купљен од Беијинг Куансхијин Биотецхнологи Цо., Лтд.; пЦолд™ И и пЦолд™ ТФ вектори су купљени од Био-Тецх (Беијинг) Цо., Лтд.; Контрола УДП-глукозе је купљена од Кси'ан Кииуе Биотецхнологи Цо., Лтд., а супстрати за ескулин и ресвератрол су купљени од Схангхаи Иуание Биотецхнологи Цо., Лтд.

ДИЦХЕН ЦИСТАНЦХЕ НЕГА БАЗЕ У ХОТАНУ, КСИЊИАНГ

Екстракција РНК и синтеза цДНК РНК је екстрахована у складу са упутствима ОМЕГА РНА Плант Кит-а (Цат Р6827-01, Омега Био-Тек). За детекцију чистоће, концентрације и интегритета РНК коришћени су електрофореза у агарозном гелу и спектрофотометар Нанодроп 2000. Квалификовани узорци РНК су реверзно транскрибовани коришћењем комплета за реверзну транскрипцију ТрансСцрипт® ОнеСтеп гДНК Ремовал и цДНК Синтхесис СуперМик (Цат АТ311-02, Беијинг Куансхијин Биотецхнологи Цо., Лтд.) да би се синтетизовао први ланац цДНК.

Ископавање гена сахарозе синтазе и клонирање гена ЦтСус Као шаблон је коришћена аминокиселинска секвенца функционално идентификоване Арабидопсис тхалиана сахароза синтазе АтСус1 (ГенБанк приступни број: АЕД92894.1)[16]. Гени сахарозе синтазе су скринирани из података о транскриптому Ц. тубулоса помоћу локалног поравнања Бластп секвенце, у комбинацији са анотацијом гена транскриптома, анализом ФПКМ (изобиља генске експресије) и компаративном анализом података о транскриптому. Специфични прајмери ​​су дизајнирани на основу информација о секвенци кандидата гена које су дате транскриптомским подацима друге генерације Ц. тубулоса (Табела 1). цДНК Ц. тубулоса је коришћена као шаблон и ПЦР амплификација циљног гена је изведена коришћењем ПЦР ензима високе верности (Цат П505-д1, Нањинг Новозимес Биотецх Цо., Лтд.). Производ ПЦР амплификације је пречишћен коришћењем Мини комплета за екстракцију ДНК ФастПуре Гел (Цат ДЦ201-01, Нањинг Новозимес Биотецх Цо., Лтд.), а затим клониран у складу са комплетом за брзо клонирање (Цат Ц112-01, Нањинг Новогене Биотецх Цо., Лтд.) је повезан са вектором за клонирање пЦЕ2 ТА/Блунт-Зеро у складу са упутствима за употребу, пребачен у ћелије компетентне за Фаст-Т1 и култивисан преко ноћи на 37 степени. Плазмид је екстрахован и достављен Беијинг Лиухе БГИ Геномицс Цо., Лтд. на идентификацију секвенце.

Табела 1 Нуклеотидна секвенца прајмера коришћених у овој студији. кПЦР: квантитативна реакција полимерасе ланца у реалном времену

Биоинформатичка анализа сахарозе синтазе ЦтСус из Цистанцхе тубулоса

За анализу физичко-хемијских својстава протеина коришћен је онлајн софтвер ПротПарам (хттпс://веб.екпаси.орг/протпарам/); онлајн софтвер ТМХММ (хттпс://сервицес.хеалтхтецх.дту.дк/сервицес/ТМХММ{{0}}.0/) је коришћен за предвиђање трансмембранске структуре протеина; онлајн софтвер СОПМА (хттпс://нпса-раби.ибцп.фр/цги-бин/нпса_аутомат.пл?паге=нпса_сопма.хтмл) је коришћен за предвидети секундарну структуру протеина; онлајн софтвер СМАРТ (хттп://смарт.ембл.де/) је коришћен за предвиђање очуваног домена протеинске аминокиселинске секвенце; коришћен је софтвер ДАНМАН за поређење аминокиселинских секвенци ЦтСус са онима сахарозних синтаза других врста; Филогенетско стабло је конструисано кластер анализом коришћењем методе спајања суседа коришћењем софтвера МЕГА11, са понављањем покретања од 1,000 пута.

Анализа експресије ЦтСус у различитим деловима Цистанцхе тубулоса и под стресом од суше

Квантитативни ПЦР прајмери ​​за флуоресценцију у реалном времену за ЦтСус и интерни референтни ген ДНКј су дизајнирани коришћењем ДНАМАН софтвера [17] (Табела 1). Релативни ниво експресије ЦтСус гена у ћелијама суспензије Цистанцхе тубулоса у различитим деловима Цистанцхе тубулоса и под стресом од суше анализиран је квантитативним ПЦР-ом флуоресценције у реалном времену. Квантитативна ПЦР анализа флуоресценције у реалном времену је изведена коришћењем ТрансСтарт® Топ Греен кПЦР СуперМик комплета (Цат АК131-01, Беијинг Куансхијин Биотецхнологи Цо., Лтд.). Програм амплификације је усвојио метод у два корака: 94 степена за 30 с; 94 степена за 5 с, 60 степени за 30 с, поновљено за 40 циклуса; покренут је на Био-Рад ЦФКС Цоннецт™ систему за детекцију ПЦР у реалном времену (Био-Рад Лаборатори, Херцулес, Калифорнија, САД). 2–ΔΔЦТ метода је коришћена за анализу релативне експресије ЦтСус гена у различитим експерименталним групама. ГрапхПадПрисм 9 је коришћен за анализу значајности и за цртање тракастог графикона.

Конструкција прокариотског експресионог вектора и хетерологне експресије ЦтСус гена На основу резултата секвенцирања гена, дизајнирани су специфични прајмери ​​који садрже кракове хомологије вектора и рестрикциона места (Табела 1) за ПЦР амплификацију. Циљни ген ЦтСус је конструисан у пЕТ-28а, пЕТ-24б, пЦолд™ И и пЦолд™ ТФ векторе експресије коришћењем бешавне технологије клонирања коришћењем ЦлонЕкпресс Ултра Оне Степ Цлонинг Кит (ЦатЦ115-01 , Нањинг Новогене Биотецх Цо., Лтд.). Плазмиди успешно конструисаних рекомбинантних експресионих вектора су екстраховани и трансформисани у ћелију Трансетта (ДЕ3) компетентну за експресију Есцхерицхиа цоли. Ћелије су узгајане у ЛБ течном медијуму који садржи 50 µг·мЛ-1 канамицин сулфата (са пЕТ-28а и пЕТ-24б као експресионим векторима) или 1{{ 22}}0 µг·мЛ-1 ампицилина (са пЦолд™ И и пЦолд™ ТФ као векторима експресије) и 50 уг·мЛ-1 хлорамфеникола, респективно, на 37 степени и 200 р·мин{{ 15}} уз мућкање док вредност А600 бактеријског раствора не достигне 0.4-0.6. Додајте изопропил-бета-Дтиогалактопиранозид (ИПТГ) у коначној концентрацији од 0,5 ммол·Л-1 да бисте изазвали експресију протеина. Инкубирајте у шејкеру са константном температуром на 23 степена (са пЕТ-28а и пЕТ-24б као векторима експресије) или 15 степени (са пЦолд™ И и пЦолд™ ТФ као векторима експресије), 180 р· мин-1 током 16 х (са пЕТ28а и пЕТ-24б као експресионим векторима) или 24 х (са пЦолд™ И и пЦолд™ ТФ као векторима експресије), а затим сакупите бактерије центрифугирањем.

Пуфер за лизу (20 ммол·Л-1 НаХ2ПО4-На2ХПО4, 0.5 мол·Л-1 НаЦл, 20 ммол·Л{{10} } имидазол, 3% глицерол, 100 ммол·Л-1 фенилметилсулфонил флуорид, 1 мг·мЛ-1 лизозим, пХ 7,4) и ћелије су разбијене 8 минута и центрифугиране. Узети су супернатант и талог. Супернатант је адсорбован помоћу ХисТрап ФФ афинитетне колоне (Цат 17531901, Цитива) напуњеном Ни Сепхаросе 6 Фаст Флов пунилом да би се адсорбовао циљни протеин који садржи Хис таг. После елуирања са различитим концентрацијама имидазола, свака фракција је узета за СДС-ПАГЕ (електрофореза натријум додецил сулфат-полиакриламид гела) детекцију. Фракције које садрже циљни протеин су комбиноване, концентрисане центрифугирањем и десаљене помоћу ултрафилтрационе цеви (Миллипоре) и ускладиштене у пуферу [који садржи 50 ммол·Л-1 Трис-ХЦл (пХ 7,5), 0,2 мол·Л{{ 30}}НаЦл, 1 ммол·Л-1 дитиотреитол, 3% глицерол] за накнадне ин витро реакције ензимске катализе.

ЦтСус катализа целих ћелија ПЦолд™ И-ЦтСус плазмид и експресиони плазмид пЕТ-28а-УГТ71БД1[18] гликозилтрансферазе УГТ71БД1, које је истраживачка група раније идентификовала, истовремено су трансформисани у компетентну експресију Е. цоли Трансета (ДЕ3). Позитивне рекомбинантне бактерије које садрже и ЦтСус и УГТ71БД1 гене су одабране и инокулиране у ЛБ медијум (медиј за раст) који садржи 50 уг·мЛ-1 канамицин сулфата, 100 уг ·мЛ-1 ампицилина и 50 уг·мЛ-1 хлорамфеникола у односу 1:100 (В/В). Култура је култивисана на 37 степени све док вредност А600 бактеријског раствора није била 0.4-0.6, а затим је додат ИПТГ у коначној концентрацији од 1 ммол·Л-1. Култура је настављена на 15 степени и 180 о/мин-1 током 24 х. Култура је центрифугирана на 4 степена и 4 000 р·мин-1. Сакупите ћелије. Инокулирајте сакупљене ћелије у медијум М9 (медијум за ферментацију) у односу од 40 мЛ медијума за културу по граму бактерије и додајте 75 μмол·Л-1 сахарозе и 25 μмол·Л-1 ескулетина (1) или ресвератрол (2) супстрати реакционим групама. Наставите да мућкате културу 24 х, центрифугирајте на 4000 × г, 4 степена 30 минута, додајте метанол да ултразвучно разбије талог, додајте 2 пута већу запремину метанола у супернатант, центрифугирајте на 4000 × г, 4 степена 30 минута, узети супернатант и комбиновати, испарити растварач под сниженим притиском, поново растворити у метанолу, филтрирати кроз мембрану филтера од 0,22 μм и детектовати производ реакције коришћењем Агилент 1260 течног хроматографа високих перформанси. ЦАПЦЕЛЛ ПАК Ц18 КОЛОНА (250 мм×4,6 мм, 5 µм) је коришћена као аналитичка колона, 0,1% мравље киселине вода (А) и метанол (Б) су коришћени као мобилна фаза, а градијент елуирања је био: {{61 }} мин, 30%-90% Б; 25-27 мин, 90%-100% Б; 27-33 мин, 100% Б. Параметри масене спектрометрије били су модус позитивних и негативних јона и аутоматско вишестепено МС1, МС2 и МС3 потпуно скенирање.

Детекција каталитичке активности ЦтСус ин витро ензима Рекомбинантни протеин добијен горе поменутом ХисТрап ФФ колонском афинитетном хроматографијом је подвргнут уклањању терминалне ознаке коришћењем фактора Кса. Систем за варење ензима је био следећи: рекомбинантни протеин је подешен на концентрацију од 1 мг·мЛ-1, а 1 μЛ Фактор Кса је додат у 50 μЛ рекомбинантног протеина у пуферу од 20 ммол·Л-1 Трис-ХЦл (пХ 8,0), 100 ммол·Л-1 НаЦл и 2 ммол·Л-1

ЦаЦл2 на 23 степена током 6 х. Реакциони систем је био 100 μЛ. Производ система за варење ензима је подвргнут секундарном раздвајању протеина помоћу ХисТрап ФФ афинитетне хроматографије да би се добио циљни протеин са уклањањем ознаке за накнадне ин витро реакције ензимске катализе. Ензимски реакциони систем је био следећи: 10 ммол·Л-1 УДП, 100 ммол·Л-1 сахарозе, 50 ммол·Л-1 МгЦл2, 60 уг ЦтСус протеина, Трис-ХЦл (пХ 7.0) допуњен до 100 μЛ, реаговао у воденом купатилу на 30 степени током 6 х, а методе накнадног третмана и ХПЛЦ анализе су спроведене као што је описано у референци [19].

Предвиђање тродимензионалне структуре и молекуларна анализа пристајања ЦтСус протеина АлпхаФолд2 коришћена је за предвиђање тродимензионалне структуре ЦтСус протеина [20]. Молекул лиганда је хидрогенизован и напуњен коришћењем софтвера АутоДоцк Тоолс 1.5.6. Џеп за везивање супстрата је добијен поравнавањем са шаблонским протеином АтСус1 (ПДБИД 3С28). Бочни ланци аминокиселинских остатака око шупљине су постављени да буду флексибилни.

Мрежни оквир је постављен на 40 × 40 × 40 А3, а размак мреже је био 0,375 А. Молекуларно спајање је изведено у АутоДоцк Вина [21]. Софтвер ПиМОЛ 2.0 је коришћен за визуелизацију модела са најбољим афинитетом (кцат·мол-1

).

Статистичка анализа За статистичку анализу коришћен је ГрапхПад Присм 9. Експериментални подаци су изражени као средња вредност ± стандардна девијација. За поређење између две групе коришћен је т тест, а за поређење између више група коришћена је једносмерна анализа варијансе. Разлика се сматрала статистички значајном када је П < 0.05.