Госипитрин, природни флавоноид, ублажава оштећење неурона и митохондрија изазвано гвожђем: 2. део

Контактирајтеoscar.xiao@wecistanche.comза више информација

2.5. Детекција Гос-Фе(И) комплекса

Уверљива хипотеза која објашњава горње резултате је да Гос формира пролазни комплекс са Фе(лл) који олакшава његову оксидацију кисеоником. Овај прелазни комплекс би могао да испоручи своје електроне лакше од Фе()-цитрата, стварајући стабилнији комплекс са Фе(Илл). Слика 6А приказује типичан спектар Гос са максималном апсорпцијом на 276, 332 и 380 нм (црна линија). Додавање Фе() изазвало је пад максималних апсорпционих пикова у зависности од концентрације и појаву новог близу 500 нм (слика 6А). Појава низа спектра који потичу из Гос спектра је потврђена присуством изосбестичне тачке на λисо=405 нм (види црне тачке), што указује на хемијску равнотежу (комплексацију) између слободног и комплексираног Гос. Уметак (Слика 6А) показује формирање комплекса са стехиометријом 2:1 (Гос-гвожђе). Стехиометрија таквих комплекса Гос-гвожђе одређена је Јобовом методом која показује тачку лома при моларном односу од 0,5.

Кликните овде да бисте сазнали више

Даљи докази о корелацији између гвожђа и Гос добијени су ИР спектроскопијом (слика 6Б). За слободни Гос и његов комплекс гвожђа, широкопојасни опсег који се налази у опсегу од 3000-4000 цм- сматран је истезањем водоника- везане хидроксилне групе због присуства молекула воде. Мод в(Ц=О) истезања слободног Гос-а се јавља на 1654 цм-И, који је померен ка 1636 цм-Иу након формирања комплекса. Овај резултат сугерише да је Фе(Ⅱ) у корелацији са карбонил кисеоником [31]. Штавише, присуство в (Фе-О) вибрације истезања на 630 цм-И потврђује формирање комплекса гвожђе-Гос, пошто слободни Гос не показује такву траку.

Слика 6. (А) Ефекти Фе(ИИ) на Гос УВ-ВИС спектар (200-600 нм). Инкубациона смеша која садржи 125 мМ сахарозе, 65 мМ КЦл, 10 мМ ХЕПЕС пуфера (пХ 7,2), 2 мМ цитрата и Гос 1,6 μМ. Концентрације Фе (И) од врха до дна су биле {{12 }}, 0.16, 0.32, 0.48, {{20}}.64,0.8,0.96 и 1.12 μМ.Инсет∶ Јобов дијаграм за комплекс Гос-Фе(ИИ) при константној укупној концентрацији 【Фе（Д）】 плус 【Гос】=1.6 μМ. Црна тачка означава изосбестичку тачку. Стрелице надоле и нагоре показују смањење и повећање вредности апсорпције на 380 и 500 нм, респективно. Експерименти су спроведени на 28 степени. Брзина скенирања је била 2 нм/с. Основна линија је успостављена са мешавином за инкубацију плус 1,6 μМ Фе (И) (Б) Инфрацрвени спектри Гос и Гос-Фе (И). Приказани су типични примери.

2.6. Гос је спречио редукцију Фе(ИИИ) аскорбатом

Гвоздено стање гвожђа које промовише Гос представља вероватан антиоксидативни механизам јер омета каталитичку активност Фе(ИИ). Ипак, Фе(ИИИ) још увек може да се поново редукује у свој гвоздени облик природним редукционим агенсима као што је аскорбат. Потоњи би могао поново напунити биолошке системе са Фе(ИИ), који учествује у Фентон-Хабер-Веисс реакцијама, стварајући екстремно реактивни·ОХ радикал. Да бисмо испитали ове могућности, користили смо 1,10-фенантролин за мерење нивоа формирања Фе(ИИ) из Гос раствора (100 μМ) третираног са 2 мМ аскорбата и различитим концентрацијама Фе(ИИ) （{{6} } μМ）. Слика 7 показује да је одсуство Гос омогућило максималну брзину редукције Фе(ИИ) до Фе(ИИ) (црна линија са нагибом од 5,85×10-3); међутим овај процес је успорен присуством Гос (1-мин инкубације, зелена линија), а након 5 минута инкубације са Гос, стопа редукције Фе(И) аскорбатом се смањила скоро 3 пута (црвена линија са нагибом од 2,04× 10-3). Овај резултат показује способност Гос-а да инхибира редукцију Фе() посредовану аскорбатом у Фе(И)

Слика 7. Гос инхибира Фе(ⅢИ)-редукцију аскорбатом у одсуству митохондрија јетре пацова. Експериментални услови: 125 мМ сахароза, 65 мМ КЦл, 10 мМ ХЕПЕС пуфер (пХ7,2), 1 мМ цитрат, Гос 100 μМ. Експерименти су спроведени на 28 степени. Аскорбат (4 мМ) и 5 ​​мМ 1,10-фенантролина су додати након 1 мин или 5 мин Гос-Фе(И) инкубације. Линије су репрезентативне за три теста.

2.7. Гос штити од 2-дезоксирибозне оксидативне деградације

Да би се документовала способност Гос-а да првенствено делује на гвожђе уместо на слободне радикале, спроведене су студије конкуренције како би се проценила ефикасност Гос и два·ОХ чистача (ДМСО и салицилат) у заштити 2,8 или 28 мМ 2-деоксирибозе од гвожђа -посредовано оксидативно оштећење (Слика 8).·ОХ чистачи на 20 мМ заштитили су 28 мМ 2-деоксирибозе значајно мање од 2,8 мМ2-деоксирибозе (п<0.05), as="" expected.="" gos="" was="" equally="" effective="" in="" preventing="" oxidative="" degradation="" of="" both="" 2.8="" and="" 28="">

Слика 8. Ефекат хватача Гос и·ОХ диметил сулфоксида (ДМСО) и салицилата на оксидативно оштећење 2,8 или 28 мМ 2-деоксирибозе изазвано Фе(ИИ)-ЕДТА плус аскорбатом. Раствори су инкубирани 30 мин на 37 степени и садржали су 10 мМ фосфатног пуфера (пХ7,2), 2-деоксирибозу (2,8 или 28 мМ), 150 μМ ЕДТА и 50 μМ Фе (ⅢИ) Реакције су започете додавањем аскорбата до коначне концентрације од 2 мМ. Траке показују средње вредности ±СД (н=3) Контроле садрже само ДМСО (0,001 процената), што је концентрација растварача у Гос узорцима. Једнострани т-тест је коришћен за *п<0.05, n.s.,="">

3. Дискусија

Гвожђе које се ослобађа у неколико неуродегенеративних стања, укључујући исхемијски и хеморагични мождани удар, провоцира дерегулацију хомеостазе гвожђа у мозгу, што доводи до патофизиологије неуролошких повреда [4,32-34]. На субћелијском нивоу, оштећење митохондрија изгледа да је укључено у неуронску смрт посредовану гвожђем [10,15,35-38]. Претклинички докази подржавају предност употребе хелатора гвожђа, углавном дефероксамин мезилата, против неуродегенерације укључујући све врсте можданог удара [7,16]. Међутим, њихова висока цена и недоступност, као и широк спектар штетних ефеката класичних хелатора гвожђа, довели су до употребе природних хелатора за управљање гвожђем у дисхомеостази [39,40].

Цистанцхе може побољшати имунитет

Заштитно дејство Гос-а је приказано на ХТ-22 ћелијама и митохондријама мозга пацова инкубираних са мешавином гвожђа/цитрата, где смо пронашли снажну заштиту од оксидативног оштећења изазваног гвожђем. Хипокампалне ХТ-22 ћелије миша изложене преоптерећењу гвожђем (24 х) показале су смањену виталност, што је било уско повезано са раном дисипацијом потенцијала митохондријалне мембране и смањењем АТП-а (Слика 2А-Ц, респективно). Ово сугерише да оштећење митохондрија доприноси смртности неурона. Заиста, у нашим условима, очекује се да ће барем део Фе(ИИ) који је унесен у неуроне доспети до органела, пошто је неуронској смрти изазваној гвожђем претходио губитак митохондријалне функције. Стога је показано да преоптерећење гвожђем изазива смрт ХТ-22 ћелија хипокампуса миша и фрагментацију митохондрија [41,42]. Слично, континуирано излагање гвожђу повећава нивое митохондријалних РОС у ћелијама допаминергичког неуробластома СХСИ5И [43]. Штавише, екстензивни прилив гвожђа у неуроне хипокампуса, као и оштећење митохондрија, верификовани су након излагања 100 уМ обојеног гвожђа [36]. Овде смо приметили да је Гос-индуковано очување виталности неурона хипокампуса на које утиче гвожђе уско повезано са очувањем њиховог потенцијала митохондријалне мембране и нивоа АТП-а.

Као иу нетакнутим ћелијама, директно излагање митохондрија жељезном гвожђу изазвало је екстензивно отицање органеле, дисипацију мембранског потенцијала и губитак АТП (Слика 3А-Ц, респективно). У овом експерименталном окружењу, Гос је успео да заштити гвожђем преоптерећене митохондрије, што је било изражено очувањем горе наведених параметара. У том смислу, примећено је да су митохондрије напуњене микромоларном концентрацијом гвожђа претрпеле отварање пора у прелазној пермеабилности митохондрије и △И дисипацију на начин који је осетљив на хелацију гвожђа, али не зависи од антиоксидативног дејства каталазе |44]. Занимљиво је да је објављено да антиоксидант Мито-Темпо штити од оштећења хипокампалних неурона преоптерећења гвожђем тако што уклања митохондријски супероксид ањонски радикал и чува морфолошки интегритет митохондрија и мембрански потенцијал [36]. Недавно смо описали антиоксидативне ефекте овог флавоноида и његову способност да заштити ПЦ12 ћелије од смрти изазване хемијском хипоксијом [29], где је закључено да је уклањање слободних радикала и антиоксидативна способност Госа делимично укључена у заштиту од гвожђа посредованих ХТ-22 и оштећење митохондрија. Међутим, побољшана ефикасност Гос-а против липопероксидације посредоване гвожђем у односу на липопероксидацију посредовану тертбутил хидропероксидом (Слика 4А, Б, респективно) снажно сугерише да је његов капацитет интеракције са гвожђем главни механизам против оштећења изазваног гвожђем.

Да би се додатно окарактерисала интеракција Гос-Фе, изведено је неколико експеримената без ћелија и митохондрија. Приметили смо да када је полифенол коинкубиран са Фе (ИИ), концентрација металних јона опада, док је дошло до одговарајућег повећања брзине потрошње кисеоника (Слика 5А-Ц). Ови ефекти сугеришу да Гос уклања Фе(ИИ) из цитратног комплекса и оксидира га у форму гвожђа у процесу који захтева О2 као акцептор електрона. Сходно томе, Гос промовише пад концентрације Фе(ИИ) који може ометати хидроксилне радикале кроз Фентонове реакције. Пошто Гос-Фе(ИИ) комплекс омогућава оксидацију релевантних редукционих агенаса као што је аскорбат, што резултира формирањем/регенерацијом Фе(ИИ), успели смо да покажемо да Гос инхибира редукцију Фе(ИИ) посредовану аскорбатом. до Фе(ИИ).

Хипотеза да Гос снажно реагује са гвожђем је такође овде потврђена спектроскопским техникама и поткрепила је претходне резултате где су различити низови

Стехиометрија комплекса Гос-гвожђа је окарактерисана масовном спектроскопијом електронске спин јонизационе масе [45].

Ови резултати су доказали заштитне ефекте Гос-а против оштећења неурона посредованих гвожђем, вероватно интеракцијом са јонима гвожђа, ометајући његово учешће у формирању каталитичких реактивних врста кисеоника. Штавише, ово сугерише формирање пролазног комплекса за пренос наелектрисања између Фе(Ⅱ) и Гос, убрзавајући оксидацију Фе(ИИ) и формирање стабилнијег комплекса Фе(ИИИ)-Гос који не може да учествује у фази пропагације липида. пероксидација. Штавише, биолошки релевантно редукционо средство као што је аскорбат није било у стању да редукује фери гвожђе у присуству Гос-а, ограничавајући прооксидативну карактеристику одређених флавоноида који су укључени у рециклирање гвожђа. [30]. Гос у микромоларним концентрацијама био је ефикаснији од класичних чистача у спречавању оксидације 2-дезоксирибозе посредоване гвожђем. Ова висока ефикасност се може приписати формирању редокс активног Гос-Фе(ИИ)/() као што смо раније приметили за друге полифеноле који су побољшали свој учинак као антиоксиданса након интеракције са гвожђем у различитим ин витро парадигмама оксидативног оштећења [ 22,46-48].

Утврђено је да хелатни агенси који садрже кисеоник као лиганд (оксо лиганд, О2-) могу хелирати гвожђе и подстаћи оксидацију Фе(И), стабилизацију Фе(ИИ), а самим тим и смањити његов редукциони потенцијал49]. При физиолошком пХ, катехоли лако формирају термодинамички стабилне бис комплексе са фери гвожђем, чему фаворизују ниске концентрације лиганада. Присуство катехолног дела у Гос структури сугерише сличан механизам интеракције са гвожђем, што би могло да објасни постигнуту заштиту од оштећења неуронских ћелија и митохондрија изазваних гвожђем. С тим у вези, такође смо претходно показали да мангиферин и гутиферон А стимулишу оксидацију гвожђа и ометају редукцију гвожђа [23,24,26-28].

Способност Гос-а да хелатира гвожђе такође може да подстакне сигналне путеве који доприносе неуропротекцији. На пример, ензими домена пролил хидроксилазе (ПХД), класични ензими који модификују хидроксилацију-лалфа(ХИФ-1о) фактор индуцибилног хипоксијом под нормоксијом, идентификовани су као критичне мете хелатора гвожђа који су клинички корисни у многим неуролошки поремећаји [50,51]. То је разумљиво јер ПХД зависи од двовалентног гвожђа као фактора спајања [52]. Неколико гена који су укључени у неуропротекцију регулише ХИФ-ла, као што су еНОС, ВЕГФ и ЕПО[53]. Штавише, активација ХИФ-а која је резултат инхибиције ПХД-а може спречити оштећење митохондрија и апоптозу посредовано оксидативним стресом, независно од његове улоге транскрипционог фактора [54].

Фероптоза, недавно окарактерисана регулисана ћелијска смрт зависна од гвожђа, предложена је као механизам преко кога умиру неурони изложени хеморагијском оштећењу [8]. Митохондријална дисфункција је недавно била повезана са смрћу ћелија фероптозе [55]. Стога, инхибиција фероптозе, која чува функцију митохондрија од оштећења гвожђа, такође може бити вероватан механизам за неуропротекцију против неуролошких поремећаја посредованих гвожђем које штити Гос, што би заслужило даљу пажњу. Потребно је извршити додатна истраживања о претпостављеним корисним ефектима Гос-а на ин виво животињске моделе неуродегенерације повезане са гвожђем, како би се овај флавоноид предложио као терапеутска интервенција против оштећења можданог ткива изазваног дерегулацијом хомеостазе гвожђа.