Госипитрин, флавоноид који се појављује у природи, ублажава оштећење неурона и митохондрија изазвано гвожђем, део 3

Контактирајтеoscar.xiao@wecistanche.comза више информација

4. Материјали и методе 4.1. Реагенси

Сви реагенси су добијени од Сигма-Алдрицх Цорп. (Сент Луис, МО, САД). Основни раствори Гос-а су припремљени у ДМСО и додати у ћелијске културе или митохондријалне препарате у 1/1000 (о/о) разблажењима.

Кликните овде да бисте сазнали више

4.2. Биљни материјал

Биљни материјал (цвеће) са Талипарити елатум (Св.) (Син. Хисбисцус елатус Св.) (Малвацеае) је сакупљен током марта 2020. године из околних подручја Центра за истраживање и биолошке процене, Института за фармацеутске и прехрамбене науке, Ла Лиса , Хавана, Куба. Аутентификовали су их стручњаци хербарије Универзитета у Камагују „Игнацио Аграмонте Лојназ“, где су депоновани узорци ваучера: Г. Пардо., ХПЦ-12 520 (ХИПЦ).

Цистанцхе може побољшати имунитет

4.3. Припрема екстракта и узорака

Тхеетанолекстракти су припремљени од црвених цветова Телатума као што је раније објављено [29]. Након ротоевапорације, чврсте материје су пречишћене поступцима рекристализације[29]. Изолована једињења су окарактерисана помоћу 1Д'Х (400 МХз) и 13Ц (100 МХз) НМР. НМР обрада података је обављена помоћу софтвера МестРеНова верзије 6.1.0-6224 за Виндовс (додатни материјали, слике С1-С3). НМР подаци прикупљени од Гос-а упоређени су са претходним резултатима [56].

4.4. УВ/Вис и ИР спектроскопске студије

УВ/Вис спектри су изведени у кварцним киветама дужине оптичке путање 10 мм, а апсорбанца је забележена у УВ-ВисспектрофотометарУлтроспец 2100 Про компаније Амерсхам БиоСци (Литтле Цхалфонт, УК) повезан са рачунаром са софтвером Ваве Сцан (СВИФТ И, 1.2) на собној температури. Интеракција између Гос и феро јона је мерена праћењем промена у УВ/Вис спектру. Јобов метод је коришћен за одређивање стехиометријског односа између Гос и Фе(ИИ) јона. Основни раствори Гос и Фе(лИ) припремани су свакодневно у метанолном и фосфатном пуферу, респективно. ИР спектри су снимљени на ЈАСЦО ФИ/ИР-440 спектрометру у опсегу од 4000-400 цм-И, коришћењем пелета калијум бромида за припрему узорака.

4.5. Целл Цултурес

МишхипокампалниХТ-22 ћелије (АТЦЦ) су узгајане у медијуму ДМЕМ са додатком 10 процената ФЦС, Л-глутамина (1 мМ) и пеницилина/стрептомицина (1 проценат), и одржаване на 37 степени у влажном 5 процената ЦО2 инкубатор. Ћелије (2×104 ћелија/бунарић) су засејане у 96-плоче са бунарима (Нунц, Роскилде, Данска) у 200 μЛ медијума за културу током 24 х на 37Ц.

4.6. Индукција оштећења ћелија оксидатиком и третман са Гос

Неуропротективно дејство Гос (0.001-100 μМ) је тестирано на ХТ-22 помоћу коинкубације током 24 сата са Гос или Тролоком (500 μМ), ФеЦл2 (100 μМ) и цитрат (1 мМ). Након 24 х, ћелијски супернатант је уклоњен и виталност ћелије је измерена помоћу [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолијум бромид] (МТТ) колориметријски тест.

4.7. Тест виталности ћелија

После третмана, ћелије (2 × 104) су инкубиране са 10 уМ МТТ током 3 х на 37°Ц. Обојени МТТ дериват је затим растворен у 50 μЛ ДМСО, а апсорбанца је избројана на 570 нм на читачу микроплоче (ФЛУОстар Омега, БМГ ЛАБТЕЦХ, Ортенберг, Немачка). Вијабилност ћелија је изражена као проценат у односу на контролу нетретираних ћелија.

4.8. Тест потенцијала митохондријалне мембране (△И) у ХТ-22 ћелијама

Митохондријскимембрански потенцијал је процењен на основу ретенције ћелија флуоресцентне катјонске сонде родамина 123 [57,58]. После 2 х повреде гвожђа/аскорбата у одсуству (контрола) или у присуству Гос (0.001-100 μМ) или Тролок (500 μМ), неуронске ћелије (2 ×10*） су инкубирани 10 минута са 1 μМ родамином 123. Након центрифугирања и ресуспензије у 1 мЛ 0,1 процента Тритон Кс-100, концентрација сонде је одређена у супернатанту помоћу читача микроплоче (ФЛУОстар Омега, БМГ ЛАБТЕЦХ, Ортенберг, Немачка) на пару таласних дужина ексцитације/емисије 505/535 нм. Подаци су изражени у процентима у односу на контролу нетретираних ћелија.

4.9.АТП тест

Ћелијски АТП је одређен системом теста луциферин/луциферазе свијећњака [59] под истим условима као АИ. Биолуминисценција је мерена Сигма-Алдрицх комплетом за анализу према упутствима произвођача, користећи опцију луминесценције читача микроплоче (ФЛУОстар Омега, БМГ ЛАБТЕЦХ, Ортенберг, Немачка).

4.10.Животиње

Мужјаци Вистар пацова (200 г) су добијени из Центра за производњу лабораторијских животиња (ЦЕНПАЛАБ према шпанском акрониму, Хавана, Куба) и смештени су у објекту за негу животиња 1 недељу пре експеримената на температури- контролисано окружење (22-24 степен), са циклусом светлости/мрака 12-х и са приступом храни и води ад либитум.

4.11.Митохондријална изолација

Митохондрије предњег мозга пацова су изоловане диференцијалним центрифугирањем као што је претходно описано [60]. Дигитонин 10 процената је коришћен да поремети синаптозоме и добије мешавину несинаптозомалних плус синаптозомалних митохондрија. Цела процедура је спроведена на 4 степена. Однос контроле дисања (стање 3/стање 4 респираторна брзина) је увек био у опсегу од 4,5 до 6,0, мерено коришћењем 5 мМ сукцината као супстрата.

4.12. Митохондријски тестови за континуирано праћење

Потенцијал митохондријске мембране одређен је спектрофлуориметријски коришћењем 10 μМ сафранина О као сонде 【58,61】 у читачу микроплоче (ФЛУОстар Омега, БМГ ЛАБТЕЦХ, Ортенберг, Немачка) при ексциленцији таласа од 495/586 нм; ови тестови су изведени у присуству 0,1 мМ ЕГТА и 2 мМ К, ХПОА. Митохондријално отицање је процењено спектрофотометријски на основу смањења привидне апсорбанције на 540 нм. За тестове, митохондрије су енергизиране са 5 мМ калијум сукцината (плус 2,5 уМ ротенона) у стандардном медијуму који се састоји од 125 мМ сахарозе, 65 мМ КЦ и 10 мМ ХЕПЕС-КОХ, пХ 7,4, на 30 степени.

4.13. Тестови пероксидације липида

Пероксидација липида је процењена из генерације малондиалдехида (МДА) [28,62]. Митохондрије (1 мг/мЛ) су биле изложене 4 мМ терц-бутилхидропероксида или 50 уМ Фе(ИИ) плус 1 мМ натријум цитрата на 37 степени Ц. Концентрација МДА је израчуната коришћењем његовог коефицијента екстинкције (ц =1). 56×105 М-1.цм-1).

4.14. Одређивање концентрације Фе(ИИ).

Концентрација Фе(ⅡИ) је одређена у 10 мМ фосфатном пуферу пХ 6,5 (2 мЛ) формирањем црвеног комплекса са 1,10-фенантролином (5 мМ), као што је претходно описано [24,28].

4.15. Мониторинг потрошње кисеоника

Потрошња О, везана за оксидацију Фе(ⅡИ) мерена је електродом типа Цларк (Хансатецх Инструментс, Пентнеи, Кинг'с Линн, УК) у стакленој комори од 13-мл опремљеној магнетном мешалицом, на 30 степени. Брзина потрошње кисеоника (РОЦ) је изражена као нмол О2/мЛ по минути.

4.16.2-Анализа оксидације деоксирибозе

Формирање хидроксил("ОХ) радикала је процењено праћењем 2-деградације деоксирибозе до МДА, која је израчуната из њеног коефицијента екстинкције (е=1.56×10 степени М-1· цм-) као што је раније објављено [26,27].

4.17. Детекција комплекса Гос-Фе(ИИ).

Фе (ⅡИ) (ФеЦл, 0.4-1.6 μМ) је додат у 2 мЛ (10 мМ) фосфатног пуфера (пХ 6,5) који садржи 2 мМ цитрата и 1,6 μМ Гос. Скенирање таласне дужине од 200-600 нм изведено је у Хитацхи 2001 спектрофотометру (Хитацхи, Токио), на 28 степени.

4.18. Статистичка анализа

Коришћен је ГрапхПад Присм 5.0(ГрапхПад Софтваре, Инц., Сан Дијего, Калифорнија, САД). Статистичка анализа је извршена коришћењем једносмерне АНОВА, праћене Студент-Невман-Кеулсовим постхоц тестом за поређење у паровима. Резултати са стр<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" half-effective="" or="" inhibitory="" concentrations="" were="" estimated="" following="" a="" non-linear="" regression="">

Додатни материјали: Следећи материјали су доступни на мрежи. Слика С1: 1Х-НМР (400 МХз) спектар госипитрина у ДМСО-до, Слика С2: 13Ц-НМР (101 МХз) спектар госипитрина у ДМСО-д, Слика С3: ХСКЦ спектар госипитрина у ДМСО-дг. Табела С1: Подаци о 'Х (400 МХз) и 13Ц (100 МХз) за госипитрин у односу на претходни извештај.

Доприноси аутора:Концептуализација, Г.ЛП.-А.; методологија, МАБ-В., РФД, ИМ-П.и ГЛП-А.; валидација, МАБ-В., ЈМ-П., ИМ-П и РФД; формална анализа, ИМ-П, ЈМ-П, РФ-А. и ГЛП-А.; истраживање, МАБ-В, АА-Л., ДА-А., ИМ-П., РФД и ГЛП-А.; Курирање података, МАБ-В.ИМ.-ПЈМ-П.и РФ-А.; писање—припрема оригиналног нацрта, МАБ-В.; писање—преглед и уређивање, ИМ.-П, РФ-А., ИМ-П и ГЛП-А.; визуелизација, ИМ-П. и ГЛП-А.; надзор, ГЛП-А.; аквизиција средстава, ГЛП-А. Сви аутори су прочитали и сложили се са објављеном верзијом рукописа.

Финансирање: Ово истраживање је финансирао ВЛИР (Белгија); број гранта ЦУ2018ТЕА457А103, а од стране Министерио де Циенциа Тецнологиа и Медио Амбиенте (Куба); број одобрења ПН223ЛХ010-035. АПЦ је финансирао ВЛИР (Белгија); број гранта ЦУ2018ТЕА457А103.

Изјава институционалног одбора за ревизију:Студија је спроведена у складу са смерницама Хелсиншке декларације, а одобрио ју је Комитет за институционалну етику Института за фармацеутске и прехрамбене науке Универзитета у Хавани, Куба (шифра протокола ИФАЛ-ЦЕИ 087-2019, октобар 2019.) .

Изјава о информисаној сагласности: Није применљиво. Изјава о доступности података: Није применљиво.

Признања:Овај рад је делимично подржао Влаамсе Интеруниверситаире Раад (ВЛИР)-Белгија/Министерио де Едуцацион Супериор (МЕС)-Куба пројекат ЦУ2018ТЕА457А103, који је такође покрио накнаде за обраду чланака, и пројекат ПН223ЛХ010-035 из Циенциа Тецнологиа и Медио Амбиенте (Куба), Програма де Циенциас Басицас и Натуралес“. Сукоб интереса: Аутори изјављују да нема сукоба интереса.

Доступност узорка: Узорци једињења доступни су од одговарајућег аутора.