Ево сажетије верзије наслова: Истовремено одређивање шест компоненти у Цистанцхе Тубулоса помоћу блиске инфрацрвене спектроскопије

1. Увод

Цистанцхе (Хоффмг. Ет Линк) је вишегодишњи фанерогамски род из породице биљака Оробанцхацеае. Већина врста које припадају роду Цистанцхе коришћене су као лековита биљка миленијумима у Кини; имају репутацију супериорног тоника; и познати су као "Гинсенг оф тхе Десертс". Цистанцхе тубулоса је обавезан паразит корена вишегодишње биљке Тамарик цхиненсис. Документовано је у кинеској фармакопеји као аутентични изворЦистанцхес Херба(кинеско име: Роуцонгронг) из издања из 2005. Савремена фармаколошка истраживања врсте Цистанцхе покренута су 1980-их. Фармаколошка истраживања су показала да екстракти биљке Цистанцхе поседују широк спектар деловања, као што су лечење недостатка бубрега и сенилне опстипације, унапређење способности учења и памћења, против Алцхајмерове болести, јачање имунитета, против старења, против умора итд. У последње три деценије, свеобухватне и систематске фармаколошке студије су комбиноване са фитокемијским истраживањима како би се осветлила материјална основа благотворног дејства корена биљака Цистанцхе. Ова истраживања показују да су фенилетаноидни гликозиди (ПхГ) биле главне ефикасне компоненте у биљкама Цистанцхеа које играју кључну улогу у лечењу недостатка бубрега, импотенције, против старења и Алцхајмерове болести. Садржај два ПхГ-а (ехинакозида и вербаскозида) је захтеван у кинеској фармакопеји. У међувремену, угљени хидрати као што су манитол, сахароза, глукоза и фруктоза у биљкама Цистанцхе поседују лаксативну функцију и кластере угљених хидратаЦистанцхе биљкекоришћени су за лечење опстипације.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОВЕЋАЊЕ ТЕСТОСТЕРОН ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Дивљи ресурси Ц. тубулоса су углавном распрострањени у области око пустиње Такламакан у јужном аутономном региону Синђанг у Кини. Слично многим другим врстама које се користе као традиционални кинески лекови (ТЦМ), Ц. тубулоса има велику економску вредност и скоро је изумрла у свом дивљем станишту због прекомерног сакупљања. Узгој Ц. тубулоса почео је 1990-их у Кини како би се обезбедило снабдевање сировинама за Цистанцхес Херба, као и заштитили ресурси дивљих биљака. Од 2017. године, скоро 13 хиљада ха култивисаних Ц. тубулоса постоји у префектури Хотан у Синђиангу. Напредак у технологији садње је потребан за проширење узгоја, као и за побољшање квалитета Ц. тубулоса.

Примарна сврха узгоја Ц. тубулоса је производња Цистанцхес Херба, која је богата тим ефикасним компонентама. Међутим, садржај ефективних компоненти уЦистанцхес Херба, као што су ПхГс и олигосахариди, могу бити значајно под утицајем многих фактора током производње. Требало би истражити систем за детекцију квалитета Ц. тубулоса у реалном времену. Због тога је неопходно развити метод високе пропусности да би се испунио захтев анализе великог броја узорака у кратком периоду. Традиционално, одређивање тих примарних ефикасних компоненти, као што су ПхГс и угљени хидрати, код Ц. тубулоса се обично постиже коришћењем течне хроматографије високих перформанси (ХПЛЦ). Иако је тачан и поуздан, дуготрајан је и напоран за прикупљање и обраду података. Поред тога, потребно је много времена и труда за припрему узорака која обично укључује уситњавање, екстракцију и филтрацију ХПЛЦ тестова. Стога су за добијање релативно велике количине података потребни јасан принцип и алатка која је лака за руковање. Срећом, блиска инфрацрвена спектроскопија (НИРС) се увелико користи за процену пољопривредних производа, хране, медицинских узорака и фармацеутских производа јер је брза и недеструктивна. Према томе, НИРС би могао тачно да одговара захтевима за ефикасна мерења ТЦМ-а, и, није изненађујуће, НИРС је примењен за квалитативну идентификацију и квантификацију једињења у ТЦМ.

У овој студији, садржај шест ефикасних компоненти, укључујућиехинакозид, вербаскозид, манитол, сахароза, глукоза и фруктозау 116 серија узорака Ц. тубулоса који су сакупљени из префектуре Хотан у Ксињиангу 2013–2015. прво су одређени ХПЛЦ. Након тога, калибрациони модели ових шест компоненти су успостављени методом делимичне регресије најмањих квадрата (ПЛСР). Ови модели су затим валидирани са коефицијентима корелације и грешкама предвиђања у калибрационим сетовима. Резултати су показали да се развијена метода може користити као поуздана метода за квантитативну анализу Ц. тубулоса.

2. Резултати

2.1. ХПЛЦ анализа

Садржај одехинакозид и вербаскозидсу одређени добро дефинисаном ХПЛЦ-УВ методом у литератури, а четири угљена хидрата (манитол, сахароза, глукоза и фруктоза) су одређена добро дефинисаном ХПЛЦ-ЕЛСД методом у литератури за свих 116 узорака. Припрема узорака и методе одређивања описане су у одељцима 3.1 и 3.3. Слика 1 приказује карактеристичне хроматограме мешаних стандарда. Може се видети да је свих шест ефективних компоненти било одвојено од основне линије и стога се могло квантификовати. ХПЛЦ метода је валидирана пре испитивања узорка. Главни резултати ХПЛЦ методе су наведени у табели 1. Повољан линеарни однос (р=0.9998) и опоравак (98,5%) методе одређивања ехинакозида су приказани у резултатима, исти резултат као и свих пет компоненте. Дакле, садржај шест ефективних компоненти може се тачно одредити. Сви утврђени опсези садржаја сумирани су у табели 1.

2.2. НИРС анализа

Слика 2 приказује НИР спектре (4000–10,000 цм−1) узорака Ц. тубулоса. Значајни апсорпциони пикови су се појавили од 4000 цм−1 до 7500 цм−1 у свим узорцима, док су се благе флуктуације појавиле од 7500 цм−1 до 10,000 цм−1. Померање основне линије НИР спектра се десило јер су на узорак лако утицали фактори као што су величина честица и боја (слика 2А). Математички предтретмани спектра су коришћени да би се у извесној мери смањио утицај непотребних информација. Математички предтретмани укључивали су прву деривацију (1. деривација), другу деривацију (2. деривацију), стандардну нормалну варијанту (СНВ) и мултипликативну корекцију расипања (МСЦ). Слика 2Б приказује 2. деривацију НИР спектра Ц. тубулоса и примећене су значајне варијације које су се јавиле из три региона, 4000–4500 цм−1, 5000–5500 цм−1 и 7000–7500 цм−1.

2.3. Успостављање квантитативних модела калибрације

Парцијална регресија најмањих квадрата (ПЛСР) је класична метода моделирања и широко се примењује у квантитативним моделима због високог квалитета резултата. Предности ПЛСР-а укључују његову добру способност предвиђања и релативну једноставност. ПЛСР се такође широко примењује у успостављању квантитативних калибрационих модела ТЦМ-а [25]. На основу претходно обрађених НИР спектра, модел квантитативне НИР анализе за шест ефективних компоненти у Ц. тубулоса је успостављен коришћењем ПЛСР методе са подацима ХПЛЦ анализе као правим вредностима. 116 узорака је насумично подељено у сетове за калибрацију и валидацију у односу 3:1. Најпогоднији услови за калибрацију изабрани су ниским РМСЕЦ и високим коефицијентом корелације.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ СЕКСУАЛНЕ ФУНКЦИЈЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

2.3.1. Избор таласног опсега за калибрационе моделе

Избор одговарајућег таласног опсега био је важан корак за изградњу калибрационог модела. У овој студији, упоређени су спектри НИР интервала од 4000–7500 цм−1 (препоручено од стране софтвера ТК аналист) и 4000–10,000 цм−1. Примећено је да овај опсег није погодан за калибрацију на интервалу између 4000 цм−1 и 7500 цм−1 из табеле 2. Стога, у тренутној студији, спектрални интервали за шест хемијских састојака су изабрани из интервала од 4000 до 10 000 цм−1 упоређивањем перформанси РМСЕЦ и коефицијента корелације.

2.3.2. Избор оптималног броја фактора за калибрационе моделе

ПЛСР објашњава максималну количину варијабилности у подацима смањењем димензионалности података спектра израчунавањем фактора. Проблем "недовољне опремљености" појавио се због недовољне информације која је резултат ограниченог броја фактора; међутим, избор фактора већих од оптималних вредности уведених у модел ће довести до проблема „преоптерећености“. Или „недовољна опремљеност” или „преоптерећеност” ће смањити предиктивну моћ успостављених модела [22]. Слика 3 приказује однос између РМСЕВ и фактора за свих шест једињења. Због тога смо одабрали оне факторе који одговарају најнижим вредностима РМСЦВ. Оптимални избор фактора за калибрационе моделе је наведен у табели 3.

2.3.3. Избор спектралног предтретмана за калибрационе моделе

Још један критичан утицајни фактор за калибрационе моделе је спектрална предтретман која има за циљ смањење утицаја расејања и померања основне линије, побољшање односа сигнал-шум и уклањање неправилних варијација. Да би се елиминисао утицај расипања зрачења, коришћене су методе мултипликативне корекције расејања (МСЦ) и стандардне нормалне варијације (СНВ). Да би се решили ефекти померања основне линије, упоређени су 1. и 2. спектри деривата и изабрана је 2. деривација. За жељени ефекат, изгладили смо спектре помоћу алгоритма филтера Савитзки-Голаи (СГ) пре деривације да бисмо спречили повећање шума. Табела 3 приказује информације о спектралном претходном третману и његове резултате за калибрационе моделе.

2.4. Евалуација успостављених модела

Добар НИРС калибрациони модел треба да има ниске вредности РМСЕЦ и РМСЕП, као и висок коефицијент корелације (р) и мале разлике између РМСЕЦ и РМСЕП. Калибрациони модели шест одабраних једињења су успостављени према горе поменутим процедурама (Табела 3). Вредности РМСЕЦ и р за калибрациони сет ехинакозида биле су 27,6 и 0.9808, респективно. Параметри перформанси других модела хемијских једињења наведени су у табели 3, из које можемо закључити да успостављени модели дају задовољавајуће резултате предвиђања и да се могу користити за брзу квантитативну анализу Ц. тубулоса. Графикони расејања шест хемијских једињења приказани су на слици 4 како би модели калибрације били описнији и визуелно посматрани. Као што је приказано на слици 4, дошло је до мањих разлика између предвиђених и измерених вредности, јер је већина тачака распоређена око регресивне криве са једначином као и=к. Стога су одличне предиктивне перформансе примећене на слици 4.

3. Материјали и методе

3.1. Припрема узорка

Сто шеснаест узорака Ц. тубулоса је прикупљено из префектуре Хотан у аутономном региону Синђијанг од 2013. до 2015. Сви узорци су култивисани, али су сакупљени у различитим фазама раста. Свежа тежина узорака се кретала од 20 г до 1000 г. Након сушења на сунцу, осушени узорци су уситњени и просејани кроз 60-мрежасто сито.

3.2. Прикупљање НИР спектроскопских података

НИР спектри узорака су прикупљени у интервалу од 8 цм−1 у спектралном подручју од 4000–10,000 цм−1 помоћу Антарис МКСФТ-НИР система (Тхермо Сциентифиц, Мадисон, ВИ, САД) опремљеног са ручни адаптер за рефлексију оптичких влакана. Сваки спектар је добијен усредњавањем 64 скенирања. Свим узорцима је остављено да се уравнотеже на собној температури (25 ◦Ц) пре скенирања НИР спектра како би се осигурало да су узорци анализирани на истој температури. Влажност у лабораторији је одржавана на амбијенталном нивоу.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ ФУНКЦИЈЕ БУБРЕГА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

3.3. ХПЛЦ прикупљање података

3.3.1. Припрема за екстракцију

Један грам праха Ц. тубулоса је екстрахован са 50 мЛ 50% метанола у конусној тиквици уз ултразвучну обраду (500 В, 40 КХз) током 30 мин. Екстракт је чуван на 4 ◦Ц. Супернатант екстракта је филтриран да би се добио узорак за ХПЛЦ анализу.

3.3.2. Истовремено одређивање ехинакозида и вербаскозида са ХПЛЦ-УВ

Течна хроматографска анализа је спроведена на Схимадзу УХПЛЦ систему (Схимадзу, Кјото, Јапан) који се састоји од две јединице за испоруку растварача ЛЦ-20АДКСР, ЛЦ-20АД пумпе, СИЛ-20АЦКСР ауто узоркивач, пећница ЦТО-20АЦ колона, СПД-М20А ДАД детектор, ДГУ-20А3Р дегазер и ЦБМ-20А контролер.

Граце Преваил Царбохидрате ЕС колона (150 × 2,1 мм, 2,7 мм) коришћена за хроматографско раздвајање одржавана је на 35 ◦Ц. Мобилна фаза се састојала од ацетонитрила (А) и 0.1% водене мравље киселине (Б) и испоручена је према програму градијента на следећи начин: 0–7 мин, линеарни градијент од 10–20% А; 7–15 мин, 20% А; и 15–20 мин, линеарни градијент од 20–10% А. Брзина протока мобилне фазе била је 0,4 мЛ/мин. УВ мониторинг је изведен на 330 нм.

3.3.3. Истовремено одређивање манитола, сахарозе, глукозе и фруктозе са ХПЛЦ-ЕЛСД

ХПЛЦ је изведен на Агилент ЛЦ систему 1100 серије (Пало Алто, Калифорнија, САД) који се састоји од Г1322А дегасера, Г1311А кватернарне пумпе, Г1311А аутосамплера, Г1316А регулатора температуре колоне и Г1315Б ДАД детектора.

Сигма Преваил Царбохидрате ЕС колона (4,6 × 250 мм, 5 µм) је коришћена за хроматографско раздвајање и одржавана на температури колоне од 25 ◦Ц. Мобилна фаза је била састављена од ацетонитрила и воде (77:23, в/в) и изократског савезника који су довођени при брзини протока од 0,7 мЛ/мин. Ефлуент је праћен коришћењем детектора евапоративног расејања светлости (ЕЛСД) са подразумеваним параметрима.

3.4. Обрада података

ТК Аналист (верзија 8.0, Тхермо Сциентифиц, Мадисон, ВИ, САД) је коришћен за поделу скупова за калибрацију и валидацију, математичку претходну обраду спектра, успостављање калибрационих модела и друга израчунавања . За израду фигура коришћено је порекло (верзија 9.1).

4. Закључци

У овој студији смо предложили брзу и недеструктивну методу за истовремену анализуехинакозид, вербаскозид, манитол, сахароза, глукоза и фруктозау Ц. тубулоса од НИРС. Анализе РМСЕЦ, коефицијента корелације, РМСЕП и Рп вредности су показале да се утврђени квантитативни НИР модели могу користити за прецизно предвиђање садржаја шест одабраних ефективних компоненти у Ц. тубулоса. У поређењу са ХПЛЦ, НИРС метода приказана у овој студији може значајно уштедети труд и време, уз одржавање задовољавајуће квантитативне анализе. Стога, метода која је овде наведена има потенцијал да се користи у контроли квалитета Ц. тубулоса и на тај начин да усмерава развој култивације и технологије процеса за Ц. тубулоса.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ СЕКСУАЛНЕ ФУНКЦИЈЕ ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%