материјали и методе

6. Тестови ћелијске апсорпције

Интернализација ЕВ у ћелије је праћена првим бојењем ЛЕВ-а и СЕВ-а липофилним ДиИ (МОП-Д -3911) (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, УСА). Након третирања ћелија обојеним ЕВ током 1, 3, 6, 12, 24 и 48 х, медијум за раст је уклоњен и ћелије су фиксиране са 4 процента параформалдехида (Вако, Јапан). Додан је Хоецхст 33342 (Инвитроген) и ћелије су инкубиране 15 минута на собној температури да би се језгра обојила (плаво). На крају, ћелије су испране ПБС-ом који садржи 1 проценат говеђег серумског албумина, а флуоресценција (црвена и плава) је примећена под флуоресцентним микроскопом (Леица Мицросистемс, Ветзлар, Немачка). Најмање три поља су одабрана и анализирана помоћу софтвера ИмагеЈ.

7. Мерење садржаја меланина

Да би се проценио садржај меланина, ћелије меланома Б16БЛ6 су прво инокулисане у 24- плоче са бунарима (5 × 104 ћелије/бунарићу) у запремини од 500 μЛ. После 24 х инкубације, ћелијесу третирани само са 100 нМ -МСХ (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО) или 50 μЛ ЛЕВс и СЕВс при 1, 5 и 10 µг/мЛ током 48 сати. После третмана, ћелије су испране са ПБС, а затим инкубиране са 2,5 процената трипсина (Гибцо, Тхермо Фисхер Сциентифиц) за изолацију. Ћелијске микросфере су растворене у 1н раствору натријум хидроксида (Сигма-Алдрицх) који садржи 1 проценат ДМСО (Сигма-Алдрицх) током 1 сата на 80 степени. Ћелијски лизати су пребачени у плочу са 96-бунарићем и садржај меланина је одређен мерењем апсорбанције на 405 нм коришћењем ензимског маркера (БиоТек). Садржај меланина је одређен коришћењем стандардне криве меланина конструисане од 0-100 µг/мЛ синтетичког раствора меланина (Сигма-Алдрицх) (екстрацелуларне везикуле Слика како следи). Садржај меланина је израчунат поређењем са контролама.

8. Тест активности тирозиназе

ТИР активност је мерена коришћењем активности Л-ДОПА оксидазе. Ћелије Б16БЛ6 су инокулисане у -МЕМ медијуму који садржи 100 нМ Сигма-Алдрицх -МСХ (500 μЛ) и култивисане при густини од 1 × 105 ћелија/бунарићу у 24-плочама за културу бунара. Након третмана ћелија са 50 μЛ ЛЕВ-а и СЕВ-а у концентрацијама од 10, 50 и 100 µг/мЛ током 24 х, ћелије су испране ПБС-ом и лизиране са 1 процентом Тритон Кс-100 (Сигма-Алдрицх). Лизиране ћелије су инкубиране на - 80 степену 30 мин, а затим лиофилизоване и чуване на собној температури 10 мин. Добијени узорци су избистрени центрифугирањем на 12,000 × г током 15 минута, након чега је додато 2 мг/мЛ Л-ДОПА (Сигма-Алдрицх) и инкубирано на 37 степени 1 х. Апсорпција је затим мерена на 490 нм коришћењем ензимског маркера (БиоТек). Апсорбанца је затим измерена на 490 нм коришћењем БиоТек-а.

Кликните овде да бисте добилиЦистанцхе користи од избељивања кожеикакви су ефекти Цистанцхе тубулоса

9. Вестерн блот анализа

Нивои протеина повезани са антимеланогеним путем су одређени интрацелуларно Вестерн блот анализом екстракта целих ћелија. Запремина од 500 μЛ Б16БЛ6 ћелија мишјег меланома је инокулисана у 24- плоче са бунарима (1 × 105 ћелија/бунарићу). Ћелије су лизиране инкубацијом у РИПА пуферу (Тхермо Фисхер Сциентифиц) током 20 минута у присуству мешавине инхибитора протеазе (Роцхе, Немачка) и третиране са 50 μЛ 10, 50 и 100 μг/мЛ ЕВ током 24 х. Ћелијски лизати су центрифугирани на 17 709 г током 15 минута и концентрација протеина у резултујућим лизатима је одређена коришћењем комплета за анализу БЦА (Тхермо Фисхер Сциентифиц). Једнаке количине протеина (10-20 уг/узорак) су стављене у бунарчиће Болт 4-12 процената Бис-Трис Плус гела (Инвитроген) и електротрансфериране на ПВДФ (поливинилиден флуорид) мембране (ГЕ Хеалтхцаре, Цхицаго, ИЛ, САД). Мембране су испране са Трис пуферованим сланим раствором који садржи 0,2 процента (в/в) тен -20 (ТБСТ), затворене са ТБСТ који садржи 5 процената (в/в) обраног млека (Гибцо, Тхермо Фисхер Сциентифиц) током 1 сата. на собној температури, а затим инкубиран на 4 степена у раствору примарног антитела разблаженом са 1 процентом (в/в) обраним млеком. Инкубација је обављена преко ноћи. Примарна коришћена антитела укључују анти-ТРП-1 (1:1000), анти-ТРП-2 (1:1000) и анти-МИТФ(1:1000) антитела из Абцам, Цамбридге, УК; анти-ТИР (1:500) антитела из Санта Цруз Биотецхнологи (Санта Круз, Калифорнија, САД). Анти- -антитело на актин (1:500; Санта Цруз) је коришћено за стандардизацију на нивоу протеина. Примарна антитела су откривена секундарним антителом обележеним пероксидазом рена (ХРП) компаније Генетек (Ирвине, Калифорнија, САД). Мембране су испране са ТБСТ и инкубиране 1 х на собној температури са 1:2000 разблажењем секундарног антитела у ТБСТ. Сигнал генерисан након прања мембране са ТБСТ и инкубације са реагенсом побољшане хемилуминисценције (ЕЦЛ) (ГЕ Хеалтхцаре) детектован је коришћењем ИмагеКуант 350 система за снимање гела (ГЕ Хеалтхцаре).

10. Електронска микроскопска детекција интрацелуларне производње меланина

Ћелије су обрађене са ЛЕВ или СЕВ и инкубиране 48 х. После третмана, ћелије су фиксиране инкубацијом са 200 мМ какодилатног пуфера који садржи 8 процената глутаралдехида и 20 процената параформалдехида (Вако). Када су дехидрирани етанолом, ултра-танки пресеци су припремљени коришћењем Леица ЕМ УЦ7 микротома (Леица) и сакупљени на 200-мрежастој бакарној мрежи. Секције су обојене са 1 процентом уранил ацетата и оловног цитрата, а слике су добијене трансмисионим електронским микроскопом ЈЕОЛ ЈЕМ 1010 (ЈЕОЛ) на 80 кВ.

Екстракт Цистанцхе

11. Мерење ефекта бељења помоћу модела људске коже

Модел људске коже дерм-ме (Тего Сциенце, Сеул, Кореја) је коришћен за тестирање ефекта избељивања ЛЕВ-а. Људско кожно ткиво је третирано са 10 μг/мЛ лева током 7 дана као негативна контрола. Концентрација арбутина била је 70 µг/мЛ. Људско кожно ткиво је растворено у 1 Н НаОХ и мерена је апсорпција на 405 нм коришћењем ензимског маркера (БиоТек) да би се одредио садржај меланина. Седмог дана, пигментација коже је упоређена микроскопском анализом узорака обојених Фонтаном - масоном. За бојење по Фонтана-Массону, узорци коже су фиксирани преко ноћи на собној температури у 4 процента параформалдехида (Вацо), исечени и уграђени у парафински восак. Секције уграђене у парафин су затим загрејане у пећници на 60 степени током 1 х да се осуше. Секције су затим натопљене три пута у ксилену, два пута у 95 одсто етанолу и два пута у 100 одсто етанолу, а затим испране дестилованом водом. Бојење по Фонтана-Массону је извршено коришћењем амонијачног раствора сребра на 56 степени и испрано дестилованом водом. Стакалца су затим фиксирана у 0,2 процентном раствору златног хлорида и потопљена у 5 процената раствора натријум тиосулфата на собној температури. Коначно, слајдови су дехидрирани у свежем алкохолу.

12. Статистичка анализа

Подаци добијени из експеримената су изражени као средња вредност ± СЕМ. Извели смо експерименте са четири серије активности, садржајем меланина и ТИР активношћу (додатна слика С3). Једносмерна анализа варијансе (АНОВА) и Дуннеттов тест су обављени коришћењем ГрапхПад Присм (ГрапхПад Присм Софтваре Инц., Сан Диего, ЦА, УСА). п < разлике; 0.05, п < 0.01, п < 0,001 сматрани су статистички значајним.

Екстракт Цистанцхе тубулоса

Дискусија

За разлику од већине еукариотских ћелија, биљке имају сложен ћелијски зид, који представља важну баријеру за кретање егзосома. Као резултат, биљне ћелије ослобађају егзозоме кроз низ мултивезикуларних тела спојених са плазма мембраном. Секреторни производи ослобођени биљним излучевинама депонују се унутар периплазматског јаза поред плазма мембране; док се акумулирају, стварају притисак који омогућава секрету да пређе баријеру ћелијског зида. Као резултат тога, излучени материјал, укључујући егзозоме, може се ослободити без потребе за енергијом. ЕВ биљног порекла су сличне величине или веће од егзозома животињских ћелија које се јављају у природи и слични су онима уоченим у егзосомалној течности сунцокрета (50-200 нм) и Арабидопсис ЕВ (50-300 нм). Ефикасност ћелијске апсорпције се сматра кључном детерминантом ефикасности, пошто се мете многих терапеутских агенаса налазе интрацелуларно. Стога смо одредили оптимално време и концентрацију узимања ћелија меланома и приметили брзи пренос ЛЕВ-а и СЕВ-а у ћелије меланома у року од 12 сати.

ТИР је гликопротеин који катализује конверзију л-тирозиназе у Л-ДОПА, корак који ограничава брзину у синтези меланина. Оба ЕВ показују антимеланогени ефекат, али је антимеланогени ефекат ЛЕВ-а значајно већи од ефекта СЕВ-а.

Производња меланина је регулисана -МСХ-МЦ1Р, а познато је да инхибиција ПКЦ смањује пигментацију коже и косе. Међутим, многе генетске, биохемијске и фармаколошке студије сугеришу да је сигнални пут -МСХ-МЦ1Р главни покретач меланогенезе. Иако наши експерименти нису показали директну интеракцију између МИТФ и ТИР, показано је да ЛЕВ инхибирају меланогенезу смањујући експресију МИТФ кроз УВ-зависни пут -МСХМЦ1Р, што заузврат смањује експресију ТИР, ТРП-1, и ТРП-2. Претпостављамо да су протеини породице ТРП индиректно повезани једни са другима, али ће можда бити потребни даљи експерименти да се покаже директна интеракција између њих. Штавише, реконструисани модели људске коже показују да ЛЕВ-ови ефикасно инхибирају синтезу меланина изазвану УВ зрачењем и садржај меланина.

Цистанцхе дулцис

Закључак

Наши налази сугеришу да су ЛЕВ кандидати за нове антимеланогене лекове који смањују меланогенезу инхибирањем експресије протеина повезаних са меланином. Резултати су потврдили да су ЛЕВ смањили МИТФ и тиме смањили ТРП у ћелијама меланома Б16БЛ6. лева и арбутин инхибирали су ТРИ за 66 процената и 67 процената, респективно. Садржај меланина у реконструисаној кожи третираној ЛЕВ је смањен за 43 и 28 процената у поређењу са нетретираном негативном контролом и арбутином као позитивном контролом, респективно.

На основу раних налаза, верујемо да би електрични мотори биљног порекла могли бити корисни као антимеланогени агенс за развој природне козметике. У будућности су потребна даља истраживања како би се развила ЕВ-а биљног порекла као ефикасног састојка за побољшање коже и неопходно је демонстрирати безбедност ЕВ-а биљног порекла на моделима људске коже. Наши резултати сугеришу да се ЕВ може користити за смањење меланина и на тај начин посветлити кожу. Међутим, ЕВ може имати токсичне ефекте на кожу, па треба извршити друге експерименте као што су алергијски тестови или Амес тестови.

РЕФЕРЕНЦЕ

[1] Носанцхук ЈД, Нимрицхтер Л, Цасадевалл А, ет ал. Улога везикуларног транспорта макромолекула кроз ћелијске зидове у патогенези гљивица. Цоммун Интегр Биол. 2008;1(1):37–39.

[2] Робинсон ДГ, Динг И, Јианг Л. Неконвенционално лучење протеина у биљкама: критичка процена. Протопласма. 2016;253(1):31–43.

[3] Паива ЕА. Како секреторни производи пролазе кроз ћелијски зид биљке да би се ослободили? Нова хипотеза која укључује циклична механичка дејства протопласта. Анн Бот. 2016;117(4):533–540.

[4] Хоод ЈЛ, Сцотт МЈ, Вицклине СА. Максимизирање колоидне стабилности егзосома након електропорације. Анал Биоцхем. 2014;448(1):41–49.

[5] Руттер БД, Иннес РВ. Екстрацелуларни везикули изоловани из апопласта листа носе протеине одговора на стрес. Плант Пхисиол. 2017;173(1):728–741.

[6] Луан Кс, Сансанапхонгприцха К, Миерс И, ет ал. Инжењеринг егзосома као префињене биолошке наноплатформе за испоруку лекова. Ацта Пхармацол Син. 2017;38(6):754–763.

[7] Видеира ИФ, Моура ДФ, Магина С. Механизми који регулишу меланогенезу. Ан Брас Дерматол. 2013;88(1):76–83.

[8] Парк ХИ, Лее Ј, Капаси С, ет ал. Локална примена инхибитора протеин киназе Ц смањује пигментацију коже и косе. Ј Инвест Дерматол. 2004;122(1):159–166.

[9] Иаманисхи ДТ, Грахам М, Буцкмеиер ЈА, ет ал. Диференцијална експресија гена протеин киназе Ц у нормалним људским неонаталним меланоцитима и метастатским меланомима. Карциногенеза. 1991;12(1):105–109.

[10] Боровански Ј, Рилеи ПА. Меланини и меланозоми: биосинтеза, биогенеза, физиолошке и патолошке функције. Хобокен, Њ: Вилеи-Блацквелл; 2011

[11] Д'Мелло С, Финлаи Г, Багулеи Б, ет ал. Сигнални путеви у меланогенези. Инт Ј Мол Сци. 2016;17(7):1–18.