Како се ефикасно борити против рака јетре? Цистанцхе Десертицола активни састојак фенилетаноидни гликозиди који помажу у решавању проблема

Апстрактан

Позадина:Цистанцхе тубулоса(Сцхенк) Р. Вигхт је традиционални кинески лек који паразитира на корену биљке Тамарик и користи се за лечење мушке импотенције, стерилитета, слабости тела и као тоник. Међутим, његов антитуморски ефекат на хепатоцелуларни карцином је још увек неухватљив. Овде смо истражили антитуморски ефекат Ц.тубулосафенилетаноидгликозиди(ЦТПГ) на Х22 ћелијама хепатоцелуларног карцинома и ин витро и ин виво и његовим механизмима.

Методе: Морфологија, виталност, апоптоза, ћелијски циклус и потенцијал митохондријалне мембране (Δψм) Х22 ћелија су анализирани инвертираном микроскопијом, МТТ тестом и проточном цитометријом, респективно. Експресија и активација протеина у путу апоптозе детектовани су Вестерн блот-ом. Антитуморски ефекат ин виво је процењен на моделу туморског миша који је успостављен коришћењем мужјака Кунминг мишева.

Резултати: ЦТПГ третман је значајно потиснуо раст Х22 ћелија на начин који зависи од дозе и времена, што је било у корелацији са повећаном апоптозом и заустављањем ћелијског циклуса у Г0/Г1 и Г2/М фазама. Штавише, у Х22 ћелијама третираним ЦТПГ примећена је хромозомска кондензација. Третман ЦТПГ-ом је значајно повећао однос Бак/Бцл-2, смањио Δψм и побољшао ослобађање цитокрома ц. Нивои цепане каспазе-8 и каспазе-9 у спољашњим и унутрашњим сигналним путевима су значајно повећани да би се секвенцијално активирала каспаза-7 и -3 да цепа ПАРП. Коначно, ЦТПГ је инхибирао раст Х22 ћелија код мишева и побољшао стопу преживљавања туморских мишева.

Закључци: Ови резултати сугеришу да ЦТПГ потискује раст ћелија Х22 кроз екстринзичне и интринзичне путеве апоптозе.

Кључне речи:Цистанцхетубулоса, фенилетаноидгликозиди, апоптоза, сигнални пут, модел тумора миша

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Цистанцхе десертицола има много ефеката, кликните овде да бисте сазнали више

Позадина

Рак јетре рангиран је на шестом месту по учесталости рака и на четвртом по броју умрлих од рака широм света. Штавише, заузео је четврто место по учесталости рака и прво по морталитету од рака у земљама са ниским социодемографским индексом [1]. У Кини, рак јетре је трећи водећи узрок смрти од рака у 2015. [2]. Више од 90 процената примарних карцинома јетре је хепатоцелуларни карцином (ХЦЦ) у свету [3]. Тренутно је ресекција јетре главна опција за терапију ХЦЦ. Међутим, мање од 30 процената пацијената са ХЦЦ је испунило критеријуме куративне ресекције јетре, а укупна 5-годишња стопа преживљавања је и даље ниска чак 35-50 процената због високе стопе рецидива [4, 5 ]. Доступност опција лечења за пацијенте са средњим до узнапредовалим ХЦЦ је веома ограничена. Сорафениб, молекуларно циљани лек, одобрен је од стране ФДА као третман прве линије за узнапредовали ХЦЦ. Међутим, сорафениб продужава само око 3 месеца преживљавања, а стопа одговора је мања од 4 процента [6, 7]. Хитно је развити нове лекове или стратегије против ХЦЦ. Традиционална кинеска медицина (ТЦМ) сама или у комбинацији са другим стратегијама коришћена је за лечење ХЦЦ и показала је клиничке предности укључујући продужено време преживљавања, побољшан квалитет живота, смањене нежељене реакције и тако даље [8, 9].Цистанцхе, врста ТЦМ, има различите биолошке функције, као што су антиоксидација, анти-инфламација, анти-агинг и неуропротекција [10, 11].фенилетаноидгликозидисе сматрају главним активним компонентамаЦистанцхе, који имају различите активности укључујући антиоксидацију, антиинфламацију, хепатопротекцију и неуропротекцију [12–15]. Наша група је пријавила да је Цистанцхе тубулосафенилетаноидгликозиди(ЦТПГ) би могао да изазове апоптозу у ћелијама меланома Б16-Ф10 и инхибира раст тумора код мишева [16]. У овој студији, измерили смо антитуморски ефекат ЦТПГ-а на ХЦЦ Х22 ћелије и ин витро и ин виво и истражили његове механизме. Открили смо да је ЦТПГ индуковао апоптозу у ћелијама Х22 преко спољашњих и интринзичних сигналних путева и потиснуо раст Х22 тумора код мишева.

Методе

Ћелијска линија

Ћелије хепатоцелуларног карцинома миша Х22 су добијене из Кључне лабораторије за биолошке ресурсе и генетски инжењеринг у Синђијангу, Универзитета Синђијанг (Урумћи, Синђанг, Кина) и култивисане у медијуму РПМИ 1640 (Гибцо) са додатком 100 У/мл пеницилина и 100 уг/мл стрептомицин и 10 процената топлотно инактивираног феталног говеђег серума (Гибцо) на 37 степени у влажној атмосфери од 5 процената ЦО2.

МТТ тест

ЦТПГ је купљен од Хетиан Дицхен Биотецх Цо., Лтд. (Хетиан, Ксињианг, Кина) и главна једињења ЦТПГ-а су квалификована и квантификована течном хроматографијом високих перформанси [16]. Вијабилност ћелије је процењена помоћу 3- (4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2, 5-дифенилтетразолијум бромида (МТТ) (Сигма, Ст. Лоуис, МО , САД) тест. Х22 ћелије су инокулисане у 96-плоче са густином од 2 × 104 ћелије у 100 ул медијума по бунарчићу и култивисане на 37 степени. После 24 х, ћелије су третиране различитим концентрацијама ЦТПГ (0, 100, 200, 300 и 400 уг/мл) или 0,3 процента ДМСО (једнако оним у 400 уг/мл ЦТПГ) током 24, 48 и 72 сата, респективно. . После центрифугирања на 1000 рпм током 7 минута, супернатант је одбачен и у сваки бунар је додато 100 ул раствора МТТ (5 мг/мл у ПБС). Плоче су инкубиране на 37 степени током 4 х и додато је 100 ул ДМСО да би се растворили формирани кристали формазана. Вредности ОД490 детектоване су читачем микроплочица 96- (Био-Рад Лабораториес, Калифорнија, САД). Вијабилност ћелије је израчуната према формули: Вијабилност ћелије ( проценат )=(ОД-третирано/ОД-нетретирано) × 100 процената.

Детекција апоптозе

Х22 ћелије су третиране различитим концентрацијама ЦТПГ (0, 100, 200, 300 и 400 уг/мл) или 0,3 процента ДМСО током 24 сата, а затим обојене Анексином В ФИТЦ/ Комплет за откривање апоптозе пропидијум јодида (ПИ) (ИЕАСЕН, Кина) према упутствима произвођача. Узорци су анализирани проточном цитометријом (БД ФАЦСЦалибур, САД).

Детекција потенцијала митохондријалне мембране

Х22 ћелије су третиране различитим концентрацијама ЦТПГ (0, 200 и 400 уг/мл) током 24 х, а затим обојене мембрански пропустљивом ЈЦ-1 бојом (Беиотиме, Кина) током 20 мин на 37 степени. Након два пута испирања са ЈЦ-1 пуфером, узорци су ресуспендовани са 300 ул ЈЦ-1 пуфера и анализирани проточном цитометријом (БД ФАЦСЦалибур, САД).

Анализа ћелијског циклуса

Х22 ћелије су инокулисане у посуде за културу од 60 мм и третиране различитим концентрацијама ЦТПГ (0, 100, 200, 300 и 400 уг/мл) или 0,3 процента ДМСО за 24 ч. Све ћелије су сакупљене и испране два пута са ПБС. Ћелије су фиксиране у 70% ледено хладном етанолу на -20 степени током 2 х и испране два пута са ПБС, а затим поново суспендоване у 300 ул пропидијум јодид/РНасе пуфера за бојење (БД Биосциенцес). После 10 минута на собној температури, узорци су сакупљени проточном цитометријом (БД ФАЦСЦалибур, САД) и дистрибуција ћелијског циклуса је анализирана помоћу софтвера МодФит ЛТ 3.0.

Хоецхст 33,258 бојење

Морфолошке промене ћелијских језгара Х22 анализиране су бојењем Хоецхст 33,258 бојом која се везује за мембрану пропусну за ДНК. Х22 ћелије су засејане у 6-плочу са бунарима у концентрацији од 1 × 105 ћелија/бунарићу у медијуму од 2 мл. После 60% ~ 70% конфлуенције, ћелије су третиране са ЦТПГ (0, 100, 200, 300 и 400 уг/мл) током 24 х. Ћелије су сакупљене и фиксиране са 4 процента ледено хладног параформалдехида на 4 степена током 10 минута. После испирања са ПБС, ћелије су обојене са Хоецхст 33,258 (Беиотиме, Кина) на 4 степена током 10 минута. Узорци су посматрани инвертованим флуоресцентним микроскопом (Никон Ецлипсе Ти-Е, Јапан).

Вестерн блот

Анти-цаспасе-3, анти-цеавед цаспасе-3, Анти-Бцл-2 и анти-Бак су купљени од Беиотиме Биотецх Цо., Лтд. (Шангај, Кина). Анти-каспаза-7, анти-каспаза-7, анти-каспаза-8, анти-каспаза-8, анти-каспаза-9, анти -цепана каспаза-9, анти-ПАРП, анти-цепани ПАРП, анти-мишји ИгГ-ХРП и анти-зечји ИгГ-ХРП су купљени од Целл Сигналинг Тецхнологи. Анти- -актин је купљен од Беијинг ЦомВин Биотецх Цо., Лтд. (Пекинг, Кина).

Х22 ћелије су третиране различитим концентрацијама ЦТПГ (0, 100, 200, 300 и 400 уг/мл) или 0,3 процента ДМСО током 24 сата. Ћелије су сакупљене и лизиране раствором за лизу ћелија РИПА (Беијинг ЦомВин Биотецх Цо., Лтд) током 30 минута на леду. Узорци су центрифугирани (12,000 г током 15 минута на 4 степена) да би се сакупили супернатанти, а концентрације протеина су мерене помоћу БЦА комплета (Тхермо Фисхер Сциентифиц, САД). Једнака количина протеина у сваком узорку је изолована помоћу 12 процената СДС-ПАГЕ и пренета на ПВДФ мембране (Биосхарп, Кина). Након блокирања са ТБСТ пуфером који је садржао 5 процената немасног млека, мембране су инкубиране са одговарајућим примарним антителима и секундарним антителима коњугованим са пероксидазом рена (ХРП), респективно. Након испирања са ТБСТ, циљни протеини су детектовани ЕЦЛ тест китом (Беиотиме, Кина).

Животиње и етичка изјава

Мужјаци Кунминг мишева стари 6-8 недеља купљени су од Лабораторијског центра за животиње, Медицинског универзитета Синђианг (Урумчи, Синђијанг, Кина). Мишеви су држани у стандардном објекту за животиње са контролисаном температуром на Универзитету Ксињианг. Све студије на животињама су спроведене у складу са смерницама Комитета за негу и употребу животиња Универзитета Синђианг. Протокол је одобрио Комитет за етику експеримената на животињама Кључне лабораторије за биолошке ресурсе и генетичко инжењерство у Синђангу (БРГЕ-АЕ001), Универзитета Синђанг.

Студија тумора на мишевима

За индукцију модела туморског миша, мужјацима Кунминг мишева је субкутано убризгано 1 × 106 Х22 ћелија у 100 ул ПБС-а у десни бок. После 3 дана, мишеви су насумично подељени у 3 групе (7 мишева/група). Контролној групи је убризгано 0,1 мл ДМСО субкутано око тумора. ЦТПГ-200 и ЦТПГ- 400 групама су субкутано убризгане 200 или 400 мг/кг ЦТПГ у 0,1 мл ДМСО око тумора. Мишеви су третирани свака 2 дана до 21 дан. Величине тумора су мерене помоћу калибара до 25 дана и запремина тумора је израчуната према формули: запремина тумора (мм3)=(дужина×ширина2)/2. После 25 дана, преживљавање туморских мишева је праћено сваког дана до краја ове студије.

Статистичка анализа

Статистичка значајност је израчуната једносмерном анализом варијансе између третиране и контролне групе. Сви подаци су изражени као средња вредност ± стандардна девијација (СД). п < 0.05="" се="" сматрало="" статистички="">

Резултати

ЦТПГ је смањио виталност ћелија Х22 ин витро

Да би се истражио антитуморски ефекат ЦТПГ-а на ХЦЦ, Х22 ћелије су третиране различитим концентрацијама ЦТПГ-а (0, 100, 200, 300 и 400 уг/мл) ин витро. После 24 х, морфологија Х22 ћелија је примећена помоћу инвертованог микроскопа. Открили смо да је морфологија Х22 ћелија драматично промењена ЦТПГ третманом. Са повећањем концентрације ЦТПГ, ћелије су постале мале и округле, а број ћелија је такође значајно смањен (слика 1а). МТТ тест је коришћен за анализу одрживости ћелија Х22 након третмана ЦТПГ-ом током 24, 48 и 72 сата, респективно. ЦТПГ је значајно смањио виталност Х22 ћелија на начин који зависи од дозе и времена (слика 1б). ЦТПГ од 300 уг/мл је постигао најбољу инхибиторну стопу (слика 1ц). Вредности ИЦ50 ЦТПГ за ћелије Х22 су 236 уг/мл за 24 сата и 169,8 уг/мл за 48 сати.

ЦТПГ је изазвао апоптозу у ћелијама Х22

Да би се истражило да ли је смањена виталност Х22 ћелија посредована индукцијом апоптозе, Х22 ћелије су третиране различитим концентрацијама ЦТПГ (0, 100, 200, 300 и 400 уг/мл) током 24 сата и обојене са ПИ и Анексином В. Резултати проточне цитометрије су показали да ЦТПГ значајно индукује апоптозу Х22 ћелија (укључујући рану и касну апоптозу) на начин који зависи од дозе (слика 2а). Иако је висока доза ЦТПГ такође значајно повећала некрозу Х22 ћелија, некроза игра мању улогу у инхибицији раста Х22 ћелија због нижег удела (8,3 процента) у поређењу са апоптозом (52,6 процената). Даље, укупни протеини Х22 ћелија су изоловани након ЦТПГ третмана и експресије анти-апоптотичног Б ћелијског лимфома 2 (Бцл-2) и про-апоптотичног БЦЛ-2-повезаног Кс протеина (Бак) су откривене од стране Вестерн блот. Подаци скенирања у сивим тоновима су показали да су нивои експресије Бак и Бцл-2 повећани, односно смањени. Однос Бак/Бцл-2 је значајно повећан (слика 2б). Ови резултати сугеришу да ЦТПГ индукује апоптозу у Х22 ћелијама.

ЦТПГ индукује хромозомску кондензацију и заустављање ћелијског циклуса у Х22 ћелијама

Пријављено је да оштећење ДНК и заустављање ћелијског циклуса изазвано лековима могу инхибирати раст туморских ћелија и изазвати апоптозу у туморским ћелијама [17, 18]. Да би се открила морфологија језгара у Х22 ћелијама након ЦТПГ третмана током 24 сата, Х22 ћелије су обојене помоћу Хоецхста 33,342 и посматране коришћењем инвертне флуоресцентне микроскопије. Ћелије третиране ЦТПГ-ом показале су дозно-зависно повећање јарко кондензованог хроматина језгара, док су нетретиране ћелије показале хомогено обојена језгра (слика 3а). Дистрибуција ћелијског циклуса у Х22 ћелијама је даље анализирана ПИ бојењем након ЦТПГ третмана током 24 х. Као што је приказано на слици 3б, ЦТПГ третман је значајно повећао удео ћелија Г0/Г1- и Г2/М фазе и значајно смањио удео ћелија С фазе, што сугерише да ЦТПГ индукује Г 0/Г1 и Г2/М заустављање фазе у ћелијама Х22. Висока доза ЦТПГ-а је такође значајно повећала удео суб Г1 ћелија.

ЦТПГ је смањио потенцијал митохондријалне мембране и повећао ослобађање цитокрома ц

митохондријски зависни пут игра важну улогу у индукцији апоптозе [19, 20]. Промене потенцијала митохондријалне мембране (Δψм) могу се пратити ЈЦ-1 бојењем због ЈЦ-1 агрегата (црвена флуоресценција) може да се распадне у мономер (зелена флуоресценција) уз смањење Δψм [21]. После ЦТПГ третмана током 24 х, Х22 ћелије су обојене ЈЦ- 1 бојом. Подаци проточне цитометрије су показали да су црвена флуоресценција у каналу ФЛ-2 и зелена флуоресценција у ФЛ-1 каналу значајно смањене и повећане након третмана ЦТПГ. Удео ПЕ-ФИТЦ плус ћелија је значајно повећан (слика 4а), што сугерише да је ЦТПГ смањио Δψм у Х22 ћелијама. Ово је у складу са повећаним односом Бак/Бцл-2. Сходно томе, приметили смо да је ослобађање цитокрома ц значајно повећано након третмана ЦТПГ (слика 4б). Ови резултати су показали да ЦТПГ може делимично индуковати апоптозу у Х22 ћелијама преко митохондријалног (интринзичног) пута.

ЦТПГ је активирао пут каспазе и спречио поправку ДНК

Затим је анализирана активација каспазе изазвана ЦТПГ преко спољашњих и интринзичних сигналних путева. Након ЦТПГ третмана током 24 х, укупни протеини су изоловани из Х22 ћелија и нивои про- и цепаних каспаза су детектовани Вестерн блот-ом. У поређењу са нетретираном или ДМСО контролом, ЦТПГ третман је значајно повећао не само ниво расцепљене каспазе-8 (спољни пут) већ и ниво цепане каспазе-9 (унутрашњи пут) (Сл. 5). Узастопно, активирана каспаза-8 и -9 цепају низводну про-капазу-3 и -7 које су примећене на слици 5. Активирана каспаза-3 цепа ДНК ензим за поправку поли (АДП-рибоза) полимеразе (ПАРП) да спречи поправку ДНК и акумулира оштећење ДНК као што је примећено на слици 3а.

Ови резултати су показали да је ЦТПГ индуковао апоптозу у ћелијама Х22 преко спољашњих и интринзичних сигналних путева.

ЦТПГ потискује раст Х22 ХЦЦ ин виво и побољшава стопу преживљавања туморских мишева

Коначно, антитуморски ефекат ЦТПГ-а на ХЦЦ је процењен на моделу туморског миша, који је установљен субкутаном ињекцијом Х22 ћелија. После 3 дана ињекције ћелија Х22, мишеви тумора су третирани ЦТПГ 8 пута. Телесна тежина мишева и величине тумора су праћене у назначеним временским тачкама. Као што је приказано на слици 6а, телесна тежина мишева у свакој групи нема значајну разлику, што сугерише да одабране дозе ЦТПГ-а немају очигледне нежељене ефекте. Занимљиво је да је раст тумора код мишева третираних са 200 мг/кг и 400 мг/кг ЦТПГ-а био значајно инхибиран (слика 6б). Штавише, две дозе ЦТПГ третмана су значајно побољшале преживљавање туморских мишева (3/7, 3/7) у поређењу са контролном групом (0/7) на крају експеримента (слика 6б). Такође смо открили да ЦТПГ значајно појачава пролиферацију спленоцита изолованих од мужјака Кунминг мишева на начин зависан од дозе (слика 6ц), што сугерише да ЦТПГ има имуностимулативни ефекат.

Дискусија

ТЦМ се дуго користи за лечење различитих болести укључујући рак. Пријављено је да ТЦМ може да индукује апоптозу у различитим типовима туморских ћелија и преко екстринзичних (посредованих од рецептора смрти) и интринзичних (зависних од митохондрија) сигналних путева да би испољио антитуморске ефекте [22–25]. Ова два пута могу да активирају каспазу-8 и -9, респективно [24, 26]. Овде смо открили да ЦТПГ значајно потискује раст Х22 ћелија кроз индукцију апоптозе и заустављање ћелијског циклуса. Нивои цепане каспазе-8 и -9 су значајно повећани ЦТПГ третманом, што сугерише да су и спољашњи и унутрашњи сигнални путеви укључени у индукцију апоптозе. Наша претходна студија је показала да је ЦТПГ индуковао апоптозу у ћелијама меланома Б16-Ф10 путем пута који зависи од митохондрија који је повећао ниво цепане каспазе-9 али не и каспазе-8 [16]. ЦТПГ може активирати различите сигналне путеве у различитим типовима туморских ћелија.

Интегритет митохондријалне мембране је строго регулисан члановима породице протеина БЦЛ-2 укључујући Бак и Бцл-2 [27, 28]. Однос Бак према Бцл-2 игра кључну улогу у путу апоптозе зависне од митохондрија [29]. У ћелијама Х22 третираним ЦТПГ-ом, однос Бак/Бцл-2 је био значајно повећан, што би могло изазвати смањење Δψм и ослобађање цитокрома ц уочено у овој студији. Сходно томе, про-каспаза-9 је цепљена и активирана. Коначно, иницијатори активне каспазе-8 и -9 активирали су џелата каспазе-3 да цепа ПАРП како би спречили поправку ДНК. Узети заједно, ови резултати сугеришу да је ЦТПГ индуковао апоптозу у Х22 ћелијама путем екстринзичних и интринзичних сигналних путева.

У моделу туморског миша, ЦТПГ је значајно потиснуо раст Х22 ХЦЦ и значајно побољшао преживљавање туморских мишева. Занимљиво је да је ЦТПГ дозно-зависно промовисао пролиферацију спленоцита код Кунминг мишева, што је у складу са нашом претходном студијом [16].

Ови резултати сугеришу да ЦТПГ може потиснути раст Х22 ХЦЦ код мишева путем директног антитуморског ефекта и индиректног побољшања имунитета.

Закључци

ЦТПГ је потиснуо раст ћелија Х22 и ин витро и ин виво и индуковао апоптозу у Х22 ћелијама путем екстринзичних и интринзичних сигналних путева. Ови подаци указују да би ЦТПГ могао бити потенцијални кандидат за лечење ХЦЦ.

Скраћенице

Бак: БЦЛ-2-повезан Кс протеин; Бцл-2: Б ћелијски лимфом 2; ЦТПГ: Цистанцхе тубулоса фенилетаноидни гликозиди; ХЦЦ: хепатоцелуларни карцином; ХРП: пероксидаза рена; МТТ: 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2, 5- дифенилтетразолијум бромид; ПАРП: ензим за поправку ДНК поли (АДП-рибоза) полимеразе; ТЦМ: традиционална кинеска медицина; Δψм: потенцијал митохондријалне мембране.

Финансирање

Овај рад је подржан од стране Пројекта увођења талената високог нивоа аутономног региона Ксињианг Уигур у ЈЛ, гранта Кинеске националне фондације за природне науке (31460241) за ЈЛ и Фонда за покретање докторских студија Универзитета Ксињианг (БС160261 до КСВ и БС150236 до ИЛ).

Доступност података и материјала

Необрађени подаци за ову студију доступни су на разуман захтев одговарајућем аутору.

Прилози аутора

ЈЛ и ЈЛ су дизајнирали експерименте. ПИ, ЈЛ, АА и ИИ су извели експерименте. ЛКС, КСВ и ИЛ анализирали су податке. ПИ, ЈЛ и ЈЛ написали су рукопис. Сви аутори су допринели и одобрили коначни рукопис.

Етичко одобрење

Студију на животињама одобрио је Комитет за етику експеримената на животињама Кључне лабораторије за биолошке ресурсе и генетски инжењеринг Синђијанг Универзитета у Синђијану.

Такмичарски интереси

Аутори изјављују да немају супротстављене интересе.

Напомена издавача

Спрингер Натуре остаје неутралан у погледу јурисдикцијских захтева у објављеним мапама и институционалним везама.

Детаљи о аутору

1 Кључна лабораторија за биолошке ресурсе и генетичко инжењерство Ксињианг, Цоллеге оф Лифе Сциенце анд Тецхнологи, Ксињианг Университи, 666 Схенгли Роад, Урумки, Ксињианг 830046, Кина.

2 Цоллеге оф Лифе Сциенце, Ксињианг Нормал Университи, 102 Ксинии Роад, Урумки 830054, Ксињианг, Кина.

3 Придружена болница за туморе Медицинског универзитета Ксињианг, Урумки 830011, Кина.