ХидроЗитЛа инхибира формирање калцијум оксалатног камена код нефролитних пацова и промовише дуговечност нематода Цаенорхабдитис Елеганс, део 1

Низак унос течности, ниско излучивање цитрата у урину и висок оксидативни стрес су главни узрочници калцијум оксалатне (ЦаОк) нефролитијазе. ХидроЗитЛа садржи цитрате и природне антиоксиданте и развијен је да исправи ова три фактора истовремено. Антиоксиданси теоретски могу продужити животни век организама. У овој студији смо претклинички истраживали антипатогене ефекте ХидроЗитЛа који продужавају животни век и спречавају старење у ћелијама ХК-2, мужјацима Вистар пацова и Цаенорхабдитис елеганс. ХидроЗитЛа је значајно инхибирао агрегацију кристала ЦаОк ин витро и смањио оксидативни стрес у ХК-2 ћелијама изазваним литогеним факторима. За експерименталну нефролитијазу, пацови су подељени у четири групе: етилен гликол (ЕГ), ЕГ плус ХидроЗитЛа, ЕГ плус Уралит-У и нетретирана контрола. Депозити ЦаОк у бубрезима ЕГ плус ХидроЗитЛа и ЕГ плус Уралит-У пацова били су значајно нижи од оних код ЕГ пацова. Интраренална експресија 4-хидроксиноненала код ЕГ плус ХидроЗитЛа пацова била је значајно нижа него код ЕГ пацова. Нивои оксалата у урину пацова ЕГ плус ХидроЗитЛа и ЕГ плус Уралит-У били су значајно нижи од оних код ЕГ пацова. Нивои цитрата у урину ЕГ плус ХидроЗитЛа и ЕГ плус Уралит-У пацова су враћени на ниво код нормалних контролних пацова. Код Ц. елеганс, додатак ХидроЗитЛа значајно је продужио средњи животни век нематода до 34 процента без промене способности храњења. Акумулација липофусцина у нематодама које су суплементиране ХидроЗитЛа била је значајно нижа него код контроле без суплемената. Поред тога, ХидроЗитЛа је инхибирао скраћивање теломера, повећање регулације п16 и прерано старење у ХК-2 ћелијама изложеним литогеним стресорима. Закључци, ХидроЗитЛа инхибира оксидативни стрес и формирање ЦаОк и ин витро и ин виво. ХидроЗитЛа је продужио животни век и одложио почетак старења у Ц. елеганс и људским ћелијама бубрега. Ови претклинички докази сугеришу да је ХидроЗитЛа користан за инхибицију стварања ЦаОк камена, промовише дуговечност и успорава старење.

Цистанцхе гликозид такође може повећати активност СОД у ткивима срца и јетре и значајно смањити садржај липофусцина и МДА у сваком ткиву, ефикасно хватајући различите реактивне радикале кисеоника (ОХ-, Х₂О₂, итд.) и штитећи од оштећења ДНК изазваног од стране ОХ-радикала. Цистанцхе фенилетаноидни гликозиди имају јаку способност уклањања слободних радикала, већу редукциону способност од витамина Ц, побољшавају активност СОД у суспензији сперме, смањују садржај МДА и имају одређени заштитни ефекат на функцију мембране сперме. Цистанцхе полисахариди могу да појачају активност СОД и ГСХ-Пк у еритроцитима и плућним ткивима експериментално остарелих мишева изазваних Д-галактозом, као и да смање садржај МДА и колагена у плућима и плазми и повећају садржај еластина. добар ефекат чишћења на ДППХ, продужава време хипоксије код старијих мишева, побољшава активност СОД у серуму и одлаже физиолошку дегенерацију плућа код експериментално сенесцентних мишева Са ћелијском морфолошком дегенерацијом, експерименти су показали да Цистанцхе има добру антиоксидативну способност и има потенцијал да буде лек за превенцију и лечење болести старења коже. Истовремено, ехинакозид у Цистанцхе-у има значајну способност да уклони слободне радикале ДППХ и има способност да уклони реактивне врсте кисеоника и спречи деградацију колагена изазвану слободним радикалима, а такође има добар ефекат поправљања оштећења ањона слободних радикала тимина.

Кликните на Да ли Цистанцхе ради

【За више информација:george.deng@wecistanche.com / ВхатАпп:86 13632399501】

Скраћенице

БСА Говеђи серум албумин

ЦаОк Калцијум оксалат

ЦОМ Калцијум оксалат монохидрат

ЕГ Етилен гликол

Х2О2 Водоник пероксид

ХЗЛ ХидроЗитЛа

иЦОЦИ Индекс кристализације калцијум оксалата реаговао на индол

НаОк Натријум оксалат

РОС Реактивне врсте кисеоника

РТЛ Релативна дужина теломера

СИПС Прерано старење изазвано стресом

ТА токоферил ацетат

ТАЦ Укупан антиоксидативни капацитет

4-ХНЕ 4-Хидрокиноненал

Болест уринарног камена је древно стање код људи документовано још од египатске ере1,2. Ова болест је и даље значајан уролошки проблем широм света са прогресивно растућом преваленцијом. Уринарни каменци се претежно састоје од калцијум оксалата (ЦаОк), углавном се формирају у бубрезима и веома се понављају. Иако се камен у бубрегу широко перципира као стање које није опасно по живот, има смртоносне последице. Камење прогресивно оштећује бубреге и на крају изазива хроничну болест бубрега3–7. Економски терет болести камена је значајан, пошто су трошкови лечења и лечења камена упоредиви са комбинованим трошковима лечења рака простате и бешике8. Због тога је потребна нова медицинска профилакса за стварање камена.

Неадекватан унос течности смањује излучивање цитрата у урину и повећан оксидативни стрес су три главна узрочна фактора литогенезе ЦаОк. Ове факторе треба кориговати да би се спречила калцификација ЦаОк. Унос течности од 2,5–3 Л/дан је општа превентивна мера9. Калијум цитрат је главни лек за камену болест јер је хипоцитратурија најпознатији узрок формирања и рецидива ЦаОк камена. Пошто је дуготрајан третман калијум цитратом неопходан да би се ефикасно спречило понављање камене болести, лоше придржавање постаје проблем због његових нежељених ефеката и лошег/сланог укуса10–12. Показало се да побољшање укуса додавањем сукралозе побољшава толеранцију додатка калијум цитрата13.

Оксидативни стрес изазван реактивним врстама кисеоника (РОС) је витално укључен у литогенезу ЦаОк14–19. Показало се да исхрана са ниским садржајем антиоксиданса доприноси формирању камена код експерименталних пацова повећањем производње РОС, оксидативног стреса и интрареналног таложења ЦаОк20. Интервенција антиоксиданса је ослабила оксидативни стрес и инхибирала таложење ЦаОк код нефролитних пацова16,21–23. Лекови засновани на лековитим биљкама и традиционална медицина за лечење камена у основи су ублажили оксидативни стрес24.

Традиционална биљна медицина или фитомедицина имају предност дуготрајне употребе у заједници, а пацијенти их генерално сматрају природним и сигурним режимима. Међутим, треба напоменути да се пре клиничке примене морају обезбедити научни докази о ефикасности и безбедности. Претпоставили смо да би режим који комбинује модерну и традиционалну медицину могао бити иновативно решење за минимизирање нежељених ефеката без угрожавања терапеутске ефикасности. Развили смо нову комбинацију традиционалне и модерне медицине, названу ХидроЗитЛа (Хидрозитла или Хила), као алтернативни третман за ЦаОк каменац.

Главни активни антипатогени састојци ХидроЗитЛа су цитрат и водени екстракт стабљике банане. Стабљика банане (Муса спп.) је дуго позната индијска ајурведска традиционална медицина за лечење уринарног камена25, а њена активност инхибиције камена је експериментално доказана26–29. Поонгузхали и Цхегу су показали да екстракт стабљике банане значајно смањује излучивање оксалата у урину код хипероксалуричних уролитних пацова30. Прелиминарна клиничка студија Пилаија из 1995. године показала је да се језгро псеудостема банане може користити у лечењу уролитијазе31. Штавише, сок од стабљике банане има диуретички ефекат који може помоћи у избацивању литогених кристала и олакшати пролаз каменчића. Док калијум цитрат исправља само фактор ризика хипоцитратурије снабдевањем цитратом, напитак ХидроЗитЛа може истовремено да коригује сва три поменута фактора ризика ЦаОк повећањем уноса течности, обнављањем цитрата у урину и снабдевањем природних антиоксиданата.

У овој студији смо истражили да ли ХидроЗитЛа може да изврши инхибиторни ефекат ЦаОк ин витро и ин виво модела. Одређена је претклиничка токсичност ХидроЗитЛа у ћелијама људског бубрега (ХК-2) и мишевима. С обзиром да ХидроЗитЛа садржи антиоксиданте биљног порекла, покушали смо да утврдимо да ли може да продужи животни век и смањи фенотип старења у моделу Цаенорхабдитис елеганс. Такође смо истражили да ли ХидроЗитЛа може инхибирати скраћивање теломера и прерано старење у ХК-2 ћелијама.

Резултати

ХидроЗитЛа: безбедан напитак за конзумацију. ХидроЗитЛа је био негативан на Цлостридиум спп./{{0}}.1 г, Салмонелла спп./25 г и Стапхилоцоццус ауреус/0.1 г. Арсен није откривен. Олово је пронађено на изузетно ниском нивоу (0.033 ппм). Нивои метала, као што су Тл, Ас, Се, Мо, Зн, Сб, Пб, Цд, Цо, Ни, Фе, Мн, Цр, Мг, В, Бе, Ца, Цу, Ти, Ср и Ли, у ХидроЗитЛа, измерени индуктивно спрегнутом плазма-оптичком емисионом спектрометријом (ИЦП-ОЕС) приказани су у додатној табели 1. Токсични метали укључујући Цд, Цр, Ас, Ни, Тл, Сб, Цо, Бе, В и Ли нису откривени . Елементи у траговима, као што су Мг, Зн, Ца и Фе, пронађени су на 14.04±{{20}}.05, 2,09±0,05, 0. 86±0,02 и 0,16±0,001 ппм, респективно.

In vitro, cytotoxicity of HydroZitLa in HK-2 cells using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was performed and reported in our previous study32. Increased HydroZitLa   concentration gradually decreased cell survival. Te IC50 of HydroZitLa in HK-2 cells was 24.7% v/v. In vivo, acute toxicity testing revealed that all HydroZitLa-administered mice survived until the end of the experiment  (14 days). No gross lesions were found in the visceral organs in the HydroZitLa-administered group and the control group. Therefore, the LD50 of HydroZitLa was>20 мЛ/кг.

Инхибиција агрегације ЦаОк и антиоксидативна функција ХидроЗитЛа. ХидроЗитЛа је значајно инхибирао агрегацију кристала калцијум оксалат монохидрата (ЦОМ) у семену, али албумин говеђег серума (БСА, 1 мг/мЛ) није (слика 1А). Лимунска киселина је снажно инхибирала ЦОМ агрегацију (допунска слика 1).

Концентрација ХидроЗитЛа од 10 процената (в/в) пружила је највеће антиоксидативно дејство са најнижом цитотоксичношћу. Због тога смо користили 10 процената (в/в) ХидроЗитЛа за накнадни третман у моделу ћелијске културе. Производња РОС-а у ћелијама ХК-2 изложених Х2О2 и ЦОМ је значајно повећана у поређењу са контролом, али је значајно смањена након заједничког третмана ХидроЗитЛа (слика 1Б). Поред тога, ХидроЗитЛа је значајно смањио нивое садржаја карбонила протеина у ХК-2 ћелијама изложеним Х2О2 и ЦОМ (слика 1Ц). Излагање ХК-2 ћелија Х2О2 (1000 µМ) и ЦОМ (150 µг/цм2) изазвало је промене у ћелијској морфологији и повећану ћелијску смрт. Третман ХидроЗитЛа спречио је морфолошке промене, спасио ћелије од апоптозе и обновио пролиферацију ћелија (слика 1Д).

Инхибиција депозита кристала ЦаОк у бубрезима пацова. Биохемијски профил узорака урина 24-х након интервенције (35. дан) добијених од експерименталних пацова представљен је у табели 1. Бубрези етилен гликол (ЕГ) пацова су били увећани и бледи (слика 2А), и њихова тежина били су значајно већи него код ЕГ плус ХидроЗитЛа и ЕГ плус Уралит-У пацова (слика 2Б). Бојење хематоксилином и еозином (Х&Е) открило је да бубрези ЕГ пацова имају јак знак упале, док су бубрези ЕГ плус ХидроЗитЛа и ЕГ плус Уралит-У пацова изгледали нормално, слично као код нормалних контролних пацова (слика 2А). Сви пресеци бубрега обојени Х&Е приказани су на додатној слици 2.

Дволомни кристални депозити ЦаОк су значајно уочени у бубрежним деловима ЕГ пацова, али нису пронађени у пресецима бубрега нормалних контролних пацова (слика 3А). Тесе наслаге ЦаОк су скоро нестале у бубрежним деловима ЕГ плус ХидроЗитЛа и ЕГ плус Уралит-У пацова. Поларизовани микроснимци свих секција бубрега приказани су на додатној слици 3.

Иасуе бојење је потврдило да су се кристали ЦаОк (црни преципитати) у великој мери акумулирали у бубрезима (и у кортексу и у медули) ЕГ пацова, али ово таложење ЦаОк је значајно инхибирано од стране ХидроЗитЛа и Уралит-У (слика 3А). Број црних ЦаОк преципитата у пресецима бубрега ЕГ плус ХидроЗитЛа и ЕГ плус Уралит-У пацова био је значајно мањи него код ЕГ пацова (слика 3Б). Резултати Иасуе бојења свих секција бубрега приказани су на додатној слици 4.

Смањење експресије 4‑хидроксиноненала (4‑ХНЕ) у бубрежним ткивима. Интраренална експресија 4-ХНЕ, као маркера оксидативног стреса, била је значајно повећана код ЕГ пацова у поређењу са нормалним контролним пацовима (слика 4А). Све у свему, експресија 4-ХНЕ у бубрезима ЕГ плус ХидроЗитЛа и ЕГ плус Уралит-У пацова била је нижа него код ЕГ пацова. Међутим, квантитативно, удео 4-ХНЕ-позитивних ћелија био је значајно нижи само код ЕГ плус ХидроЗитЛа пацова него код ЕГ пацова (слика 4А). Резултати 4-ХНЕ бојења свих реналних пресека представљени су на додатној слици 5. У овој студији смо такође извршили имунохистохемијско бојење за цепану каспазу-3, али нисмо приметили значајну промену ове апоптотике маркер међу групама (допунска слика 6).

Смањење нивоа индекса кристализације калцијум оксалата (иЦОЦИ) у урину оксалата и индола. Оксалат у урину је био повишен код ЕГ пацова у односу на контролне пацове. Ово повишење оксалата у урину је значајно смањено након третмана ХидроЗитЛа и Уралит-У (слика 4Б). Насупрот томе, цитрат у урину је смањен код ЕГ пацова у односу на контролне пацове. Иако третмани ХидроЗитЛа и Уралит-У нису значајно повећали нивое цитрата у урину у односу на ЕГ пацове, могли су да врате нивое цитрата у урину на ниво који је пронађен код нормалних контролних пацова (слика 4Ц). Нивои мокраћне киселине у урину у поређењу са групама ЕГ, ЕГ плус ХидроЗитЛа и ЕГ плус Уралит-У нису се значајно разликовали (слика 4Д). Слично оксалату у урину, нивои иЦОЦИ у урину ЕГ плус ХидроЗитЛа и ЕГ плус Уралит-У пацова били су значајно нижи него код ЕГ пацова (слика 4Е).

Ц. елеганс продужење животног века. Суплементација са ХидроЗитЛа (10–40 процента в/в) значајно је продужила максимални животни век Ц. елеганс дивљег типа (слика 5А). Највећи ефекат продужења животног века био је са 30 посто в/в, што би могло повећати медијан преживљавања нематода са 16,0 дана (контрола) на 21,5 дана (повећање од 34,4 посто). Средње преживљавање нематода допуњених са 10 процената, 20 процената и 40 процената в/в ХидроЗитЛа значајно је продужено на 18,5 (повећање од 15,6 процената), 19,5 (повећање од 21,9 процената) и 21,0 (повећање од 32,3 процената), респективно. Утицај свих тестираних концентрација ХидроЗитЛа (од 1 до 100 процената в/в) на преживљавање Ц. елеганс се огледа у додатној слици 7.

Понашање при уносу хране, као што је назначено брзином пумпања из фарингеалне шупљине, у данима 0, 5, 10 и 15 није се значајно разликовало између додатка ХидроЗитЛа (20 процената, 30 процената и 40 процената в/в) и не- допуњене контролне нематоде (слика 5Б).

Ниво аутофлуоресцентног липофусцина (маркера старења) је праћен унутар нематода након суплементације са 20 процената, 30 процената и 40 процената в/в ХидроЗитЛа (слика 6А). Додаци ХидроЗитЛа у свим испитиваним концентрацијама значајно су смањили нивое акумулације липофусцина код нематода у поређењу са контролом (слика 6Б).

Инхибиција трошења теломера, повећање регулације п16 и прераног старења у ХК-2 ћелијама. Релативна дужина теломера ХК-2 ћелија третираних са Х2О2, НаОк и ЦОМ била је значајно краћа од дужине нетретираних контрола (слика 6Ц). Заједнички третман ХидроЗитЛа значајно је ометао скраћивање теломера у ХК-2 ћелијама третираним Х2О2, НаОк и ЦОМ.

Резултати двоструког бојења -галактозидазе повезане са старењем (СА- -гал) и п16 показали су да Х2О2, НаОк и ЦОМ-индуковано прерано старење изазвано стресом (СИПС), на шта указује повећани проценат СА{{8 }}гал-позитивне ћелије и повећање п16 у ХК-2 ћелијама (слика 6Д). п16 је био интензивно обележен у тим СА- -гал-позитивним ћелијама. Заједнички третман ХидроЗитЛа значајно је инхибирао СИПС (смањена СА- -гал позитивност) и повећање п16 у ХК-2 ћелијама изложеним Х2О2, НаОк и ЦОМ (слика 6Д).

Дискусија

Напредак у развоју лекова за бубрежно-каменску болест је релативно спор и ниједан нови лек није клинички примењен деценијама33. Замена терапије алкалним цитратом је и даље широко коришћен лек за превенцију поновног настанка каменца. Гастроинтестинални нежељени ефекти и лош укус су главни недостаци третмана калијум цитратом који узрокују лошу усклађеност11–13. Смернице ЕАУ за уролитијазу наводе да идеални лек треба да заустави формирање камена, да нема нежељених ефеката и да се лако примењује, а ови елементи су важни за постизање добре усаглашености9. У овој студији смо развили ХидроЗитЛа да бисмо решили недостатке калијум цитрата и испунили критеријуме идеалног лека што је више могуће. Напитак ХидроЗитЛа има одличан кисело-слатки укус. Веровали смо да би лошу укусност калијум цитрата могао решити ХидроЗитЛа слично извештајима Мецхлина ет ал. који је показао да је додавање Спленда калијум цитрату помогло да се побољша усклађеност терапије калијум цитратом13.

Мали унос течности је важан фактор ризика за стварање ЦаОк камена. Пацијентима са каменом болешћу се препоручује да повећају унос течности на 2,5–3.0 Л/дан, али им је релативно тешко да одрже придржавање, посебно на дужи рок. Тренутни лекови за камен се праве у облику праха или таблета. Унос воде са овим лековима је обично неадекватан и варира међу пацијентима. Насупрот томе, испијање ХидроЗитЛа омогућило је пацијентима да повећају унос воде за најмање 500 мЛ са сваком потрошеном врећицом. Уз дуготрајну употребу, ХидроЗитЛа би могао да подстакне промене у навикама у исхрани ка повећању дневног уноса течности. Подаци о процени токсичности су осигурали да је ХидроЗитЛа безбедан за употребу. Концентрат за пиће ХидроЗитЛа званично је одобрила Таи Фоод анд Друг Администратион (ФДА) и локално доступан на Тајланду од 2019. Колико знамо, потрошачи нису пријавили токсичност или озбиљне нежељене ефекте.

ХидроЗитЛа је значајно инхибирао агрегацију ЦОМ кристала ин витро. Иако је албумин пријављен као инхибитор агрегације ЦаОк34, нисмо приметили значајну инхибицију агрегације ЦаОк од стране БСА у нашем систему за тестирање. Насупрот томе, лимунска киселина је снажно инхибирала ЦОМ агрегацију у нашем тесту. Вероватно је лимунска киселина садржана у ХидроЗитЛа била одговорна за блокаду агрегације ЦОМ.

Фенолни садржај у ХидроЗитЛа је изведен из стабљика банане, цветова плавог грашка и дрвета сапана. Антиоксидативна својства стабљике банане 35, цветова плавог грашка 36 и екстракта срца сапана 37 су добро документована. Ова студија је показала да ХидроЗитЛа значајно смањује интрацелуларну производњу РОС и оксидацију протеина у ХК-2 ћелијама изложеним Х2О2 и ЦОМ. Штавише, ХидроЗитЛа је дубоко спасио ХК-2 ћелије од апоптотске ћелијске смрти изазване Х2О2 и ЦОМ. Ови подаци су истакли да ХидроЗитЛа има антиоксидативну функцију за ублажавање оксидативног стреса у бубрежним тубуларним ћелијама.

У овој студији смо демонстрирали на моделу ЦаОк нефролитијазе пацова у којој је ХидроЗитЛа значајно инхибирао таложење ЦаОк у бубрезима пацова, а његова антипатогена ефикасност је била еквивалентна леку Уралит-У. Занимљиво је да је ХидроЗитЛа значајно смањио интрареналну 4-ХНЕ експресију, али Уралит-У није. ХидроЗитЛа је садржао антиоксиданте, али Уралит-У није. Наши подаци сугеришу да је ублажавање оксидативног стреса била предност ХидроЗитЛа у односу на калијум цитрат. ХидроЗитЛа и Уралит-У су имали упоредиву ефикасност на смањење уринарног оксалата код нефролитних пацова, иако је била израженија код ХидроЗитЛа. Значајно смањење нивоа иЦОЦИ у урину (индикатор уринарне способности кристализације ЦаОк38) је такође примећено код пацова третираних ХидроЗитЛа и Уралит-У. Ово је показало да је потенцијал кристализације ЦаОк у урину смањен након третмана ХидроЗитЛа и Уралит-У. Чинило се да ХидроЗитЛа испоручује антипатогену активност првенствено кроз смањење излучивања оксалата у урину. Финансирање је поткрепљено извештајима Поонгузхалија и Чегуа који су показали да хипероксалурски пацови третирани воденим екстрактом стабљике банане значајно смањују излучивање оксалата у урину30. На основу садашњих налаза, ХидроЗитЛа је изазвао инхибиторне ефекте ЦаОк камена који су еквивалентни тренутно коришћеном калијум цитрату, и могао би бити клинички користан као нова терапијска алтернатива за ЦаОк нефролитијазу.

Значајно повећање нивоа цитрата у урину код нефролитних пацова након третмана ХидроЗитЛа и Уралит-У није откривено. Међутим, примећен је тренд повећања излучивања цитрата у урину након оба третмана. Ово се може објаснити малом величином узорка (н=6) или неадекватном дозом цитрата (2 мЕк дневно, у просеку једнако 0,4 г/кг дневно). Иасуи ет ал. користили калијум цитрат (Уралит, Ниппон Цхемипхар, Јапан) у количини од 0,5 г/кг (ниска доза) и 20 г/кг (висока доза) дневно у својим експериментима како би пронашли значајно повећање нивоа цитрата у урину у експериментални пацови39. Гхаени и др. третирани ЕГ пацовима са калијум цитратом (Сепидај, Иран) у дози од 2,5 г/кг дневно да би се приметило значајно повећање излучивања цитрата у урину након третмана40. Дакле, ниска доза цитрата је вероватно била разлог да се не нађе значајно повећање цитрата у урину у нашем моделу пацова након третмана ХидроЗитЛа и Уралит-У. Међутим, третмани ХидроЗитЛа и Уралит-У могли би вратити уринарни цитрат на нивое који су примећени код нормалних контролних пацова. Ова нормализација цитрата у урину могла би да допринесе, барем делимично, инхибицији стварања ЦаОк.

【За више информација:george.deng@wecistanche.com / ВхатАпп:8613632399501】