Имуностимулативна активност полисахарида који се екстрахују водом из Цистанцхе Десертицола као биљног адјуванса ин витро и ин виво

Увод

Вакцине су важне за контролу или превенцију болести. Новогенерисане вакцине које се тренутно развијају су високо пречишћени рекомбинантни антигени са већом безбедношћу, али пречишћени антигени не могу да стимулишу задовољавајући имуни одговор у поређењу са атенуираним или инактивираним препаратима патогена. Уз помоћ адјуванса, вакцине могу изазвати трајне имуне одговоре [1,2]. Нови моћни адјуванси су веома забринути у обе вакцинеразвоја и здравља људи. До данас су идентификовани и опсежно проучавани различити адјуванси. Ови адјуванси дају вакцинама неколико предности, укључујући смањење потребне количине антигена, минимизирање броја имунизација потребних за нормалан имуни одговор и изазивање бржег, ширег и јачег имунолошког одговора [3–5]. Иако су развијени многи моћни адјуванси, као што су липополисахарид (ЛПС) и Фројндов комплетан адјуванс (ФЦА), они нису широко примењени због своје токсичности. Дакле, само неколико помоћних средстава, као што је Алум, има дозволу за клиничку употребу [6]. Све у свему, требало би развити ефикасније и безбедније адјувансе за промовисање бољих профилактичких и терапеутских вакцина против заразних и неинфективних болести.

ПРИРОДНА ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ЈАЧАЊЕ ИМУНИТЕТА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Безбедност је важан фактор за разматрање у развоју адјуванса. Кинески зељасти састојци укључују хранљиве материје и важне активне композите, као што су фенолна једињења и полисахариди, који могу деловати као моћни имуностимуланси [7–9]. Међу њима, полисахариди из традиционалних кинеских биљака су широко истражени због својих имуностимулативних активности и ниске токсичности. На пример, инулин је имуни адјуванс без токсичности других адјуванса као што је ФЦА. АдвакТМ делта инулин адјуванс је такође успешно побољшао имуногеност вакцине [10,11]. Астрагалус, такође познат као Хуангки на кинеском и Радик Астрагали на латинском, широко је распрострањен широм света. Полисахарид је један од његових главних активних састојака одговоран за имуномодулаторну активност. Експерименталне студије су показале да полисахарид Астрагалус поседује јака имуномодулаторна дејства и ин витро и ин виво [12, 13]. Полисахариди Лициум барбарум као адјуванси вакцине такође су показали добра побољшања и стимулативне ефекте [14, 15]. Ове студије су показале да су кинески биљни полисахариди идеални кандидати за развој адјуванса.

Цистанцхе десертицолаИЦ Ма (ЦД, "Роу Цонг Ронг" на кинеском) је вредна традиционална кинеска биљка и обично се сматра "пустињским гинсенгом" због својих супериорних тоничких ефеката. Распрострањен је у сушним или полусушним регионима у Синђиангу. У Кини се његова осушена месната стабљика користила као тоник храна стотинама година [16, 17]. Дуги низ година, кувани ЦД се користи као тоник за лечење оштећења изазваних пренапрезањем, што сугерише да је безбедан за оралну примену. Ова биљка је широко распрострањена због својих широких лековитих функција. Недавне фитокемијске и фармаколошке студије показале су да су полисахариди главне биолошки активне компоненте и да имају различите биолошке ефекте, укључујућиимуномодулаторна активност, антиоксидативни ефекат и антиинфламаторна дејства[18–21]. Међутим, ретко је пријављивана активност за јачање имунитета полисахарида који се екстрахују водом из Ц. десертицола у Синђиангу.

Добро је познато да су ДЦ важне ћелије које представљају антиген (АПЦ) које обезбеђују сигнале потребне за иницирање имунолошких одговора и модулацију урођених и адаптивних ћелија. Неки адјуванси који побољшавају узимање антигена од стране ДЦ-а могу повећати костимулативне или МХЦ молекуле ипојачати имунитет. Када почне сазревање ДЦ, производи се више костимулативних молекула и цитокина и ДЦ показују различите фенотипове [22, 23].

У овој студији, прво смо искористили да ли ВПЦД може промовисати активацију ДЦ-а преко ТЛР4 сигналног пута ин виво. Пошто су ДЦ били веза између урођених и адаптивних имунолошких одговора, претпоставили смо да ће активација ДЦ-а стимулисана ВПЦД-ом утицати на исход адаптивног имунитета. Испитивали смо специфични имуни одговор на овалбумин (ОВА) код мишева лечених ВПЦД, укључујући титре ИгГ, ИгГ1 и ИгГ2а подкласе, Т- и Б- пролиферацију и производњу цитокина. Истраживали смо да ли би третман ВПЦД повећао активност ДЦ и Трег ћелија у слезини ових мишева. Наши налази су доказали потенцијалну имуномодулаторну активност природних полисахарида из Ц. десертицола и проширили обим његове примене.

материјали и методе

Животиње

Женке мишева старе осам до десет недеља Ц57БЛ/6, БАЛБ/ц или ИЦР купљене су од Прве болнице Медицинског универзитета Ксињианг (Уримуки, Ксињианг, Кина). Мишеви су смештени у условима без патогена у складу са смерницама Комитета за негу и употребу животиња (АЦУЦ) Универзитета Ксињианг за здравље и добробит животиња. Процедуре за експерименте на животињама одобрила је АУЦЦ Универзитета Ксињианг.

Екстракција водених екстраката

Ц. десертицола је биљка у провинцији Ксињианг у Кини. Сирови полисахарид је добијен екстракцијом воде и таложењем етанолом. Укратко, 100 г осушене Ц. десертицола је млевено у прах, а затим филтрирано. Прашак је рефлуксован са петролеј етром на собној температури више пута, а затим рефлуксован са анхидрованим етанолом током 1 х да би се уклонили обојени састојци и липиди. Остаци су екстраховани кључалом водом три пута и екстракти су спојени, центрифугирани на 4000 рпм током 10 минута и рефлуксовани на 60°Ц током 4 х. Четири пута запремине 95% етанола је додато у раствор да би се исталожили сирови полисахариди. Сирови полисахариди су поново растворени у дестилованој води и третирани са Севаге реагенсом да би се уклонили протеини. Екстракти су растворени у ПБС-у и стерилисани кроз филтер од 0.22- μм. Коначно, укупан садржај шећера у ВПЦД износио је 59,58%, што показује анализа фенол-сумпорна киселина [24].

Генерација ДЦ-а

БМ-ДЦ су генерисани према претходно описаној методи са малим модификацијама [25]. ДЦ-ови коштане сржи из Ц57БЛ/6 мишева су испрани са РПМИ-1640 комплетним медијумом (Гибцо) са додатком 10% феталног телећег серума (Хицлоне). Сакупљене ћелије су поново суспендоване у медијуму РПМИ-1640 са 50 μМ -меркаптоетанола (Сигма, Ст Лоуис, МО) и 20 нг/мЛ мишјег ГМ-ЦСФ (Пепротецх, Роцки Хилл, НИ) и инкубиране на 37˚ Ц у атмосфери 5% ЦО2. Половина медијума за културу је замењена свежом подлогом која садржи ГМ-ЦСФ сваких 1-2 дана. Ћелије су сакупљене 6. дана, третиране различитим дозама ВПЦД и ЛПС (100 нг/мЛ) (Сигма, Ст Лоуис, МО) током 24 х, а затим процењене проточном цитометријом.

Детекција сазревања ДЦ и активације Т ћелија ин витро

Ефекат сазревања ВПЦД ин витро на БМ-ДЦ је процењен на основу резултата фенотипске анализе ФАЦ-а. Седмог дана, БМ–ДЦ из Ц57БЛ/6 су индуковани у присуству ГМ-ЦСФ, а затим третирани различитим концентрацијама ВПЦД (0.01, 0.{{ 11}}2, 0.05, 0,1 и 0,2 мг/мЛ) током 12 х у три примерка. ЛПС (100 нг/мЛ) је коришћен као позитивна контрола. Након што су БМ-ДЦ испрани у ПБС-у и коришћен је Фц Блоцк (БД Биосциенцес, ЦА) да би се спречило неспецифично везивање антитела, ћелије су обојене у ПБС коришћењем одговарајућег ФИТЦ-, ПЕ- или АПЦ-коњугованог ЦД40, ЦД11ц, ЦД{ {23}}, ЦД80 и МХЦ-ИИ антитела (БД) током 20 минута на 37˚Ц. Обојене ћелије су откривене помоћу ФАЦ Цалибура (БД). Анализа података је обављена помоћу софтвера ФловЈо (Трее Стар).

У експерименту сазревања ДЦ ин витро, супернатанти ћелијске културе су такође сакупљени за анализу ИЛ-12 и ТНФ- помоћу комплета за анализу цитокина (Бостер, Вухан, Кина) према упутствима произвођача. Апсорбанца на 450 нм је мерена помоћу ЕЛИСА читача плоча (Био-Рад, САД). Количине цитокина у узорцима израчунате су стандардним кривама рекомбинантних цитокина према линеарној методи регресије.

Да би се испитала њихова алогена стимулативна активност, изведен је експеримент мешане лимфоцитне реакције (МЛР) према претходној методи [26] МТТ (Сигма, Ст Лоуис, МО) тестом. Укратко, БМ-ДЦ из Ц57БЛ/6 мишева који су коришћени као стимулаторне ћелије су пронађени 7. дана у медијуму РПМИ-1640 плус ГМ-ЦСФ и третирани различитим концентрацијама ВПЦД током 12 х на 37˚Ц. Ћелије су испране и поново суспендоване у медијуму РПМИ-1640 пре постављања у плочу 24-бунарића. Ћелије које реагују суспензију синглепленоцита су изоловане из БАЛБ/ц мишева. БМ-ДЦ су помешани са спленоцитима у односу 1:5 и 1:10. Ћелије су култивисане на 37˚Ц у атмосфери са 5% ЦО2 три дана у три примерка. ЛПС третман је коришћен као позитивна контрола. Културе су накнадно додане са 20 μЛ МТТ за последњу 4-х култивацију. За анализу пролиферације Т ћелија мерене су апсорбанције на мерној таласној дужини (490 нм) и референтној таласној дужини (650 нм). Сви узорци су мерени у односу на позадину контроле.

ПРИРОДНИ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ ВАШЕГ ИМУНОГ СИСТЕМА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Третман инхибитором ТЛР4 ин витро

БМ-ДЦ су претходно третирани са 5 μМ ТАК-242 (инхибитор ТЛР4, Медцхемекпресс Инц. УСА) током 1 х, а затим су култивисани са различитим концентрацијама ВПЦД (100 и 200 уг/мЛ) током 12 х у присуству или одсуству Голџија Зауставите се у три примерка. У позитивној контроли је додат ЛПС. Ћелије и супернатанти су детектовани помоћу ФАЦ-а за анализу површинских маркера ЦД86 и ЦД40 и ЕЛИСА за анализу цитокина ТНФ-а и ИЛ-12, респективно.

Протокол имунизације

Тест акутне токсичности

У тесту оралне акутне токсичности у овој студији, коришћена су 40 здрава одрасла ИЦР миша. ИЦР мишеви су гладни (храна, али не и вода преко ноћи) пре дозирања. ВПЦД је орално даван у дозама од 0, 50, 500 или 5000 мг/кг телесне тежине свакој животињи током 7 дана. У контролну групу су укључени мишеви третирани сланим раствором и алум. Животиње су посматране свакодневно током 14 узастопних дана. Мишеви су појединачно посматрани да бележе смртност и клиничке знаке. Поред тога, током експеримента су мерене телесне тежине и потрошња хране и воде. 14. дана, индекс слезине или тимуса је израчунат као (тежина слезине или тимуса/телесна тежина) × 10.

Детекција имуномодулаторне активности ВПЦД ин виво.

Да би се испитало да ли ВПЦД има имуномодулаторну активност, овалбумин (ОВА) (Сигма) је коришћен као модел антигена, а женке ИЦР мишева су насумично подељене у 7 група (негативна контролна група (0.9% НаЦл и ВПЦД 400 уг ) и позитивна контрола (стипса 200 уг са ОВА)). Мишеви су давани супкутано два пута са 10 уг ОВА самог или ВПЦД са ОВА према дози од 20, 100 или 400 уг са 2-недељним интервалом. Узорци крви и слезине су добијени након допунске вакцинације да би се открили титри ИгГ, подкласе ИгГ, пролиферација спленоцита и цитокини, површински маркери ДЦ и Трег фреквенција.

Детекција ОВА-специфичних антитела

ОВА-специфични ИгГ титри и подкласе су испитивани ЕЛИСА тестом према претходној методи [27]. ЕЛИСА плоче (Нунц, Тхермо Фисхер Сциентифиц) су обложене преко ноћи, а затим блокиране. Узорци серума су серијски разблажени за анализу титра ИгГ или детекцију ИгГ1 и ИгГ2а (Соутхерн Биотецх, Инц.). Плоче су затим инкубиране са ПБСТ који садржи ХРП-коњуговане анти-мишје ИгГ, ИгГ1 и ИгГ2а током 1 х на 37°Ц. Колориметријска реакција је развијена са тетраметилбензидином (ТМБ), а затим су мерене апсорбанције на 450 нм/655 нм и изражене као јединице оптичке густине (ОД).

Детекција пролиферације спленоцита и цитокина

Пролиферација спленоцита је одређена МТТ тестом. Дана 21. након прве вакцинације, добијена је једна суспензија спленоцита. Ћелије су култивисане у РПМИ-1640 медијуму у 96-плочама са бунарима у складу са концентрацијом од 1×106 ћелија/бунарићу у три примерка. Културе су стимулисане са ОВА (коначна концентрација 10 уг/мЛ), ЦонА (коначна концентрација 5 уг/мЛ) (Сигма, Ст Лоуис, МО) и ЛПС (коначна концентрација 100 нг/мЛ) током 48 х на 37˚Ц . Ћелије су култивисане 48 х и 20 μЛ (5 мг/мЛ) МТТ (Сигма, Ст Лоуис, МО) је додато у сваки бунар и инкубирано још 4 х. Након додавања 50 μЛ ДМСО у сваки бунар да би се зауставио развој боје (Сигма), плоче су очитане на 570 нм помоћу читача микротитарских плоча (БиоРад, Калифорнија, САД). Пролиферација спленоцита је изражена као индекс стимулације (СИ), који је био однос ОД570 нм стимулисаног и нестимулисаног бунара.

Приноси ИЛ-4 и ИФН- у Т ћелијама мерени су интрацелуларним бојењем цитокина према објављеном протоколу са мањим модификацијама [27, 28]. Појединачна суспензија спленоцита је припремљена 21. дана након прве вакцинације. Након лизе црвених крвних зрнаца, спленоцит (2×106 ћелија/мЛ) је инкубиран са ОВА (10 уг/мЛ) током 4- х стимулације и додат је Голги стоп (БД) за 12 х инкубације, ПМА као позитиван контролу. Ћелије су сакупљене, испране ПБС-ом, обојене са ЦД4-ФИТЦ/ЦД8-ФИТЦ и фиксиране и пермеабилизоване са Цитофик/Цитоперм китом (БД) према упутствима произвођача. Интрацелуларно бојење цитокина је изведено са одговарајућом концентрацијом ИЛ-4-ПЕ или ИФН- -АПЦ антитела на 4˚Ц током 20 мин. Обојене ћелије су откривене помоћу ФАЦ-а. Анализа података је спроведена у ФловЈо.

Процена сазревања ДЦ и Трег ћелија у слезини

За анализу сазревања ДЦ из спленоцита код мишева, извршено је бојење ћелијске површине са ЦД11ц-ПЕ, ЦД40-ФИТЦ и ЦД80-АПЦ антителима. Трећег дана након прве вакцинације, добијена је суспензија појединачних спленоцита (1×106 ћелија/мЛ) и ћелије су подвргнуте двоструком бојењу. Интензитет флуоресценције је измерен помоћу ФАЦс Цалибур, а измерени подаци су анализирани помоћу ФловЈо.

Да бисте видели да ли ВПЦД може да смањи фреквенцију ЦД4+ ЦД25+ Фокп3+ Трег ћелија. Појединачна суспензија спленоцита је припремљена 7. дана након друге вакцинације. Спленоцит (2×106 ћелија/мЛ) је подвргнут бојењу ћелијске површине са ЦД4-АПЦ антителом, након чега је уследило бојење нуклеарним цитокином одговарајућим ЦД25-ФИТЦ и Фокп3-ПЕ антителима са регулаторним комплетом за бојење Т-ћелија миша (еБиосциенцес) према упутствима произвођача. Учесталост ЦД{11}} ЦД25+ Фокп3+ Трег ћелија је тестирана на ФАЦ-овима. Анализа података је спроведена у ФловЈо.

Статистичка анализа

Тестови једносмерне анализе варијансе (АНОВА) (Тукеи'с Мултипле-Цомпарисон Тест) су урађени да би се анализирале разлике између више експерименталних група. Све вредности су изражене као средња вредност ±СД. П< 0.05 is believed to be statistically significant. The statistical analyses were performed using Prism 5.0 software.

Резултати ВПЦД је промовисао сазревање и функцију БМ-ДЦ ин витро

Адаптивни имунитет је одређен активацијом ДЦ, укључујући типове костимулативних молекула и цитокина [29, 30]. У почетку смо истраживали да ли ВПЦД може промовисати експресију костимулативних молекула. Према различитим дозама ВПЦД, БМ-ДЦ

из Ц57БЛ/6 су примењени. Анализирани су нивои експресије ЦД11ц, ЦД86, ЦД80, ЦД40 и МХЦ-ИИ у ћелијама (слика 1). Ћелије затворене са ССЦ и ФСЦ показале су да третман различитим дозама ВПЦД није променио морфологију БМ-ДЦ (подаци нису приказани). Нивои експресије ЦД86, ЦД80 и ЦД40 су значајно повећани на начин који зависи од дозе у поређењу са нетретираном групом и достигли су плато под дозом од 20 уг/мЛ ВПЦД, али је разлика била није значајно у поређењу са ЛПС групом (слике 1А-1Ц). Ниво експресије МХЦ-ИИ је значајно повећан до своје максималне вредности под дозом од 50 уг/мЛ (слика 1Д). Резултати анализе површинских маркера ћелије показали су да су ДЦ третирани ЛПС или ВПЦД показали значајно повећане нивое експресије ЦД86, ЦД80, ЦД40 и МХЦ-ИИ и промовисали фенотипско сазревање.

Неки адјуванси могу да повећају костимулативне молекуле на ДЦ или директно индукују лучење цитокина. ИЛ-12 и ТНФ- су главни цитокини за активирање Тх1 имуног одговора. Анализирали смо приносе цитокина у БМ-ДЦ након третмана ВПЦД. Након што су БМ-ДЦ третирани различитим садржајем ВПЦД током 12 х, супернатант је сакупљен да би се открио садржај ИЛ-12 и ТНФ- са ЕЛИСА комплетом. ВПЦД би могао зависно од дозе да повећа производњу ИЛ-12 (слика 2А) и ТНФ- (слика 2Б). Резултати су показали да ВПЦД може да изазове функционално сазревање ДЦ.

У имунолошком одговору неопходно је функционално активирати ДЦ. Затим, виши ниво алогене пролиферације Т-ћелија индукован је потпуно зрелим ДЦ. Стога је МЛР истраживао функционални одговор ДЦ-а на ВПЦД. Алостимулаторна способност ДЦ-а изазваних ВПЦД, слично ЛПС-у, драматично је побољшана на начин који зависи од дозе у назначеном односу (Слика 2Ц и 2Д). Резултати су показали да је ВПЦД побољшао презентацију антигена и оптимизовао одговор Т-ћелија помоћу МЛР ин витро.

ВПЦД је промовисао сазревање ДЦ-а путем ТЛР4 пута

Из горњих резултата могло би се закључити да су БМ-ДЦ активирани ВПЦД указивали на сличне експресије површинских молекула ДЦ као ЛПС (ТЛР4 лиганд). Стога смо претпоставили да се БМ-ДЦ активирају ВПЦД путем ТЛР4 пута. Након што су БМ-ДЦ претходно третирани ТАК-242 (инхибитором ТЛР4) и заједно култивисани са ВПЦД и ЛПС током 12 сати, експресија ЦД40, ЦД86, ТНФ-а или ИЛ{{12 }} је откривен помоћу ФАЦ-а или ЕЛИСА-е. Као што је приказано на сликама 3А и 3Б, ТАК-242 третман је резултирао значајно смањеном експресијом ЦД40 и ЦД86 изазваном ЛПС или ВПЦД, и производњом цитокина ИЛ-12 или ТНФ-а је такође значајно смањен (слике 3Ц и 3Д). Резултати су показали да ВПЦД може активирати сазревање ДЦ кроз ТЛР4 пут.

ВПЦД је побољшао хуморални и ћелијски имунитет

За поређење, проценили смо ефекте ВПЦД на изазивање хуморалног имунолошког одговора код ОВА имунизованих мишева. Пре вакцинације и 14., 21.

35 и 49 након прве вакцинације, крв је сакупљена да би се открио титар ИгГ и серум подкласа ИгГ помоћу ЕЛИСА. Одговор ИгГ антитела на ОВА повећавао се са повећањем дозе примене ВПЦД (100 и 400 уг) на начин који зависи од дозе (слика 4). Оптимална концентрација је била 100 уг/мЛ ВПЦД и повећала је ИгГ одговоре за два пута у поређењу са само ОВА 21, 35 и 49 дана (слика 4А). Значајно повећање нивоа ОВА-специфичних ИгГ1 и ИгГ2а антитела испод 20 и 100 уг примене ВПЦД добијено је у поређењу са ОВА групом у серуму 35. дана (слика 4Б). У међувремену, Алум је промовисао само нивое експресије ОВА-специфичних ИгГ и ИгГ1 антитела код имунизованих мишева. Сам ВПЦД није покренуо ОВА-специфична антитела. Горе наведени резултати су показали да је ВПЦД генерисао веће титре антитела и уравнотеженије Тх1/Тх2 одговоре од Алум.

Пролиферација спленоцита је још један показатељ ћелијског имунитета. ЦонА стимулише Т-ћелије, а ЛПС стимулише пролиферацију Б-ћелија. 21. дана након прве вакцинације, добијена је суспензија појединачне спленоците и стимулисана са ОВА (10 уг/мЛ), ОВА323-339 (10 уг/мЛ) пептидом, ЦонА (5 уг/мЛ) и ЛПС ( 5 уг/мЛ) током 48 х. Затим је пролиферација Т ћелија мерена МТТ методом. ВПЦД би могао значајно да промовише пролиферацију спленоцита стимулисану ОВА-антигеном, Цон А-митогеном и ЛПС митогеном код мишева имунизованих са ОВА и ВПЦД (слика 5), а оптимална концентрација ВПЦД је била 100 уг/мЛ. Ови подаци су показали да ВПЦД као помоћно средство за вакцину код мишева имунизованих ОВА може ефикасније да индукује активацију Т-ћелија и Б ћелија од стипсе.

Сви тестирани ВЦПД адјуванси формулисани са ОВА вакцинама генерисали су подједнако јак хуморални и ћелијски имунитет (слике 4 и 5). На основу ових података, да бисмо даље проценили утицаје ВПЦД на ОВА-специфичан Т помоћни (Тх) ћелијски одговор, даље смо анализирали експресије цитокина у ЦД8+ и ЦД4+ Т ћелијама помоћу проточне цитометрије (слика 6) . Дана 21. након прве вакцинације, један спленоцит мишева је изолован и затим заједно култивисан са ОВА (10 уг/мЛ). Принос ИЛ-4 у ЦД4+ Т ћелијама у групи примењеној са 100 уг ОВА/ВПЦД био је значајно већи од приноса у ОВА/Алум групи и ОВА групи и сличан оном у ПМА (слика 6А). Штавише, принос ИФН-а у ЦД8+ и ЦД4+ Т ћелијама је такође значајно повећан код мишева којима је даван ОВА/ВПЦД (20, 100 и 400 уг) (Слике 6Б и 6Ц). У поређењу са алум адјувансом, ВПЦД је показао бољу способност индуковања лучења ИЛ-4 и ИФН-а из Т ћелија.

ВПЦД-стимулисано сазревање ДЦ-а и смањена Трег фреквенција ин виво ДЦ-ови су препознати као најмоћнији АПЦ-ови укључени у иницирање примарних имуних одговора. Дакле, трећег дана након прве вакцинације, такође смо истраживали ефекте ВПЦД на ЦД40 и ЦД80 на ДЦ у слезини код мишева (Слике 7А и 7Б). Мишеви у групи 100-уг ОВА/ВПЦД произвели су значајно више нивое ЦД40 и ЦД80 на ДЦ од оних у групи ОВА/Алум. Ови подаци су показали да ВПЦД може активирати ДЦ и индуковати сазревање ДЦ код мишева. Трег ћелије могу уравнотежити толеранцију и имуне одговоре. Да би се даље истражило како је ВПЦД модулирао имуни одговор, Трег ћелије у слезини код мишева су обојене помоћу комплета за бојење Т ћелија регулатора миша. 21. дана након прве вакцинације, примећена је смањена учесталост ЦД25+ Фокп3+ Трег ћелија у укупним ЦД4+ Т ћелијама (слика 7Ц). У поређењу са групама ОВА и ОВА/Алум, ВПЦД група је показала значајно смањену Трег фреквенцију.

Процена безбедности ВПЦД код мишева

Да бисмо проценили оралну акутну токсичност, извршили смо тест акутне токсичности. Мишеви који су орално давани са 5000 мг/кг телесне тежине нису показали абнормално понашање или нежељене ефекте и није пронађен смртност у тесту за процену токсичности. Није забележена значајна разлика у повећању телесне тежине, индексу тимуса и индексу слезине међу различитим групама мишева којима су даване различите дозе ВПЦД и није било значајне разлике (Табела 1). Није забележен морталитет после 14 дана. Према томе, вредност ЛД50 ВПЦД је била више од 5000 мг по кг телесне тежине.

Да би се тестирало да ли је ВПЦД имао негативне ефекте на раст мишева, пре и после поткожне вакцинације, телесна тежина је одређена за сваког миша (Табела 2). У накнадном посматрању мишева, нежељени ефекти или абнормално понашање нису примећени. Осим тога, телесна тежина мишева којима је даван ВПЦД и мишева којима је даван физиолошки раствор или ОВА/Алум није показала значајну разлику. Ови резултати посматрања су показали да је примена ВПЦД-а била безбедна.

Дискусија

Адјуванси су кључне компоненте у вакцинама [31]. Због напретка у геномици и протеомици, идентификује се све више рекомбинантних и синтетичких молекула вакцине. Због тога је потребно више помоћних средстава и формулација. Неки моћни адјуванси су генерално повезани са повећаном токсичношћу, на пример, ФЦА. Због тога је неопходно пронаћи сигурну формулацију која садржи различите синергистичке компоненте које ће на крају довести до жељеног имунолошког одговора.Полисахариди из кинеских биљака су нетоксичнии не показују значајне нежељене ефекте [32,28]. За одређену вакцину потребан је безбедан адјуванс.

Цистанцхе десертицола је важна тоник биљка и широко постоји у сушним земљама и топлим пустињама на северозападу Кине. Цистанцхе десертицола је широко забринута због својих биоактивности укључујући имуномодулаторно, антиоксидативно, антибактеријско и антитуморско дејство [20,21]. Одређени напредак је постигнут у структурној карактеризацији и имунолошкој активности Цистанцхе десертицола, која је добар кандидат за развој адјуванса. Експериментално смо проценили адјувантне ефекте и механизам ВПЦД ин витро и ин виво. Субкутана примена ВПЦД значајно је унапредила хуморалне и ћелијске имуне одговоре повећањем серумских антитела и пролиферације лимфоцита, повећањем експресије цитокина, повећањем регулације ДЦ сазревања и смањењем учесталости ЦД4+ ЦД{{5} } Фокп3+ Трег ћелије.

ДЦ-и су кључни АПЦ-и за примање наивних Т ћелија. Активација ДЦ је важна за адјуванте. ДЦ, посебно ДЦ добијени из мишје сржи, често се користе за процену адјуванса и вакцина. Проточна цитометрија може разликовати ћелије које су активиране након хватања антигена из околних ћелија. У ФЦМ анализи, степен агрегације стимулисаних

ћелије је индиректан индикатор процене безбедности имуномодулатора [3]. Дакле, подаци о активности ВПЦД адјуванса у ДЦ ин витро могу пружити драгоцене информације за животињске моделе. На основу БМ-ДЦ модела, нивои експресије МХЦ-ИИ, ЦД86, ЦД80 и ЦД40, производња цитокина и алогена пролиферација Т ћелија су детектовани у оптималном опсегу концентрација ВПЦД. Нивои експресије МХЦ-ИИ, ЦД86, ЦД80 и ЦД40 су повећани у БМ-ДЦ, а приноси ТНФ-а и ИЛ-12 су повећани на начин који зависи од дозе. Уочена је алогена пролиферација Т ћелија. Морфологија БМ-ДЦ није промењена. Индукцијом активације БМ-ДЦ и секреције инфламаторних цитокина ин витро, ВПЦД адјуванс може значајно повећати количину антигена и број АПЦ и стимулисати Т ћелије да луче ИФН-, што доприноси побољшању имуномодулаторне активности.

РазноКинески зељасти полисахаридису способни да активирају имуни систем и поседују одличне адјувантне способности кроз стимулисање сазревања ДЦ путем ТЛР4 пута [33,28]. Дакле, претпостављамо да ТЛР4 учествује у сигналном путу сазревања ДЦ-а изазваног ВПЦД. Као што се очекивало, третмани ТЛР4 инхибиторима су довели до значајног смањења ТНФ-а и ИЛ-12. Штавише, инхибиција ТЛР4 пута је такође ометала експресију ЦД40 и ЦД80 на ДЦ, што указује да је сазревање ДЦ зависило од ТЛР4. Стога је очигледно да ТЛР4 учествује у сазревању ДЦ-а изазваног ВПЦД-ом.

ПРИРОДНИ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ ИМУНИТЕТА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%

Оптимална доза адјуванса и формулације вакцине је емпиријски одређена у многим експериментима. Да бисмо истражили однос доза-одговор ВПЦД адјуванса и ОВА антигена код мишева, одабрали смо различите дозе ВПЦД на основу претходно пријављених података из БМ-ДЦс ин витро да бисмо два пута субкутано давали ИЦР мишевима. Открили смо да је ВПЦД значајно повећао принос ОВА-специфичних антитела и индуковао уравнотежен Тх1/Тх2 имуни одговор уз повећање нивоа ИгГ1 и ИгГ2а. Нарочито је ниво ИгГ2а био виши од оног третираног Алумом у оптималној дози. Стога је ВПЦД резултирао вишим нивоима специфичних антитела и већом ефикасношћу са нижим ињекцијама.

Нове вакцине захтевају индукцију снажних ћелијских одговора, који укључују антитела, Т помоћне (Тх) ћелије и цитотоксичне Т лимфоците (ЦТЛ). Терапијска вакцина има за циљ да изазове јачи одговор Т ћелија. Идеалан адјуванс повећава снагу вакцине и промовише ћелијски посредовани имунитет без изазивања токсичних ефеката [34]. Међу запажањима на моделима имунизованих мишева, ВПЦД је довео до повећања ОВА-специфичне и неспецифичне пролиферације спленоцита у поређењу са Алумом. Неки адјуванси повећавају регулацију цитокина и имунолошког система. На пример, сапонини могу стимулисати ћелијски посредоване имуне одговоре на антиген који нормално индукује само антитела. Изабрали смо ИЛ-4 и ИФН- као индикаторе за индиректну процену нивоа имунитета код мишева. ВПЦД би могао да изазове више лучења ИЛ-4 и ИФН-а од стипсе. Стога су уочени снажни одговори Т-ћелија помагача и излучивање цитокина као резултат вакцинације ВПЦД, што сугерише да би ВПЦД могао ефикасније стимулисати лимфоците да луче цитокине типа Тх1- и цитокина типа Тх{12}} него Алум.

Адјуванси који утичу на презентацију антигена могу утицати на сложене имунолошке процесе. Трег ћелије могу да модулишу Тх1 и Тх2 одговоре [35]. Одговарајућа доза ВПЦД може подстаћи сазревање ДЦ код мишева повећањем нивоа експресије ЦД80 и ЦД40 и појачавањем способности презентације ОВА антигена у раном имунолошком одговору. Експериментални резултати активације ДЦ и Трег фреквенције показали су да је ВПЦД индуковао сазревање ДЦ и смањио Трег фреквенцију у слезини код мишева. Ови резултати су доказали да је ВПЦД побољшао ефикасност ОВА вакцина повећањем циљања ћелија које представљају антиген и промовисањем активације специфичне за Т-ћелије.

У развоју адјуванса, тешко је селективно индуковати одговарајући имуни одговор против одговарајуће инфекције. Одговарајући адјуванс треба да има ниске нежељене ефекте и токсичност за људе или животиње. Стога, треба узети у обзир безбедност ВПЦД, укључујући тренутне и дугорочне нежељене ефекте. У овој студији смо истраживали акутну токсичност ВПЦД и негативан ефекат ВПЦД на перформансе раста мишева током 110 дана. Резултати акутне токсичности ВПЦД показали су да телесна тежина, индекс тимуса или индекс слезине немају значајну разлику. Вредност ЛД50 ВПЦД била је више од 5000 мг по кг телесне тежине. Током експерименталног накнадног посматрања мишева, нису пронађени нежељени ефекти или абнормално понашање код мишева. Ови резултати су показали да је ВПЦД безбедан.

У закључку, у овој студији, ВПЦД, сирови полисахарид екстрахован из Ц. десертицола из Ксињианга, показао је нека својства адјуванса. На пример, ВПЦД је побољшао и Тх1 и Тх2 одговоре активирањем ДЦ, повећањем одговора антитела и побољшањем производње цитокина. Штавише, истражили смо механизам ефикасности ВПЦД анализом сазревања и функционисања ДЦ-а путем ТЛР4 пута ин витро. Код мишева третираних само са ВПЦД, није примећен очигледан нежељени ефекат. Дакле, ВПЦД је поседовао већу имуностимулаторну активност у ћелијским и хуморалним имуним одговорима. Адјуванси су мешавина неколико једињења. Мешавина неколико сирових екстраката може имати веће корисне ефекте од једног екстракта биљке. Неопходно је систематски истраживати ВПЦД екстракте, тестирати њихову ефикасност и безбедност и разјаснити механизме њиховог деловања.

ПРИРОДНИ ЦИСТАНЦХЕ ТУБУЛОСА ЗА ПОБОЉШАЊЕ ИМУНИТЕТА ПХГС75% ЕЦХ 30% АЦТ 12%