Ин Силицо анализа пептида отрова паразитоида дрозофиле открива преваленцију мотива катион-полар-катион клипа у протеинима чворова, део 1

Апстрактан:

Као опсте паразитоидне осе, Лептопилина хетероатом је веома успешан на многим врстама воћних мушица рода Дросопхила. Паразитоиди у свом отрову производе специјализоване мулти-стратешке структуре налик екстрацелуларним везикулама (ЕВ). Протеомска анализа идентификовала је неколико протеина повезаних са имунитетом, укључујући чворни пептид, ЛхКНОТ, који садржи структурно конзервирани инхибитор цистеин чвора (ИЦК), који је присутан у протеинима из различитих таксона. Наша структурна анализа и анализа пристајања ЛхКНОТ-овог 36-остатка језгра чворова набора открила је да поред самог мотива чвора, он такође поседује Катион–Полар–Цатион (ЦПЦ) клип.

Инхибитор цистеин је природна супстанца која се користи за спречавање оксидативног оштећења и подстицање раста ћелија. За имунитет, улога цистеина се углавном огледа у побољшању имунитета организма и спречавању упала и инфекција.

Последњих година све више студија показује да цистеин може играти важну улогу у имунолошком систему. Може промовисати пролиферацију имуних ћелија, повећати отпорност тела на патогене и смањити ризик од инфекције. Поред тога, цистеин такође може да смањи производњу слободних радикала и побољша опште здравље имуног система, чиме се повећава имунитет тела.

Иако је ефекат цистеина на имунитет веома значајан, када се користи инхибитор цистеина, треба га користити са опрезом. Пошто се инхибитор цистеин обично користи за лечење одређених болести, као што су кардиоваскуларне болести, артритис, итд., Ако се злоупотреби, утиче на имунитет и изазива слабљење имунолошког система тела, чиме се повећава ризик од инфекције.

У закључку, постоји нераскидива веза између инхибитора цистеина и имунитета. Иако инхибитори цистеина могу унапредити здравље тела, они се такође морају користити под надзором лекара, а треба обратити пажњу на одржавање разумне дозе за одржавање здравља тела. Види се да треба побољшати имунитет. Цистанцхе може значајно да побољша имунитет, јер месни пепео садржи разне биолошки активне састојке, као што су полисахариди, две печурке, Хуанг Ли итд. Ови састојци могу стимулисати различите имунолошке системе. ћелије сличне ћелији, повећавајући њихову имунолошку активност.

Кликните на здравствене предности цистанцхеа

Сматра се да мотив ЦПЦ клипа олакшава антимикробну активност у протеинима који везују хепарин. Изненађујуће, већина тестираних ИЦК-ова такође поседује мотив ЦПЦ клипа, укључујући 75 веродостојних биљних и артроподних протеина чворова који деле високу секвенцу и/или структурну сличност са ЛхКНОТ-ом. Попут ЛхКНОТ и ових других протеина од 75 чворова, чак и Дросопхила Дросомицин антифунгални пептид, канонски циљни ген имуног пута муве ТоллНФ-каппа Б, садржи овај мотив ЦПЦ клипа. Заједно, наши резултати сугеришу могућу одбрамбену функцију за паразитоидни ЛхКНОТ.

Преваленција мотива ЦПЦ клипа, својственог цистеинском чвору унутар протеина чворова који су овде испитани, сугерише да је резултујућа 3Д топологија важна за њихове биохемијске функције. ЦПЦ клип је вероватно високо очуван структурни мотив који се налази у многим различитим протеинима са пријављеним капацитетом везивања хепарина, укључујући амилоидне протеине. Кноттинс су мете за развој терапеутских лекова, а увид у њихове односе структуре и функције ће унапредити дизајн новог лека.

Кључне речи:

Домаћин–паразит; Дросопхила; Лептопилина; цистеински чвор; кноттин фолд; Катион–Полар–Цатион клип; антимикробни пептид; мотив који везује хепарин; мини протеини.

1. Представљање

У интеракцијама домаћин-паразит, паразит мора да обезбеди нападни притисак док истовремено одржава домаћина у животу да би одржао одрживо потомство [1,2]. Такви супротстављени циљеви довели су до еволуције фактора вируленције са различитим молекуларним стратегијама уз одржавање високе специфичности домаћина. Паразитски Хименоптера чине више од милион врста, свеприсутни су на планети и паразитирају на разним чланконошцима, углавном на инсектима [3].

Осе које нападају домаћине инсеката развиле су низ бихејвиоралних и биохемијских стратегија за успех и остају под сталним коеволуционим притиском са својим домаћинима [4–7].

Лептопилина/Дросопхила систем је модел у настајању за разумевање молекуларних основа одговора против оса и стратегија вируленције оса [8]. Да би сузбиле имунитет домаћина, женке Лептопилине уводе факторе отрова у своје ларве домаћине током овипозиције [4,9,10]. Добро дефинисани урођени имуни механизми Дросопхиле [11–13] пружају драгоцен контекст за проучавање ефеката ових фактора отрова оса.

Инфекција од стране специјалисте Л. боуларди активира хуморалне и ћелијске имуне руке контролисане очуваним Толл-НФ-κБ сигналним путем муве. Експресија антимикробних пептидних (АМП) гена као што је дрозомицин се активира након инфекције Л. боуларди [14]. Толл-НФ-κБ сигнализација такође контролише поделу и развој крвних ћелија [15,16], кораке који контролишу инкапсулацију и смрт јаја оса [17,18].

Насупрот томе, инфекција генералистичком Л. хетероатомом потискује оба имунолошка пута [9,14], а скоро све крвне ћелије ларве су уништене факторима у отрову оса [19,20].

У овој студији анализирамо теоријску структуру пептида Л. хетероатома, названог ЛхКНОТ, идентификованог унутар секрета сличних органели у отрову Л. хетероатома, али не и у отрову Л. боуларди [21]. Ове имуносупресивне органеле укључују више од 350 протеина и поседују протеомски профил еукариотских микровезикула и мноштво протеина повезаних са имунитетом [21–23].

ЛхКНОТ усваја мотив "Инхибитор Цистеине Кнот" (кноттин) [24]. Мотив чвора је широко очуван у низу таксона, од биљака [25,26] до пужева [27]. Ови мали пептиди (<60 residues) are functionally diverse. Knottins are used offensively, in spider toxins [28] and cone snail venom [27], as well as defensively, e.g., in wound healing activities of cacti [26], and antimicrobial host defense in plants [25,26,29] and invertebrates [30].

Широк распон активности чвора приписује се укупној структури његовог набора, који се ослања искључиво на очувани мотив од шест остатака цистеина који користи јединствену способност ових цистеина да формирају дисулфидне мостове. Мотив чвора се јавља када се уоче остаци цистеина у Ц1-Ц2-Ц3-Ц4-Ц5-Ц6 обрасцу (где „-“ представља неколико веома променљиви остаци).

Дисулфидни мостови се затим формирају на сличан начин очувања (Ц1-Ц4, Ц2-Ц5 и Ц3-Ц6), што резултира Ц1-Ц4 и Ц{{ 8}}Ц5 формира макроциклус, док се Ц3-Ц6 јавља у оквиру овог макроциклуса, што резултира „чворованом“ топологијом. Како ова чворна топологија у великој мери зависи од очувања шест цистеинских остатака, мотив чвора омогућава значајне варијације у укупној секвенци [30]. Комбинација њихове мале величине, високе толеранције варијансе секвенце и уочене структурне стабилности учинила је чворове популарном скелом за дизајн лекова [30], потенцијално чак и за лечење рака [31].

Различите линије експерименталних доказа демонстрирају или сугеришу антимикробне способности за различите чворове [25,26,29,30,32,33] или интеракције затворених јонских канала [28,34], иако молекуларни механизми помоћу којих се ове функције спроводе нису добро разумео. Штавише, није познато да ли ове антимикробне функције деле заједнички механизам деловања.

С обзиром на његово откриће из имуносупресивних честица паразита мува, наши циљеви су били да (а) идентификујемо секвенце повезане са ЛхКНОТ-ом из различитих организама, укључујући Л. хетероатом, Л. боуларди и Ганаспис паразитоиде, који нападају Дросопхила и (б) идентификују било које нови структурни мотив(и) присутни у познатим или новим ЛхКНОТ хомолозима са надом да би предвиђање таквог очуваног мотива могло предложити могуће функције за ЛхКНОТ и водити будућа експериментална истраживања.

Показали смо да теоријски модел ЛхКНОТ-а поседује обележја чворног набора са три антипаралелна бета листа, ограничена дисулфидним мостовима. Модел ЛхКНОТ садржи ЦПЦ клип, способан за интеракцију са хепарином, негативно наелектрисаним гликозаминогликаном (ГАГ) од значајне медицинске вредности. ЛхКНОТ такође има потенцијал за интеракцију са другим ГАГ-овима, као што су кератан сулфат (ГАГ који је високо сулфатисан, сличан хепарину) и хијалуронска киселина (једини ГАГ представник који не захтева сулфатизацију) [35].

Штавише, структурни хомолози ЛхКНОТ-а (тј. веродостојни протеини мотива чворова) такође поседују мотив ЦПЦ клипа који се може спојити са хепарином. Изненађујуће, као и ЛхКНОТ и ови други верни протеини чворова, чак и Дросопхила Дросомицин антифунгални пептид дели овај мотив ЦПЦ клипа у својој структури. Овај мотив је такође идентификован у 41 од 46 додатних ЛхКНОТ хомолога из Л. хетероатом, Л. боуларди и Ганаспис спп. осе успешно на Д. меланогастер.

Ова запажања заснована на силикону сугеришу да мотив ЦПЦ клипа, својствен многим чворовима, може да обезбеди структурну основу за модификацију функција имунитета или вируленције. Нагађамо о могућој антимикробној функцији или функцији везаној за вируленцију за ЛхКНОТ оса. Обиље набора чвора и његова подударност са мотивом ЦПЦ клипа у већини новоидентификованих пептида чвора из три паразитоида Дросопхила сугерише важну улогу коју тек треба да се утврди у паразитоидној физиологији и/или у домаћин-паразиту. интеракције.

2. Резултати
2.1. ЛхКНОТ секвенца показује сличност са антимикробним пептидима од инсеката и биљака

БЛАСТп претрага база података нр и ТСА користећи ЛхКНОТ секвенцу пуне дужине (60 аминокиселина) показала је ограничен број значајних погодака, првенствено означених као "антимикробни пептиди", од биљака и инсеката. Такође је идентификовано неколико гљивичних секвенци. Сви резултати су показали мање од 60 процената идентитета аминокиселина са ЛхКНОТ-ом. Најбољи погодак за ЛхКНОТ у бази података нр био је антимикробни пептид из обичне бубе, Цаллособруцхус мацулатес, док је најбољи погодак у бази података ТСА био антимикробни пептид из пшеничне гриње Ацериа Цоацхелла.

Конзервација је била најистакнутија у региону јединог мотива секвенце повезаног са ЛхКНОТ, цистеинским чворним потписом 'антифунгалног пептида' (пфам11410 домен, Е=2.8 × 10-3). Након покретања ПСИ-БЛАСТ-а за детекцију удаљених хомолога, откривене су додатне секвенце. ПСИ-БЛАСТ је показао сличне резултате са обичном биљком леда, Месембриантхемум цристаллинум; црвене гриње, Динотхромбиум тинцториум; паразитоидна оса, Трицхограмма претиосум; клик буба, Игнелатер светлећи; паразитоидна оса, Трицхограмма брассицае; обична поленова буба, Брассицогетхес аенеус; јасеновац, Агрилус планипеннис; и тестер, Неодиприон лецонтеи.

Користећи ХММЕР веб сервер вођен Хидден Марков Моделс као алтернативну методу откривања удаљених хомолога, идентификовали смо пет гљивичних погодака из Акантхомицес лецании, Цордицепс јаваница, Цордицепс цонфрагоса, Роселлиниа нецатрик и Беаувериа бассиана.

Претрагом ПДБ-а за сличне секвенце добијена су само два значајна резултата, један за антифунгални пептид типа чвора Ало-3 из инсеката Ацроцинус лонгиманус и други из пептида за зарастање рана ограниченог дисулфидом пБ1 из Перескиа блео. Детаљи свих блиских и удаљених хомолога идентификованих коришћењем различитих приступа сличности секвенци су сажети у Додатној табели С1.

Поравнање ЛхКНОТ-а са познатим структурама типичних чворова, као и идентификованим хомолозима, показало је очување шест цистеина који формирају три дисулфидна моста у ЛхКНОТ-у (Слика 1А). На свом Н-терминусу, ЛхКНОТ садржи дуг, спирални сегмент за који се предвиђа да ће функционисати као сигнална секвенца; интерно, садржи три бета листа, као што се очекује од секундарне структуре пептида чворова (слика 1Б).

Поред тога, процена сличности секвенци ЛхКНОТ-а усмерена је на доступне транскрипте Л. хетероатома и Л. боуларди и са другог паразитоида Дросопхила, Ганаспис спп. (види Методе), открили су обиље повезаних секвенци. За Л. хетеротом (Лх14), идентификовали смо 16 додатних Лх14 протеина чворова (додатна табела С2).
За Л. боуларди идентификовали смо 22 протеина чворова (додатна табела С3). Шест ЛхКНОТ хомолога је на сличан начин идентификовано из Ганаспис хоокери (Г1) и два ЛхКНОТ хомолога су пронађена у предвиђањима протеина направљеним из генома Г. брасилиенсис (ВА) (додатна табела С4). Слика 2 приказује очување ових паразитоидних чворних секвенци са ЛхКНОТ. Дакле, изгледа да бар неколико паразитоида Дросопхила узоркованих у овој студији кодира више протеина чворова. Ове осе могу кодирати додатне такве чворасте пептиде, а потребни су систематски протеомски/биоинформатички приступи да би се добила свеобухватна листа. Функције ових наводних чворова у физиологији паразита остају непознате.

Слика 1. (А) Вишеструко поравнање секвенци ЛхКНОТ (горе) и хомолога у породици чворова (од врха до дна): Месембриантхемум цристаллинум (биљка; антимикробно; НЦБИ ИД: ААЦ19399), Ацериа тосицхелла (гриња; антимикробно; НЦБИ ИД :МДЕ48292.1), Цаллособруцхус мацулатус (буба; непознато; НЦБИ ИД:ВЕН35376.1), Динотхромбиум тинцториум (гриња; непознато; НЦБИ ИД:РВС16713.1), Трицхограмма претиосум (Ало{{1}{23}} попут; паразитоидна оса; антимикробно; НЦБИ ИД: КСП_014233229.1), Игнелатер луминосус (буба; непознато; НЦБИ ИД: КАФ2884324.1), Трицхограмма брассицае (паразитоидна оса; непознато; НЦБИ ИД: ЦАБ{{27 }}{{30}}31014.1), Брассицогетхес аенеус (буба; непознато; НЦБИ ИД: ЦАХ0563829.1), Агрилус планипеннис (пепео бушилица; антимикробно; НЦБИ ИД : КСП_018321119.1), Неодиприон лецонтеи (мушица; непознато; НЦБИ ИД: КСП_015517007.2), Акантхомицес лецании (гљивица; антифунгални; Унипрот ИД: А0А168Ц5Л6), Цордицепс јаваница (гљивица; антифунгални Унипрот ИД: А0А545ВВУ1), Цордицепс цонфрагоса (гљива; непознато; Унипрот ИД: А0А179ИЈТ7), Роселлиниа нецатрик (гљива; непознат; Унипрот ИД: А0А1С8А723), Беаувериа бассиана (гљивица; непознато; Унипрот ИД: А0А0А2ВУФ6), Ацроцинус лонгиманус (Ало-3; буба; антигљивично; ПДБ ИД: 1К3Ј) и Перескиа; ИД блео (цлуспБ1); 5КСБД). Идентични остаци су означени црвеном бојом, док су хемијски слични остаци означени жутом бојом. Црне стрелице означавају очуване остатке цистеина који су одговорни за структурни набор чвора, а повезаност дисулфидног моста три дисулфидна моста је означена неонско зеленим бројевима.

Кс и КСКС означавају променљиви број остатака на Н- и Ц-крају, респективно. Елементи секундарне структуре моделованог ЛхКНОТ-а приказани су на врху. и Т представљају -ланац, и -окрет, респективно. (Б) Предвиђање секундарне структуре за ЛхКНОТ, које приказује дугачки спирални сегмент (ружичасти цилиндар; сигнални пептид) праћен са три бета ланца (жуте стрелице). Ова секундарна структура прати канонски Кнотинов потпис [36]. (Ц) Прототип структурног набора чвора из базе података КНОТТИН [36] (дозвола за репродукцију ове слике дала је др. Јеан-Цхристопхе Гелли, ИНСЕРМ, октобар 2019.). Два дисулфидна моста (зелени) формирају макроциклус, док се трећи (плави) провлачи кроз центар дајући протеину његову истоимену чворну топологију. (Д) Предвиђена терцијарна структура ЛхКНОТ-а, која показује топологију чворова и очуван мотив цистеина, остаци цистеина формирају дисулфидне мостове у очуваном узорку који се види у целој породици чворова (Ц1 -Ц4 и Ц2 -Ц5 облик макро-циклус, Ц3 -Ц6 вуче кроз центар).

Слика 2. (А) Вишеструко поравнање секвенци ЛхКНОТ (горе) и хомолога у Лх14. (Б) Вишеструко поравнање секвенци ЛхКНОТ (горе) и хомолога у Л. боуларди. Кс означен у зеленом пољу одговара следећим уметањима у две Лб17 секвенце: Лб: ГИСКС01151661.1 Кс=СКАПППТПЕПФХППГТПП; Лб: ГИСКС01151653.1 Кс=СКЛТСПРСТФППТГСТИПСИИТТ. (Ц) Вишеструко поравнање секвенци ЛхКНОТ (горе) и хомолога у Ганаспис спп. Идентични остаци су означени црвеном бојом, док су хемијски слични остаци означени жутом бојом.

Црне стрелице означавају очуване остатке цистеина који су одговорни за структурни набор чвора, а повезаност дисулфидног моста три дисулфидна моста је означена неонско зеленим бројевима. Елементи секундарне структуре моделованог ЛхКНОТ-а приказани су на врху. и Т представљају -ланац, и -окрет, респективно. Сиве звезде се додају на врх блокова секвенци, горњи остаци представљају остатке моделоване са алтернативним конформацијама.

2.2. Тродимензионална структура ЛхКНОТ-а

Типичан структурни набор пептида чворова дефинисан је са шест цистеина укључених у три дисулфидне везе да би се формирао троланчани антипаралелни бета-лим са цистеинским чвором [25]. Важна карактеристика овог набора је повезаност цистеинских остатака да формирају дисулфидне мостове и дисулфидни мост цистеина 3 и 6 који пролази кроз дисулфиде 1–4 и 2–5 да би направио посебан дисулфид кроз дисулфидни чвор (Слика 1А, Ц ).

Овај дисулфид, кроз карактеристику дисулфидног чвора, разликује чворни набор од других протеина цистеинских чворова. Осим конзервираних цистеина, остатак аминокиселинске секвенце може бити прилично варијабилан, и стога је само ограничен број чворова идентификован приступима сличности секвенци за ЛхКНОТ (погледајте претходни одељак и додатну табелу С1).

Алгоритми за препознавање преклопа и приступи моделирању засновани на шаблонима, с друге стране, пронашли су неколико различитих чворова као погодне кандидате за моделирање ЛхКНОТ-а. Међу различитим генерисаним моделима ЛхКНОТ, најбољи модел је био модел ЛхКНОТ заснован на више шаблона креиран коришћењем програма ХХпред [37] са структурним ограничењима изведеним из прва три шаблона, Ало-3 (ПДБ: 1К3Ј) [ 30], омега-агатоксин-ИВА (ПДБ: 1ИВА) [28] и ПАФП-С (ПДБ: 1ДКЦ) [25]. Енергетски профили засновани на знању израчунати коришћењем ПроСА-веб [38] за овај одабрани модел показали су ниске енергије и з-скор од −4,53, што је упоредиво са решеним структурама.

Верифи3Д [39] је оценио овај модел заснован на више шаблона пролазним резултатом (100.00 проценат остатака у моделу имају просечни 3Д-1 Д резултат већи или једнак 0,2). ВороМКА [40] резултат од 0,325 је вероватно одраз мале величине пептида, а резултати шаблона су били у истом опсегу (додатна слика С1).

Овај модел заснован на више шаблона типизира чворни набор са три антипаралелна бета-ланца, ограничена дисулфидним мостовима и очекиваном везом дисулфидних мостова (слика 1Д). КНОТЕР3Д, алат у бази података КНОТТИН [36], потврдио је да овај модел има веродостојан чворни набор и потврдио претходно идентификовани образац дисулфидног везивања на слици 1Д.

2.3. ЛхКНОТ показује присуство ЦПЦ клипа, способног за интеракцију са хепарином и другим ГАГ-овима

У потрази за потенцијалним ЛхКНОТ функцијама, истраживане су корелације структуре и функције блиских структурних хомолога ЛхКНОТ. Кноттин протеин из кактуса Перескиа блео (ПДБ: 5КСБД) [26] поседује мотив који везује хепарин познат као ЦПЦ клип. Овај структурни мотив формира геометријски ограничен клип од два катјонска и једног поларног остатка који ступају у интеракцију са хепарином помоћу мостова соли и водоничних веза које га стежу на месту унутар позитивно наелектрисане површине клипа [41].

Структурна суперпозиција чвора кактуса и ЛхКНОТ-а показала је да су ове две структуре веома сличне, са укупном разликом мањом од 2А. Анализа спајања ЛхКНОТ-а са хепарином, користећи ЦлусПро специфичне параметре за хепарин као лиганд, открила је да се за ЛхКНОТ поларне интеракције које одговарају мотиву ЦПЦ клипа јављају у остацима Р1-С3-Р14 (слика 3А) .

Измерена растојања (и између алфа-угљеника и центара масе бочних ланаца остатака) разликовала су се од оних код ЦПЦ клипа за мање од 1 А, што сугерише присуство наводне ЦПЦ копче у ЛхКНОТ (Слика 3Б). Површинска електростатика моделованог ЛхКНОТ-а такође је показала присуство очекиваног катионског везивног џепа формираног ЦПЦ клипом [41,42] (Слика 3Ц).

Да би се проценила способност ЦПЦ клипа да ступи у интеракцију са другим ГАГ-овима, извршена је додатна анализа спајања са ЛхКНОТ-ом и кератан сулфатом (ПДБ ИД: 1КЕС) и са ЛхКНОТ-ом и хијалуронском киселином (ПДБ ИД: 1ХИА). У оба случаја, позитивно наелектрисана везивна површина коју ствара ЦПЦ клип је везана за негативно наелектрисане молекуле. Лигплотови које је генерисао ПДБСум потврдили су повезаност ГАГ-а са остацима који формирају ЦПЦ (додатне слике С2 и С3).

2.4. Други структурни хомолози ЛхКНОТ-а такође садрже мотив ЦПЦ клипа

Присуство ЦПЦ клипа иу ЛхКНОТ-у и његовом структурном хомологу из Перескиа блео (пБ1) сугерисало је могућност ширег очувања ЦПЦ клипа унутар породице чворова. Анализа 21 блиског структурног хомолога ЛхКНОТ-а са експериментално решеним ПДБ-овима у бази података КНОТТИН открила је да, у сваком случају, пептиди поседују мотив ЦПЦ клипа. За већину пептида (нпр. Т. тридентатус), параметри мотива су одступали мање од 1 А од набора чвора језгра, док је за друге (нпр. увредљиви чворови) одступање било до границе од 3 А (додатна табела С5). Слично, моделовани протеини чворова идентификованих хомолога показали су да скоро сви поседују ЦПЦ клип.

Шеснаест додатних секвенци из Л. хетероатома, 22 секвенце из Л. боуларди и 8 секвенци из Ганаспис спп., без познатих 3Д структура, моделовано је и анализирано на присуство мотива ЦПЦ клипа. Док је 13 од 16 наводних Л. хетероатом чворова и 20 од 22 наводна Л. боуларди чворова открило мотив ЦПЦ клипа, све Ганасписове секвенце су садржале ЦПЦ клип (додатна табела С5). Занимљиво је да седам хомолога који нису показали мотив ЦПЦ клипа припадају (а) секвенци уобичајене поленове бубе (Б. аенеус (ЦАХ0563829.1), (б) секвенци гљивица Р. нецатрик (А0А1С8А723)) и (ц) три Л. хетеротома чворови 4, 5, 6 и Л. боуларди чворови 3 и 20 (Допунска табела С5).

Преглед чворова у бази података КНОТТИН, који нису повезани са ЛхКНОТ, али су репрезентативни за различите таксоне (шишарки, потковица, инсект, биљка, шкорпион и паук), показао је мотив ЦПЦ клипа. У свим случајевима, површински електростатички профил мотива ЦПЦ клипа је позитивно наелектрисан, вероватно, да би се олакшале интеракције са негативно наелектрисаним хепарином (Слика 4). Међутим, слично горе описаним чворовима буба, гљивица и оса, ЦПЦ клип није идентификован у чворовима из биљног циклотида и сунђера (додатна табела С5).

Слика 4. Резултати спајања на хепарин и површинска електростатика (А) антифунгалног пептида Пхитолацца америцана (ПФАП-с; биљка; ПДБ: 1ДКЦ), (Б) селективног омега-агатоксина калцијумских канала Агеленопсис аперта (Омега-агатоксин ИВ-А) ; паук; ПДБ: 1ИВА), (Ц) антифунгални пептид Ацроцинус лонгиманус (Ало-3; буба; ПДБ: 1К3Ј), (Д) пептид Перескиа блео за зарастање рана (пБ1; кактус; ПДБ: 5КСБД) , (Е) ЛхКНОТ, (Ф) антифунгални пептид "Дросомицин" Дросопхила спп. (Дросомицин; мува; ПДБ: 1МИН), (Г) Конотоксин ГС (Цонотокин ГС; пужеви у облику шишарки; ПДБ:1АГ7), (Х) антимикробни пептид тахистатин А изолован из ракова потковице (тахистатин А; ракови потковице; ПДБ:1ЦИКС) и (И) Хлоротоксин, мали токсин шкорпије Леиурус куинкуестриатус (Цхлоротокин; шкорпион; ПДБ:1ЦХЛ) који показује мотив катјонског ЦПЦ клипа. Слике оријентисане да најбоље приказују структуру ЦПЦ клипа. Површински електростатички потенцијали су класификовани у боји од −4 кТ/е (црвено) до плус 4 кТ/е (плаво).

2.5. Ин Силицо мутациона анализа ЛхКНОТ ЦПЦ клипа открива секундарни ЦПЦ клип

Модели три ин силицо ЛхКНОТ мутанта (Р1А, С3А, Р14А) су истраживани да би се упоредиле интеракције везивања дивљег типа и мутантних протеина. У случају мутанта Р14А, показало се да је хепарин изненађујуће повезан са секундарним ЦПЦ клипом који укључује остатке Р1, С3 и Р30 уместо мотива Р1, С3 и Р14 у дивљем типу (додатна слика С4). Двоструки или троструки мутанти (Р14А-Р1А; Р14А-С3А-Р1А), међутим, нису показали интеракцију ни са једним од примарних или секундарних остатака мотива ЦПЦ клипа (додатна слика С4Ц, Д).

Мутанти ин силицо са Р1А мутацијом (прекидајући и примарне и секундарне мотиве ЦПЦ клипа), међутим, показали су хепарин који се повезује са Р29 и Р30, јер они пружају једину преосталу катјонску површину (додатна слика С4Ц, Д). Занимљиво је да лиганд преферира да се повезује са мотивом ЦПЦ клипа, иу случају примарних и секундарних клипова, преко ове додатне катјонске површине када је мотив доступан, што сугерише да специфична интеракција ЦПЦ клипа може омогућити стабилнију асоцијацију преко неспецифична електростатичка интеракција.

For more information:1950477648nn@gmail.com