Ин Силицо дизајн промискуитетне химерне мултиепитопне вакцине против микобактерије туберкулозе, део 1

Апстрактан

Туберкулоза (ТБ) је глобална здравствена претња, убијајући око 1,5 милиона људи сваке године. Искорењивање Мицобацтериум туберцулосис, главног узрочника туберкулозе, све је изазовније због појаве екстензивних сојева отпорних на лекове. Вакцинација се сматра ефикасним начином заштите домаћина од патогена, али једина клинички одобрена ТБ вакцина, Бациллус Цалметте-Гуерин (БЦГ), има ограничену заштиту код одраслих. Утврђено је да вакцине са више епитопа повећавају имунитет на болести селективним комбиновањем епитопа из неколико кандидата за протеине.

Туберкулоза је заразна болест узрокована бактеријом Мицобацтериум туберцулосис која углавном погађа плућа, али може утицати и на друге органе. Имунитет игра важну улогу у развоју и лечењу туберкулозе.

У случају недовољног имунитета, Мицобацтериум туберцулосис може лако упасти у људско тело и развити се у туберкулозу. На пример, компромитован имуни систем од одређених болести или медицинских третмана повећава ризик од инфекције ТБ. Поред тога, фактори као што су неухрањеност, лош квалитет живота и претерани стрес такође могу ослабити имунитет, што доводи до развоја туберкулозе.

Због тога је одржавање доброг здравља и јачање имунитета веома важно за превенцију туберкулозе. Имунитет се може ојачати здравом исхраном, редовним начином живота, правилном вежбом и довољно сна, што може ефикасно смањити ризик од заразе разним болестима, укључујући туберкулозу.

Имунитет је такође важан за лечење и опоравак када се туберкулоза већ појавила. Што је имуни систем јачи, тело се ефикасније може бранити од напада бацила туберкулозе и производи довољно антитела за борбу против болести. Стога, одржавање адекватне исхране, правилно вежбање и позитиван став могу побољшати имунитет и подстаћи опоравак.

У закључку, постоји јака веза између имунитета и туберкулозе. Одржавање доброг здравља и јачање имунитета један је од важних начина за превенцију и лечење туберкулозе. Суочимо се са животом позитивно, водимо здрав начин живота и клонимо се болести. Са ове тачке гледишта, морамо побољшати свој имунитет. Цистанцхе може значајно побољшати имунитет, јер месни пепео садржи разне биолошки активне компоненте, као што су полисахариди, две печурке, Хуанг Ли итд. Ове компоненте могу да стимулишу имуни систем Различите врсте ћелија у систему, повећавају њихову имунолошку активност.

Кликните на здравствене предности цистанцхеа

Ова студија је имала за циљ да дизајнира мултиепитопну вакцину против туберкулозе користећи имуно-информатички приступ. Кроз функционално обогаћивање, идентификовали смо осам протеина које лучи М. туберцулосис који су или потребни за патогенезу, излучују се у екстрацелуларни простор или обоје. Затим смо анализирали епитопе ових протеина и одабрали 16 помоћних епитопа Т лимфоцита са активношћу која индукује интерферон, 15 епитопа цитотоксичних Т лимфоцита и 10 линеарних епитопа Бћелија, и коњуговали их са адјувансом и Пан ХЛА ДР-везујући епитоп користећи одговарајући епитоп (ПАДРЕ) линкери.

Штавише, предвидели смо терцијарну структуру ове вакцине, њену потенцијалну интеракцију са Толл-Лике Рецептор-4 (ТЛР4) и имуни одговор који би могао да изазове. Резултати су показали да ова вакцина има јак афинитет према ТЛР4, што може значајно да стимулише ЦД4 плус и ЦД8 плус ћелије да луче имуне факторе и Б лимфоците да луче имуноглобулине, како би се добио добар хуморални и ћелијски имунитет. Све у свему, предвиђало се да је овај мултиепитопски протеин стабилан, безбедан, високо антиген и високо имуноген, који има потенцијал да послужи као глобална вакцина против туберкулозе.

1. Представљање

Туберкулоза (ТБ), веома заразна болест узрокована Мицобацтериум туберцулосис, рангирана је од стране Светске здравствене организације (СЗО) као главни узрок смрти од једног инфективног агенса [1–3]. У 2021, процењени број смртних случајева од туберкулозе и нових случајева достигао је 1,6 милиона и 10,6 милиона, респективно [4]. Тренутно је клинички третман туберкулозе релативно оскудан, а углавном се користи комбинација више антимикробних лекова.
Овај циклус хемотерапије је веома дуг, обично траје девет до дванаест месеци, па чак и дуже [5], што повећава ризик од мутација отпорних на лекове код М. туберцулосис [6,7]. Последњих година, хемотерапија је постала мање ефикасна због појаве и све већег удела М. туберцулосис који је отпоран на више лекова [6]. Спречавање развоја туберкулозе може бити ефикасније од лечења. Познато је да је вакцинација ефикасан начин заштите домаћина од патогених бактерија [8].

Тренутно је Бациллус Цалметте-Гуерин (БЦГ), развијен пре више од 100 година, једина клинички одобрена вакцина против ТБ [9]. Нажалост, БЦГ штити само новорођенчад и одојчад и углавном је неефикасан против адолесцената и одраслих [2,10], иако СЗО извештава да су 89 процената случајева туберкулозе у 2021. години били одрасли [4]. Због тога постоји хитна потреба да се развије нова и ефикасна вакцина против туберкулозе, посебно за адолесценте и одрасле.

Развој вакцине против ТБ је компликован због вишеструких карактеристика микобактерија, као што су латентна инфекција, перзистентност и имунолошка евазија [11–13]. Идеална вакцина против туберкулозе треба да буде дизајнирана тако да циља протеине/путеве одговорне за ова својства код М. туберцулосис и да буде у стању да ефикасно индукује имуне одговоре посредоване ЦД4 плус и ЦД8 плус Т ћелијама [14].

Штавише, ефикасна вакцина такође треба да циља на главне комплексе хистокомпатибилности домаћина (МХЦ), који су високо полиморфни [15]. Ове карактеристике постављају веома високе захтеве за свестраност вакцине, што се очигледно не може постићи једним природним протеином. Вакцина са више епитопа, рекомбинантни протеин који се састоји од серије преклапајућих епитопа (пептида) [16], је нови тип кандидата за вакцину који може да реши горенаведена питања.

Последњих година, мултиепитопне вакцине су привукле велику пажњу због својих предности већег имунитета и мање алергености од конвенционалних вакцина [17,18]. Тренутно су дизајниране мултиепитопне вакцине против многих патогених микроорганизама, укључујући Схигелла спп. [19], вирус слинавке и шапа [20], Хелицобацтер пилори [21,22], вирус хепатитиса Б [23], Токопласма гондии [24], Леисхманиа инфантум [25], Нипах вирус [26], Онцхоцерца волвулус [27], Псеудомонас аеругиноса [28] и вирус леукозе [29].

Посебно је појава пандемије ЦОВИД-19 ојачала примену ове технологије [16,30–32]. Што се тиче туберкулозе, неколико мултиепитопних вакцина је дизајнирано да циљају инхерентно активну ТБ [33–39] и латентну ТБ [40,41]. Међу њима, три кандидата за вакцину су дизајнирана у облику ДНК [34,36,40], а два су уградила епитопе у протеинске кичме за стварање рекомбинантних вакцина [34,36].

Треба напоменути да су протеини кандидати за неке од горе наведених мултиепитопних вакцина одабрани насумично, а покривеност популације овим вакцинама захтева даље студије.

Штавише, дизајнирана су два кандидата за вакцину против туберкулозе са више епитопа са широким покривањем популације, један епитоп је изабран из имуногених егзосомских везикула протеина са патогеним својствима [39], а други се не фокусира на протеине кандидате, већ директно бира високо конзервиране и експериментално потврђене епитопи из базе података имуног епитопа (ИЕДБ) [38]. Међутим, овим протеинима кандидатима недостаје функционално обогаћивање, а способност кандидата за вакцину да индукују лучење интерферона (ИФН-) тек треба да се побољша.

Претходна студија је закључила да се рационална оптимизација епитопа може постићи комбинацијом капацитета везивања МХЦ и способности епитопа да реагује са рецепторима Т ћелија [42]. Штавише, они су предвидели да ће вакцине са епитопима који везују цитотоксичне Т лимфоците (ЦТЛ) А1, А2, А3, А24 и Б7 имати покривеност од скоро 100 процената у главним етничким групама (Црнци, Азијати, Хиспаноамериканци и Белци).

Међутим, до сада није постојао сличан приступ дизајнирању ТБ вакцине. У овој студији смо дизајнирали високо промискуитетну мултиепитопну ТБ вакцину користећи различите антигене карактеристике осам протеина обогаћених функцијама. Кандидат за химерну вакцину поседује 15 епитопа ЦТЛ, 16 епитопа помоћних Т лимфоцита (ХТЛ) са својствима индукције ИФН{4}} и 10 линеарних епитопа Б-ћелија. Имуно-информатичка анализа је показала да је овај кандидат за вакцину „свеобухватан“, што га чини потенцијалним каменом темељцем за постизање „стратегије за крај ТБ“.

2. Материјали и метода

2.1. Избор протеина и проналажење секвенце

Да бисмо конструисали мултиепитопну вакцину против туберкулозе, прво смо одабрали протеине комплекса М. туберцулосис, који су депоновани у ИЕДБ базу података [43] и потврђени су као епитопи МХЦ класе И и ИИ који се везују. Аминокиселинске секвенце (примарна структура) протеина соја М. туберцулосис Х37Рв добијене су из УниПрот базе података [44]. Предвиђања потенцијалних антигена независна од поравнања заснована на физичко-хемијским својствима добијена су са сервера ВакиЈен 2.0 [45], који је прошао аутоматску и унакрсну коваријансну (АЦЦ) трансформацију протеинских секвенци у униформан вектор главне аминокиселине својства, са прагом антигености постављеним на 0.4 за сваки бактеријски протеин [45,46].

Функционална анотација протеина је процењена коришћењем базе података за анотацију, визуелизацију и интегрисано откриће (ДАВИД) 6.8 [47]. Секретирани протеини су додатно обогаћени коришћењем две категорије: екстрацелуларни простор и патогенеза кроз ДАВИД и БиоЦиц [48] базе података, респективно. Протеом Хомо сапиенса ГРЦх38.п13 преузет је у ФАСТА формату из базе података Националног центра за биотехнолошке информације (НЦБИ) [49]. БЛАСТп је коришћен за предвиђање хомологије (Е-вредност =1е-5) између излучених протеина и протеина Х. сапиенса.

2.2. Предвиђање епитопа Т-ћелија

Предвиђање и селекција епитопа су кључни кораци у изградњи мултиепитопних вакцина. МХЦ И молекули везују кратке пептиде (9–11 аминокиселина) јер је пукотина за везивање пептида молекула МХЦ И која се састоји од једног ланца затворена [50]. Слободно доступан НетМХЦпан-4.1 [51] је коришћен за предвиђање ЦТЛ епитопа, који користи ННАлигн_МА да генерише процентуалне рангове (процентуални ранг) на основу комбинације афинитета везивања МХЦ И и елуираних лиганда .

„Проценат рангирања“ секвенце упита је одређен упоређивањем њеног резултата предвиђања са дистрибуцијом резултата предвиђања за релевантни МХЦ израчунат коришћењем скупа насумично одабраних природних пептида. Епитопи са процентом рангирања < 0.5 процената сматрани су јаким везивним средствима, док су епитопи са процентом рангирања < 2 процента сматрани слабим везивним средствима [51].

Иако се на серверу може предвидети до 12 супертипова епитопа МХЦ класе И, користили смо само А1, А2, А3, А24 и Б7 јер ових пет супертипова покривају 100 процената главних људских раса [42] . Одабрали смо јака везива и предвидели њихову антигеност користећи ВакиЈен2.0 [45], а затим смо предвидели имуногеност класе И користећи Међународну базу података епитопа (ИЕДБ) [52], која користи 3-унакрсну валидацију.

Коначно, поређали смо епитопе који су били и антигени и имуногени према рангирању у процентима и одабрали 15 епитопа са ниским резултатом, три за сваки супертип и најмање један за сваки кандидат за протеин, осим за протеин кандидата који није могао имати јак епитоп који се везује за ЦТЛ. то је антигена и имуногена. Коначно, вредности ИЦ50 за сваки ЦТЛ епитоп су предвиђене из НетМХЦ-4.0 [53].
Молекули МХЦ класе ИИ се везују за антигене пептиде, а настали комплекс може да се препозна помоћу ХТЛ. Типично, антигени пептиди имају дужину од 12 до 20 аминокиселинских остатака, али се често примећују пептиди дужине између 13 и 16 [54].

{{0}}мери су били најзаступљенији епитопи МХЦ ИИ за М. туберцулосис и депоновани су у ИЕДБ. Као резултат тога, користили смо НетМХЦИИпан-4.0 [51,55] да предвидимо везивање 15-мер пептида за хумани леукоцитни антиген-ДР (ХЛА-ДР), ХЛАДК, ХЛА-ДП, и Х-2–1 алел. Предвиђање је такође засновано на ННАлигн_МА са процентуалним рангирањем од < 2 процента и < 10 процената који се сматрају јаким и слабим везивним средством, респективно [51].

Такође, предвидели смо епитопе који индукују 15-мер ИФН за кандидате за протеине користећи сервер ИФНепитопе [56], који користи хибридни приступ машина за подршку векторима који омогућава виртуелни скрининг пептида/епитопа који индукује ИФН- - у пептиду библиотека која се састоји од ИФН- -индуцибилних и неиндуцибилних МХЦ ИИ везива који активирају Т-помоћне ћелије. Затим смо предвидели антигеност епитопа који индукују ИФН [45], и коначно, одабрали смо 16 најпромискуитетнијих епитопа који су се снажно везали за МХЦ-ИИ, индукујући ИФН и антигени.

Важно је напоменути да су сигнални пептиди уклоњени из протеина кандидата пре предвиђања епитопа. У овој студији, сигнални пептиди су прегледани коришћењем СигналП 5.0 [57] и ТаргетП2.0 [58].

2.3. Предвиђање линеарног епитопа Б-ћелија

Епитопи линеарних Б-ћелија (16-мерс) су предвиђени коришћењем АБЦпред [59,60] са подразумеваним прагом од 0.51. Штавише, да бисмо повећали поузданост резултата предвиђања, користили смо и БепиПред 2.0 [61] за предвиђање линеарних епитопа Б-ћелија. Епитопи добијени из ова два софтвера су даље подвргнути предвиђању антигености помоћу ВакиЈен2.0 [45]. Коначно, одабрали смо десет линеарних епитопа Б-ћелија на основу високих АБЦпред резултата и антигености, са најмање једним епитопом одабраним за сваки кандидат за протеин.

2.4. Конструкција кандидата за мултиепитопну вакцину са химерним својствима

Дизајнирана мултиепитопна вакцина садржи један ХБХА (хемаглутинин који везује хепарин) адјуванс, један Пан ХЛА ДР-везујући епитоп (ПАДРЕ), 15 ЦТЛ, 16 ХТЛ, 10 линеарних епитопа Б-ћелија и једну Хис× 6 ознаку (Сл. 3). Линкери су коришћени за спајање епитопа, спречавање производње спојних епитопа и побољшање процесије и регенерације појединачних епитопа у химерним вакцинама [62].

За израду овог кандидата за вакцину, ХБХА адјуванс (УниПрот ИД: П9ВИП9) је лоциран на Н-крају и повезан са низводним ПАДРЕ преко ЕАААК линкера. Затим су ХТЛ епитопи којима су се придружили ГПГПГ линкери повезани са ПАДРЕ. Штавише, ЦТЛ епитопи спојени ААИ линкером су повезани са ХТЛ епитопима преко ХЕИГАЕАЛЕРАГ линкера, који је такође спојио ЦТЛ епитопску јединицу са линеарним епитопима Б-ћелија повезаним помоћу КК линкера. Коначно, Хис × 6 ознака је причвршћена за Ц-терминус химерног протеина.

2.5. Антигеност, алергеност и физичко-хемијска својства

Антигеност вакцине са више епитопа и протеина са осам компоненти је предвидео ВакиЈен 2.0 сервер [45], док је алергеност ових протеина предвидео АллерТОП 2.0 сервер [ 63]. АллерТОП 2.0 користи Е-дескрипторе аминокиселина, АЦЦ трансформацију протеинских секвенци и к-најближе суседе (кНН) за класификацију алергена.

Метода је постигла 85,3 одсто тачности са 5-унакрсном провером пута. За предвиђање физичко-хемијских својстава као што су време полураспада, изоелектрична тачка, индекс нестабилности, алифатски индекс и велики просек хидропатичности (ГРАВИ) ове вакцине са више епитопа, коришћен је ЕкПАСи ПротПарам сервер [64].
Даље, растворљивост пептида вакцине са више епитопа је процењена коришћењем сервера протеинСол (ПРОСО ИИ) [65] на основу класификатора који користи суптилне разлике између добро познатих нерастворљивих протеина из ТаргетДБ и растворљивих протеина из ТаргетДБ и ПДБ [ 66]. Када се процењује коришћењем 10-преклопне унакрсне провере, постигла је тачност од 71.0 проценат (област испод РОЦ криве=0.785).

2.6. Симулација имунитета

Да би се карактерисао профил имуног одговора и имуногеност вакцине, симулације имуног система ин силицо су изведене коришћењем Ц-ИммСим сервера [67]. Ц-ИммСим предвиђа имунолошке интеракције користећи матрице за бодовање специфичне за позицију изведене из техника машинског учења за предвиђање пептида.
Истовремено симулира три одељка који представљају три одвојена анатомска региона пронађена код сисара: (и) коштану срж, где су симулиране хематопоетске матичне ћелије да би произвеле нове лимфоците и мијелоичне ћелије; (ии) тимус, где су наивне Т ћелије одабране да би се избегла аутоимуност; и (иии) лимфни орган као што су лимфни чворови.

Да бисмо ефикасно припремили и појачали вакцину, следили смо приступ [68] где су две ињекције даване у размаку од четири недеље. Сви параметри симулације су постављени на подразумеване вредности, са временским корацима постављеним на 10 и 94 (сваки временски корак је осам сати).

2.7. Предвиђање поремећеног региона

Интринзично поремећени региони (ИДР) присутни су у многим протеинима. Неуређени регион је предвиђен коришћењем ДИСОПРЕД3 [69], који користи ДИСОПРЕД2 и два друга модула заснована на машинском учењу обучена на великим ИДР-овима за идентификацију поремећених остатака. Они су тада били анно

2.8. Предвиђање секундарне и терцијарне структуре

Секундарну структуру дизајниране вакцине предвидео је ПСИПРЕД 4.{1}} сервер [70], који прво користи ПСИ-БЛАСТ да идентификује секвенце блиско повезане са протеином упита. Терцијарна структура ове вакцине је предвиђена коришћењем сервера Итеративе Тхреадинг Ассембли Рефинемент (И-ТАССЕР) [71].

Постоје четири кључна корака у ИТАССЕР моделирању; а) идентификација шаблона навоја; б) итеративна симулација склопа структуре; ц) одабир и дораду модела; и д) функционална анотација заснована на структури [72,73].

И-ТАССЕР је генерисао пет модела, који су прегледани помоћу ПроСА-веб [74], а модел са најнижим З-скором је изабран за даље усавршавање. ПроСА-веб упоређује резултате модела добијене од експериментално верификованих структура депонованих у ПДБ. Локални приказ резултата квалитета помаже да се идентификују проблематична подручја у моделу, а исти резултати су представљени коришћењем кода у боји на презентацији 3Д структуре. Ово је корисно за рано одређивање структуре и пречишћавање.

2.9. Пречишћавање терцијарне структуре

„Груби“ 3Д модел кандидата за вакцину добијен од ИТАССЕР-а је прерађен у два корака коришћењем два сервера; прво са МодРефинер-ом [75], а затим са ГалакиРефине-ом [76]. МодРефинер користи Ц трагове да утиче на конструкцију и пречишћавање протеина добијених минимизацијом енергије на атомском нивоу у два корака.

Прво, Ц трагови су коришћени за конструисање главног ланца, након чега је уследило пречишћавање ротамера бочног ланца и атома кичме користећи композитна поља силе заснована на физици и знању. ГалакиРефине користи више шаблона за генерисање поузданих структура језгра, док су непоуздане петље или терминали генерисани моделирањем заснованим на оптимизацији.

2.10. Валидација терцијарне структуре

Префињена структура кандидата за вакцину је потврђена помоћу Рамацхандран дијаграма генерисаних из база података ПРОЦХЕЦК [77] и МолПробити [78]. Рамацхандран дијаграми процењују конформацију кичме протеина дељењем аминокиселинских остатака на два региона: дозвољени и недозвољени. ПРОЦХЕЦК користи стереохемију да процени нето квалитет протеинских структура упоређујући их са рафинисаним структурама у истој резолуцији и затим представља регионе који захтевају даљу анализу.

Молпробити потврђује локалне и глобалне моделе макромолекула (протеини и нуклеинске киселине) мешавином рендгенских зрака, НМР, рачунарских и криоЕМ критеријума [79]. Снага и осетљивост за оптимизацију постављања водоника и анализа контакта свих атома се широко користе у ажурираној верзији критеријума ковалентне геометрије и торзионог угла [80].

2.11. Дисконтинуирани епитопи Б-ћелија

Дисконтинуирани епитопи Б-ћелија у структури нативног протеина су предвиђени коришћењем ЕллиПро-а [81]. ЕллиПро имплементира три алгоритма за апроксимацију облика протеина као елипсоида, израчунава индекс протрузије остатка (ПИ) и групише суседне остатке на основу њихових ПИ вредности. ЕллиПро даје сваком излазном епитопу резултат описан као просечна вредност ПИ за остатак епитопа. Елипсоид са ПИ вредношћу 0.9 састоји се од 90 процената садржаних остатака протеина, док преосталих 10 процената остатака лежи изван елипсоида. За сваки остатак епитопа, ПИ вредност се израчунава из центра масе остатка који лежи изван највећег могућег елипсоида.

2.12. Молекуларно спајање химерних протеина

Молекуларно спајање дизајниране вакцине (лиганда) са имуним рецептором Толл-Лике Рецептор-4 (ТЛР4) (ПДБ ИД: 3ФКСИ) изведено је коришћењем Патцхдоцк-а [82]. Првих 10 модела је затим побољшано коришћењем ФиреДоцк-а [83]. ПатцхДоцк замењује приказ површине Цоннолли тачкастих молекула са конкавним, конвексним и равним закрпама.

Модели су затим оцењени на основу геометријског уклапања и атомске десолватације. [82]. ФиреДоцк оптимизује конформације бочног ланца и оријентацију крутог тела и генерише излаз 3Д рафинисаног комплекса заснованог на енергији везивања [83]. Одабрали смо први модел Фиредоцк-а заснован на глобалној енергији као пристајални комплекс. Коначно, енергија везивања и садржај дисоцијације унутар комплекса за пристајање је предвиђен помоћу ПРОДИГИ сервера [84].

2.13. Симулација молекуларне динамике

Молекуларне динамичке симулације су изведене на протеинима коришћењем брзог и слободно доступног веб сервера, сервера за анализу интерних координата у нормалном режиму (иМОДС) [85], а конзистентни и оптимални резултати пристајања су добијени са ПатцхДоцк-ФиреДоцк сервера. У унутрашњим координатама, Нормал Моде Аналисис (НМА) генерише колективна кретања критична за макромолекуларну функцију. иМОДС представља механизме за истраживање ових режима као анализу вибрација, анимације покрета и морфолошке трајекторије које су спроведене готово интерактивно у различитим резолуцијама [85].

2.14. Реверзно превођење, оптимизација кодона и ин силиконско клонирање вакцине

Да би се ефикасно експримирао кандидат за вакцину у ћелијама Есцхерицхиа цоли, цДНК је генерисан ин силицо путем оптимизације кодона и обрнутог превођења помоћу Јава Цодон Адаптатион Тоол (ЈЦАТ) [86].

Оптимизација је укључивала (и) избегавање рхо-независних транскрипционих терминатора, ии) избегавање места везивања прокариотских рибозома, (иии) избегавање места цепања рестрикционих ензима НцоИ и КсхоИ, које служи као Н-терминална и Ц-терминална рестрикциона места за уметање цДНК шаблон вакцине, и (ив) само делимична оптимизација за примену мутагенезе усмерене на место. Индекс адаптације кодона (ЦАИ) и садржај ГЦ предвиђају квалитет цДНК са опал стоп кодоном (ТГА) уметнутим после Хис× 6 ознаке. Затим је оптимизовани ДНК фрагмент кандидата за химерну вакцину интегрисан у обрнути ланац пЕТ-28а( плус) помоћу алата СнапГене [87].

For more information:1950477648nn@gmail.com