Ин силицо Дизајнирање нове поливалентне мулти-подјединичне пептидне вакцине која користи унакрсни имунитет против људске висцералне и кожне лишманијазе: приступ заснован на имуноинформатици

Апстрактан

Контекст Лајшманијаза је група векторских заразних болести узрокованих преко 20 патогених врста лајшманија које су ендемичне у многим тропским и суптропским земљама. Појава сојева отпорних на лекове, нежељени нежељени ефекти лекова против лајшманије и одсуство превентивне стратегије вакцинације угрожавају осетљиву популацију. Недавно су многе групе истраживача искористиле област реверзне вакцинологије за развој вакцина, фокусирајући се углавном на изазивање имунитета против висцералне или кожне лајшманијазе.

цистанцхе тубулоса—анти-инфламаторно

МетодеОвај садашњи рад укључује преузимање дванаест експериментално валидираних лешманијалних антигенских протеинских секвенци из УниПрот базе података, након чега следи њихово профилисање антигености користећи АНТИГЕНпро и Вакијен 2.{1}} сервере. МХЦ везујући епитопи за исте су предвиђени коришћењем и НетЦТЛ 1.2 и СИФПЕИТХИ сервера, док су епитопи за Б ћелије израчунати помоћу АБЦпред и БепиПред 2.0 сервера. Прегледани епитопи са значајно вишим резултатима су коришћени за дизајнирање конструкта вакцине са одговарајућим линкерима и природним адјувансима. Секундарне и терцијарне структуре синтетичког пептида одређене су условним случајним пољима, плитким неуронским мрежама и поравнањем навоја профила профила са итеративним симулацијама склапања структуре, респективно. 3-Модел Д вакцине је валидиран путем ЦАСП10-тестираног побољшања и МолПробити веб сервера. Молекуларно спајање и симулација анализе нормалног режима на више скале су изведене да би се анализирао најбољи комплекс вакцина-ТЛР. Коначно, резултати компјутерске имунолошке симулације открили су обећавајуће ћелијске и хуморалне имуне одговоре, што сугерише да је пројектовани химерни пептид потенцијална вакцина широког спектра против висцералне и кожне лајшманијазе.

цистанцхе користи за мушкарце - јача имуни систем

Кључне речи Лајшманијаза · Реверзна вакцинологија · ТЛР · Вакцина са више епитопа · Молекуларна динамичка симулација · Моделирање хомологије

Увод

Лајшманијаза је група паразитских болести узрокованих различитим припадницима рода Леисхманиа, диморфних интрацелуларних паразитских протозоа [1]. Лајшманијаза погађа већину популација из ниског социо-економског статуса тропских и суптропских земаља широм света [2]. То је болест која се преноси векторима, а паразити се преносе уједом заражених женки пешчане мухе флеботомине (СЗО, 2019). Према последњим извештајима Светске здравствене организације, годишње се догоди 700, 000 до 1 милион нових случајева и око 26,000 до 65, 000 смрти (СЗО, 2019). У источној Африци често се јављају избијања висцералне лајшманијазе. Регион источног Медитерана чини 70% случајева кожне лајшманиозе широм света (СЗО, 2019). У 2017. години, 20.792 од 22.145 (94%) нових случајева пријављених СЗО десила су се у седам земаља: Бразилу, Етиопији, Индији, Кенији, Сомалији, Јужном Судану и Судану (СЗО, 2017). Због алармантног сценарија, мере за сузбијање и искорењивање болести треба истаћи и у нашој земљи. Лајшманијаза има различите клиничке манифестације, а постоје три примарна облика болести — висцерални (такође познат као кала-азар и најтежи облик болести), кожни (најчешћи) и мукокутани (СЗО, 2019.) . Докази о самоизлечењу у неколико случајева кожне лајшманијазе (ЦЛ) и резултујућем имунитету на поновну инфекцију указују на могући обим вакцинације као изводљивог метода за контролу лајшманијазе током периода [3]. Међутим, до данас није доступна лиценцирана вакцина против лајшманијазе код људи. Иако је неколико потенцијалних вакцина кандидата напредовало до клиничког испитивања, многе су још у раној фази истраживања и развоја [4]. Генерисање пептидних вакцина је доминантна и обећавајућа област истраживања у овој области. За разлику од целих живих или атенуираних паразита или њихових вакцина заснованих на подјединицама, синтетички пептиди имају неколико предности које укључују одсуство потенцијално штетних материјала, мању комплексност антигена, добру стабилност и ниску цену повећања [1, 5]. Развој нових вакцина захтева дубљи увид у имунологију, молекуларну биологију и хемијско инжењерство. Стога научници у свим овим областима раде руку под руку на дизајнирању и производњи безбедних, ефикасних вакцина [6]. Идеална вакцина против лајшманијазе треба да изазове дуготрајан имунитет и уравнотежен имуни одговор посредован ТХ-1 и ТХ-2- [4, 7]. Приступ заснован на имуноинформатици за дизајнирање такве нове кандидатне вакцине је новија стратегија која првенствено користи рачунарске алате за предвиђање структурно стабилне и имуногене мулти-подјединичне пептидне вакцине у кратком времену. Протеини за које је у претходним имунолошким студијама које су укључивале експерименталне животињске моделе или друге ин силико анализе били су најбољи могући кандидати за епитопе [1, 8–10]. Међу протеинима који се истражују, протеин ЛАЦК (антиген Ц-киназе активиран Леисхманиа) је високо конзервиран протеин међу врстама Леисхманиа и сматра се одрживим кандидатом за вакцину против хумане лајшманије [11]. Доказано је да је кључна мета имуног одговора код осетљивих БАЛ б/ц мишева [12]. КМП-11 (кинетопластидни мембрански протеин-11) је присутан у свим кинетопластидним протозоама и такође се сматра потенцијалним кандидатом за вакцину за који се показало да повећава нивое ИЛ-10 на мишјим моделима, што указује на његов имуногени потенцијал [13]. Лешманолизин, или ГП63, је површинска протеиназа за коју се претпоставља да је фактор вируленције укључен у директну интеракцију паразита са рецептором макрофага домаћина [14]. Такође је утврђено да мембрански протеини ЛЦР1 и ГП46 повећавају производњу ИФН-гама и стога се сматрају корисним у развоју опште вакцине против инфекција лајшманијом [5, 15]. Протеини топлотног шока (ХСП) су високо конзервирани молекули који су високо имуногени за индукцију и МХЦ-И и МХЦИИ путева адаптивног имунитета и сматра се да имају релевантну улогу у развоју вакцине против инфективне лајшманије [16]. Хидрофилни ацилирани површински протеин-Б Леисхманиа (ХАСП-Б) експримиран је само код инфективних паразита што указује на улогу у вируленцији паразита и, према томе, потенцијалног кандидата за вакцину [17]. Кинетопластидни парафагеларни штапићи (ПФР) протеини су такође од терапеутског и профилактичког значаја због њихове ограничене еволуционе дистрибуције, организације високог реда и високе имуногености [18]. Слично томе, цистеинске протеазе и протеофосфогликани такође делују као есенцијални фактори вируленције за паразите код сисара домаћина и привлачне су мете лекова за лајшманијазу [19–21]. Штавише, бета-тубулин протеин је такође раније био окарактерисан као антиген који стимулише Т ћелије из Леисхманије, иако његова ефикасност као кандидата за вакцину још није испитана [22]. Бета-тубулин Л. доновани се такође сматра потенцијалном метом лека против висцералне лајшманијазе [23]. Најзад, показало се да протеин фактора транслације еИФ5А из Л. бразилиенсис индукује хетерологну заштиту од лајшманијазе код животиња када се примењује као вакцина у комбинацији са другим рекомбинантним протеином. Повећава лучење цитокина специфичних за паразите код вакцинисаних животиња. еИФ5А протеин је такође очуван код свих еукариота [24]. Раније, Кхатоон ет ал. описао приступ заснован на имуноинформатици за дизајнирање мулти-подјединичне пептидне вакцине против висцералне лајшманијазе (ВЛ) истраживањем секреторних протеина Л. доновани [6]. Овде смо одабрали различите лајшманије антигене у различитим заразним врстама паразита. У исто време, сви ови протеини су већ идентификовани (било ин витро студијама на животињама или коришћењем компјутерских алата) да би подстакли имуни одговор, изазивајући заштитни имунитет. Одабране протеинске секвенце припадале су било којој од пет патогених врста Леисхманиа, наиме, Леисхманиа мајор, Леисхманиа Мекицана, Леисхманиа доновани, Леисхманиа цхагаси и Леисхманиа амазонс, међу којима је Л. доновани примарни паразит који изазива висцералну (В леисхманиасис), док је остали су првенствено одговорни за изазивање кожне (ЦЛ) или мукокутане лајшманијазе (МЦЛ). Разлог за избор тако различитих типова конзервираних и имуногених протеина у различитим врстама лајшманије био је да се дизајнира општа пептидна вакцина која би пружила широки спектар унакрсног имунитета против оба облика лајшманијазе (ВЛ и ЦЛ) који обично погађају људе. .

Шта ради трава цистанче—Анти-инфламаторно

материјали и методе

Селекција и проналажење секвенци антигенских протеина Леисхманиа

Комплетне аминокиселинске секвенце дванаест антигенских протеина специфичних за Леисхманиа преузете су из Унипрот (Универсал Протеин Ресоурце) базе података (хттпс://ввв.унипр от.орг/унипрот/) у ФАСТА формату (приступљено 21.{16} }3.2022). Као што је раније речено, сви ови протеини су пријављени као имуногени, високо конзервирани и потенцијални кандидати за вакцину, као што је пронађено у претходним имунолошким студијама које су укључивале животињске моделе или рачунарске методе предвиђања у силикону. Антигеност одабраних протеина је израчуната коришћењем АНТИГЕНпро сервера (хттп://сцратцх.протеомицс.ицс.уци.еду/) који израчунава антигеност улазне протеинске секвенце коришћењем двостепеног класификатора заснованог на СВМ-у, потврђеног десетоструко приступ унакрсној валидацији [25]. Протеини су затим подвргнути анализи сигналних пептида користећи СигналП 4.1 сервер (СигналП—4.1— Сервицес—ДТУ Хеалтх Тецх) како би се направила разлика између класичних секреторних и несекреторних (трансмембранских) протеина. Овај метод укључује предвиђање места цепања и предвиђање сигналног пептида/несигналног пептида засновано на комбинацији неколико вештачких неуронских мрежа [26]. Предвиђања локализације за све протеине су затим извршена коришћењем ДеепЛоц-а (ДеепЛоц—1.0—Сервицес—ДТУ Хеалтх Тецх), алгоритма без шаблона који користи дубоке неуронске мреже за предвиђање субћелијске локализације протеина користећи само информације о секвенци, постижући добру прецизност [27]. Све функционалне протеинске секвенце, добијене са СигналП 4.1 сервера, су затим подвргнуте предвиђању присуства антигенских детерминанти (епитопа) које ће препознати Б и Т ћелијски рецептори. Ово је урађено како би се осигурало да дизајнирани конструкт вакцине садржи само имуно-доминантне епитопе Т ћелија и Б ћелија и, на тај начин, био у стању да покрене ефикасан имуни одговор који укључује и хуморалне и ћелијски посредоване путеве имунолошких механизама.

Предвиђање епитопа цитотоксичних Т лимфоцита (ЦТЛ).

Предвиђање епитопа цитотоксичног Т лимфоцита (ЦТЛ) је суштински аспект дизајнирања идеалног пептида [28]. Слободно доступан веб сервер, наиме, НетЦТЛ1.2 (хттпс://ввв.цбс.дту.дк/сервицес/НетЦТЛ), коришћен је за предвиђање ЦТЛ епитопа за све одабране протеине. Метода интегрише предвиђање везивања пептида МХЦ класе И, протеазомалног Ц терминалног цепања и ефикасности транспорта ТАП [29], што су све битне карактеристике које секвенца епитопа који се везује за ЦТЛ треба да поседује. Сервер омогућава предвиђање ЦТЛ епитопа ограничених на 12 супертипова МХЦ класе И, међу којима је само супертип А1 коришћен за ову студију. Везивање МХЦ класе И и протеазомско цепање се изводе коришћењем вештачких неуронских мрежа. Ефикасност ТАП транспорта се предвиђа коришћењем матрице тежине [29]. Секвенце са већим резултатом везивања се сматрају моћним ЦТЛ епитопима. Поред НетЦТЛ 1.2, још један јавно доступан приступ базиран на веб серверу, наиме, СИФПЕИТХИ (хттп://ввв. сифпеитхи.де/бин/МХЦСервер.длл/ЕпитопеПредицтион.хтм), такође је коришћен за предвиђање ЦТЛ епитопа из сви одабрани протеини Леисхманиа. Прогноза је заснована на објављеним мотивима и узима у обзир аминокиселине у сидреној и помоћној сидреној позицији и друге честе аминокиселине [30]. Са листе МХЦ типова обезбеђених на овом серверу, за предвиђање су изабрани ХЛА-А*01, ХЛА-А*02:01 и ХЛА-А*03. Претраживање епитопа је специфицирано за нонамер секвенце ради уједначеног поређења са резултатима које је дао НетЦТЛ 1.2 сервер. Само уобичајени епитопи из сваког протеина (ако их има), које су предвидели и НетЦТЛ 1.2 и СИФПЕИТХИ сервери са компатибилним вишим резултатима, изабрани су за коначну конструкцију вакцине.

Предвиђање епитопа помоћних Т лимфоцита (ХТЛ).

Помоћни Т лимфоцити су најважније имуне ћелије јер су потребне у свим врстама адаптивних имуних одговора. Предвиђање ХТЛ епитопа (углавном типа Тх-1), стога, постаје суштински елемент за дизајнирање ефикасне пептидне вакцине. У тренутној студији, алатка за анализу везивања МХЦ-ИИ на ИЕДБ (Иммуно Епитопе Датабас анд Аналисис) серверу (хттп://тоолс.иедб.орг/мхции/) је коришћена за предвиђање 15-мер ХТЛ-а епитопи за скуп од три људска алела, наиме, ХЛА-ДРБ1*01:01, ХЛАДРБ1*01:02 и ХЛА-ДРБ1*01:03. Људски ХЛА алели су изабрани за реалистичнију процену афинитета епитопа за везивање МХЦ-ИИ пошто је вакцина била дизајнирана против хумане лајшманијазе. Предвиђени излаз је дат у јединицама ИЦ50нМ за комбинаторну библиотеку и СММ поравнање. Дакле, мањи број указује на већи афинитет. ИЕДБ препоручена метода предвиђања је коришћена у овом приступу у којем ниско прилагођени ранг указује на погодна МХЦ-ИИ везива и стога се могу дефинисати као моћни ХТЛ епитопи.

Идентификација и селекција ХТ епитопа који индукују цитокине

Цитокини су од огромног значаја за правилно функционисање имуног система. Батерија цитокина као што су ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и интерферон могу да индукују и ЦТЛ-посредовани и хуморални имуни одговор [31]. Дакле, ХТЛ епитопи који могу покренути производњу цитокина су пожељнији за дизајнирање имуно-профилактичке вакцине. Са овим погледом, ИФНепитопе сервер (хттп://црдд.осдд.нет/рагхава/ифнепитопе/) је коришћен за идентификацију ХТЛ епитопа који имају способност индукције цитокина. ИФНепитопе је онлајн сервер за предвиђање који има за циљ да предвиди пептиде из протеинских секвенци који могу да индукују ИФН-гама ослобођен из ЦД4+ Т ћелија. Веб сервер је развијен на основу скупа података који садржи ИФН-гама-индукујућа и неиндукујућа везива МХЦ класе ИИ [32]. ХТЛ епитопи које је предвидео ИЕДБ сервер са вишим афинитетима везивања за МХЦ-ИИ (нижи прилагођени рангови) су обезбеђени као улаз за проверу њихове способности производње цитокина од стране ИФНепитопе сервера. Тако идентификовани епитопи су затим подвргнути следећем нивоу анализе од стране ИЛ4пред сервера (ИФНепитопе(ииитд.еду.ин) и такође од ИЛ10Пред сервера (хттпс://вебс.ииитд.еду.ин/рагхава/ил10пред/предицт3) .пхп) како би се осигурало да ће одабрани ХТЛ епитопи такође изазвати секрецију ИЛ-4 и ИЛ-10, респективно. Они такође разматрају позициону конзервацију аминокиселинских остатака и аминокиселински састав пептиди за прецизније предвиђање [33, 34]. ХТЛ епитопи који се везују за МХЦ-ИИ за које су сва три сервера предвиђали да ће бити позитивни одабрани су за уградњу у коначну конструкт вакцине. Ова стратегија је усвојена да би се побољшала ефикасност вакцине јер би могла да подстакне интензиван одговор који укључује широк спектар цитокина (ИФН-гама, ИЛ-4 и ИЛ-10), што доводи до убрзаног и дуготрајног имунитета.

Анализа очувања епитопа

Epitope conservation analysis becomes essential to check whether the chosen epitope(s) is conserved across different species of Leishmania proteins. Designing a subunit vaccine consisting of conserved epitopes offers a promising scope for broad-spectrum protective immunity against leishmaniasis. Conservation analysis for each of the selected CTL and HTL epitopes was done by using the IEDB "Epitope Conservation Analysis" tool available within the IEDB portal (http://tools.iedb.org/conservancy/). This tool calculates the degree of conservation of the target epitope (e) within a set of homologous protein sequences (P) as the fraction of {p} that matched the aligned e above the chosen identity level while considering that the target epitope is sequential [35]. Firstly, the corresponding source proteins from which the CTL and HTL epitopes were finally selected were subjected to a BLAST search, for which we used the Uniprot BLAST tool (https://www.uniprot.org/blast/). From the BLAST result, the aligned protein sequences (belonging to the genus Leishmania) that showed significantly high similarity with the query sequence (>40%) were selected. Such sequences were compiled to constitute an epitope-specific dataset, and the same was provided as the input set of proteins (P) to be used for conservation analysis by the tool. Next, the sequences for selected CTL and HTL epitopes were screened individually against their respective datasets that revealed the relative conservation of the epitopes across a set of related Leishmania proteins. The threshold identity level was set at>100% (подразумевано).

Дизајнирање секвенце мулти-епитопне вакцине

На основу имуноинформатичке анализе, конструисана је примарна секвенца подјединице вакцине уградњом одабраних ЦТЛ и ХТЛ епитопних секвенци. Ови епитопи су међусобно повезани помоћу ААИ и ГПГПГ линкера, респективно [28, 31]. Линкери се убацују за правилно одвајање појединачних епитопа који су потребни за ефикасно функционисање конструкта вакцине [28, 36]. Друго, додавање одговарајућег адјуванса је кључно за подјединичну вакцину да би се појачао имуни одговор [31]. Избор одговарајућег адјуванса је кључан у дизајнирању вакцина за испитивања на људима. ИЛ-12 који производе различите имуне ћелије је од суштинског значаја за развој ћелијски посредованог имунитета против лајшманијазе, а потенцијал ИЛ-12 као помоћног средства у вакцинама против лајшманијазе је пријављен на мишјим моделима [3, 37, 38]. Овај ИЛ-12 је изабран као адјуванс за дизајнирање вакцине, а његова секвенца је укључена у Н терминал конструкта вакцине коришћењем ЕААК линкера [28, 31]. Секвенца људског ИЛ-12 алфа ланца је преузета из Унипрот базе података (ввв.унипрот.орг; приступни број П29459). Коначно, добијен је конструкт пептидне вакцине који садржи адјуванс, линкер, ЦТЛ епитопе и ХТЛ епитопе (са интраепитопским ААИ и ГПГПГ линкерима) у секвенци која се креће од Н терминала до Ц терминала.

Предвиђање конформационог и линеарног епитопа Б ћелија

Хуморални имунитет подразумева синтезу и лучење специфичних антитела од стране активираних Б ћелија, што захтева присуство антигенских детерминанти које препознају рецептори Б ћелија присутних на површини Б лимфоцита. Идеална имуно-заштитна пептидна вакцина треба да има такве компоненте да би ступила у интеракцију са Б ћелијама и тиме стимулисала. Због тога су два сервера, АБЦпред и БепиПред 2.0, примењена за прецизно предвиђање епитопа Б ћелија у примарној секвенци дизајниране вакцине. АБЦпред сервер (хттпс://вебс.ииитд.еду.ин/рагхава/ абцпред/АБЦ_субмиссион.хтмл) је приступ заснован на вештачкој неуронској мрежи (АНН) који предвиђа епитопе Б ћелија у датој секвенци антигена користећи параметри фиксне дужине. Скуп података за обуку који се користи у овој методи садржи епитопе Б ћелија из базе података епитопа Б ћелија (БЦИПЕП). Сервер је у стању да предвиди епитопе са 65,93% тачности користећи рекурентну неуронску мрежу [39]. Примарна секвенца коначног конструкта вакцине је дата као улаз у обичном формату, а подразумевани параметри АБЦпред сервера, укључујући вредност прага од 0.51 са дужином прозора од 16 аминокиселинских остатака, коришћени су за предвиђање. БепиПред 2.{11}} сервер (БепиПред—2.0—Сервицес—ДТУ Хеалтх Тецх), са друге стране, предвиђа секвенцијалне епитопе Б ћелија из улазне секвенце помоћу алгоритма насумичне шуме који је обучен на епитопе и неепитопске аминокиселине одређене из кристалних структура након чега следи узастопно изглађивање предвиђања [40]. Примарна секвенца вакцине је дата у ФАСТА формату као улаз. Примена два различита сервера који предвиђају епитопе Б ћелија на основу два различита алгоритма чини предвиђање реалистичнијим. Већина антигенских детерминанти које препознају Б ћелијски рецептор и антитела су дисконтинуирана, што значи да садрже остатке аминокиселина који се налазе удаљено у примарној структури имуногена, али се доводе једна уз другу током савијања протеина [41]. Предвиђање таквих дисконтинуираних епитопа Б ћелија у валидираној терцијарној структури вакцине извршено је коришћењем ЕллиПро сервера (хттп://тоолс.иедб.орг/еллип ро/) уграђеног у ИЕДБ портал. ЕллиПро је слободно доступан веб алат који имплементира модификовани Тхронтонов метод и узима у обзир центар масе сваког остатка, а не Ц атоме. Овим се сваки од епитопа повезује са додељеним резултатом дефинисаним као ПИ (индекс избочења) усредсређен на остатке епитопа. Дисконтинуирани епитопи се одређују на основу њихових одговарајућих ПИ вредности и групишу на основу удаљености између центара масе остатака (Р). Веће вредности Р корелирају са значајнијим дисконтинуираним епитопима који се предвиђају [42]. У исто време, линеарни епитопи Б ћелија у моделу улазног протеина такође се могу предвидети и визуелизовати коришћењем ЕллиПро-а. Детекција линеарних и дисконтинуираних епитопа Б ћелија у префињеном 3Д моделу вакцине обезбеђује успешну стратегију дизајнирања вакцине.

Профилисање антигености, алергености и токсичности конструкта вакцине

Антигеност је суштински критеријум за имуно-профилактичку вакцину. Да би се осигурало да ће дизајнирани конструкт вакцине изазвати дуготрајан имуни одговор интеракцијом са рецепторима Б и Т ћелија, антигеност истих је процењена коришћењем АНТИГЕНпро и ВакиЈен 2.0 сервера. АНТИГЕНпро (хттп://сцратцх.протеомицс.ицс.уци. еду/) сервер исправно класификује 82% познатих заштитних антигена када је обучен користећи само скупове података микромрежа протеина. Тачност комбинованог скупа података је процењена на 76% десетоструким експериментима унакрсне валидације који омогућавају значајно боље препознавање антигенских пептида. Ради на двостепеној архитектури, укључујући СВМ-базирани другостепени класификатор. За нову улазну протеинску секвенцу, вероватноћа израчуната помоћу СВМ предиктора друге фазе је коначни резултат предвиђања АНТИГЕНпро [25]. ВакиЈен2.0 (хттп://ввв. дог-пхармфац.нет/вакијен/ВакиЈен/ВакиЈен.хтмл) је још један јавно доступан веб сервер који процењује антигеност протеинске секвенце приступом без поравнања који се заснива на ауто унакрсну коваријансну (АЦЦ) трансформацију протеинских секвенци у униформне векторе главних аминокиселинских својстава и омогућава класификацију антигена искључиво на основу различитих физичко-хемијских својстава протеина без позивања на поравнање секвенце [43]. Друго, да би се искључила свака могућност да би конструкт вакцине могао да изазове алергијски одговор код појединца, сервер АлгПред (хттпс://вебс.ииитд.еду.ин/рагхава/алгпр ед/субмиссион.хтмл) је коришћен за утврдити његову алергеност. Серверски алат пружа различите приступе, укључујући мапирање ИгЕ епитопа, МЕМЕ/МАСТ мотива, СВМ методу засновану на саставу дипептида и БЛАСТ АРП, који се сви користе за тачно предвиђање. Праг је постављен на 0.4 (подразумевано) ради веће прецизности предвиђања. Поред тога, примењен је и АллерТоп в.2.{{20}} (хттпс://ввв. дог-пхармфац.нет/АллерТОП/индек.хтмл), слободно доступна алатка заснована на веб серверу да би се потврдила неалергијска природа конструкта вакцине. Овај метод се заснива на ауто-коваријансној (АЦЦ) трансформацији протеинских секвенци у униформне векторе једнаке дужине. Примењен је на квантитативне студије односа структуре и активности (КСАР) пептида различитих дужина, а протеини су класификовани према алгоритму к-најближег суседа [44]. Токсичност, ако је постоји, је предвиђена коришћењем сервера ТокинПред (хттпс://вебс.ииитд.еду.ин/рагхава/токинпред/проте ин.пхп). Овај алат за предвиђање функционише на основу технике машинског учења и квантитативне методе која је обучена на скупу података различитих токсичних и нетоксичних пептида добијених од СвиссПрот и ТрЕМБЛ [45]. Профилирање токсичности је кључно за процену безбедности вакцине и других таквих имунотерапеутских пептида који су намењени испитивању на људима. Анализа је извршена одабиром приступа заснованог на СВМ (ТрЕМБЛ)+мотиву при прагу Е вредности од 10.0 за метод заснован на мотивима и прагу СВМ од 0,1.

Вредновање физичко-хемијских својстава

Описивање физичких и хемијских карактеристика химерног пептида постаје витално јер, када се примењује као вакцина, треба да буде у стању да изазове одговарајући имуни одговор. ПротПарам сервер доступан са ЕкПАСИ (Екперт Протеин Аналисис Систем) порталом (хттпс://веб.екпаси.орг/програм/) коришћен је за израчунавање различитих физичко-хемијских параметара примарне конструкције вакцине која укључује карактеристике као што су молекулска тежина, теоретски пИ, индекс нестабилности, алифатски индекс, ин виво и ин витро полуживот, велики просек хидрофобности (ГРАВИ) и други.

Предвиђање секундарне структуре пептида вакцине

Секундарни структурни елементи пројектованог конструкта вакцине предвиђени су применом ПСИПРЕД сервера (хттп://биоинф.цс.уцл.ац.ук/псипред/) и РапторКс сервера својстава (хттп://рапторк.уцхицаго.еду/СтруцтуреПропертиПред/ предвиђају/) оба су бесплатно доступни онлајн сервери за анализу структуре протеина. Као улаз је дата примарна секвенца пептида вакцине. ПСИПРЕД предвиђа секундарну структуру улазне протеинске секвенце искоришћавањем две неуронске мреже које функционишу на основу матрица оцењивања специфичних за позицију (ПССМ) које генерише ПСИ-БЛАСТ [46]. Укључује идентификацију секвенци које су хомологне нашем конструкту вакцине помоћу ПСИ-БЛАСТ-а, након чега следи генерисање ПССМ. Утврђено је да ПСИПРЕД 3.2 и новије верзије постижу просечан резултат К3 од 81,6% процењено строгом троструком методом унакрсне валидације која овај приступ чини значајно прецизним и тачним. РапторКс свој веб сервер користи најновију технику машинског учења под називом ДеепЦНФ (дубока конволуциона неуронска поља) за предвиђање различитих карактеристика као што су секундарна структура, доступност растварача и неуређени региони истовремено. ДеепЦНФ је интегрисани приступ који комбинује и условна насумична поља (ЦРФ) и плитке неуронске мреже који моделује сложене односе секвенце и структуре помоћу дубоке хијерархијске архитектуре и може постићи приближно 84% К3 тачности за 3-класу секундарне структуре [47] .

Предвиђање терцијарне структуре

Терцијарна структура коначног пептида вакцине је предвиђена коришћењем онлајн веб сервера И-ТАССЕР (хттпс://зханглаб.ццмб.мед.умицх.еду/И-ТАССЕР/). И-ТАССЕР је приступ моделирању хијерархијске структуре протеина заснован на поравнању навоја профила-профила (ППА) и итеративним симулацијама склапања структуре праћене пречишћавањем структуре на атомском нивоу. Ради у три фазе: структурна идентификација шаблона, итеративно састављање структуре и белешка функција заснована на структури. Најбоље рангирани модели структуре са глобалном и локалном проценом тачности враћају се са својим репрезентативним Ц-скорима и ТМ скором, који су у корелацији са квалитетом предвиђеног модела. Програм И-ТАССЕР представља једну од најуспешнијих метода демонстрираних у ЦАСП за аутоматизована предвиђања структуре и функције протеина [48, 49].

Пречишћавање терцијарне структуре вакцине

Конвенционално рачунарско моделирање структуре протеина само по себи не гарантује аутентичност и тачност предвиђеног модела јер такве стратегије моделирања у великој мери зависе од степена вероватноће улаза (циља) са доступним структурама шаблона. Стога се сматрало да је неопходно побољшање квалитета модела заснованог на шаблону изнад тачности, а то би се могло постићи пречишћавањем целе структуре протеина. Из ове перспективе, излаз тродимензионалног модела са И-ТАССЕР сервера са најбољим Ц-скором је подвргнут даљем усавршавању од стране ГалакиРефне сервера (хттп://галаки.сеоклаб.орг/цги-бин/субмит.цги?типе{ {4}} РЕФИНЕ). То је ЦАСП10-тестиран приступ префињености у коме се прво реконструишу бочни ланци протеина, а затим се поново пакује бочни ланац и целокупна релаксација структуре се изводи симулацијом молекуларне динамике. Ово доводи до прецизног побољшања како локалних тако и глобалних терцијарних структура циљних протеина [50].

предности додатка цистанцхе-у против-инфламаторно

Валидација терцијарне структуре вакцине

Рафинисана терцијарна структура вакцине је морала да буде валидирана да би се уочиле потенцијалне грешке које би се могле појавити у предвиђеном 3Д моделу. Рафинисани модел добијен са ГалакиРефне сервера је обезбеђен као улазна структура у а.пдб формату. Осим тога, дијаграм Рамацхандрана је још један веома користан приступ за визуелизацију енергетски дозвољених и недозвољених региона пхи (ϕ) и пси (ψ) диедралних углова бочних ланаца аминокиселина који се сматрају кључним компонентама за валидацију структуре протеина. Стога је коришћен МолПробити сервер [Главна страница—МолПробити (дуке.еду)] који генерише Рамацхандран график за дати модел вакцине заснован на Пхеник валидацији у МолПробити стилу заснованој на Питхон-у [51]. Даље смо користили ЕРРАТ сервер [САВЕСв6.0—Струцтуре Валидатион Сервер (УЦЛА. еду)] који анализира статистику невезаних интеракција између различитих атома у моделу и приказује вредност функције грешке у односу на {{ 6}}клизање остатака [52]. У ту сврху коришћен је ПроСА веб сервер (хттпс://проса.сервицес.цаме.сбг.ац.ат/проса.пхп), интерактивна веб платформа заснована на стандардном ПроСА програму [53]. Овај корак је изведен да би се добила софистициранија и прецизнија валидација моделиране структуре.

Дисулфидни инжењеринг пептида вакцине

Дисулфидне везе доприносе стабилности протеина смањењем конформационе ентропије и повећањем слободне енергије денатурисаног стања. Увођење нових дисулфидних веза сматра се критичним биотехнолошким алатом за побољшање термостабилности нативних, пресавијених протеина. Дисулфиде би Десигн 2 (ДбД 2) в 2.12 сервер је коришћен за побољшање укупне структурне стабилности дизајниране вакцине увођењем дисулфидних веза. Овај метод користи нативну геометрију и израчунава енергетску вредност за сваки потенцијални дисулфид, чиме се обезбеђује начин да се рангирају кандидатске дисулфидне везе. Дисулфидне везе које дају максималну стабилност биле су кандидати са високом вредношћу цхи3, енергијом везе и Б фактором [54]. Флексибилни региони пептида су одабрани на основу параметара поменутих раније, а одговарајуће стабилизацијске мутације су створене формирањем дисулфидних веза између изабраних парова остатака.

Молекуларно спајање конструкта вакцине са имуним рецепторима (хумани ТЛР-2, 4, 5, 8 и мишји ТЛР-9)

Толл-лике рецептори (ТЛР) су главни атрибути ћелијских имуних одговора који препознају молекуларне обрасце повезане са патогеном (ПАМП) и изазивају урођене имуне одговоре на инфекције. Касније је објављена директна активација ТЛР-2 са компонентама Леисхманиа [55]. У другим сродним експерименталним студијама, недостатак ТЛР-4 је довео до повећаног раста паразита и одложеног зарастања кожних лезија изазваних инфекцијама Л. мајор, што указује на веродостојну улогу ТЛР-4 у изазивању имунитета против лајшманије [56 ]. С друге стране, утврђено је да су ТЛР-2, 4 и 9 укључени у имунопатолошки спектар ЦЛ узроковане Л. бразилиенсис и Л. амазоненсис [57]. ТЛР-9 је такође оцењен као кључни играч у активацији дендритских ћелија у патогенези ВЛ код људи [58]. У већини студија спроведених у овој области показало се да неке од компоненти изведених из лајшманије активирају ТЛР-2, 4 и 9. Ова запажања наглашавају чињеницу да су различити ТЛР укључени у покретање заштитног имунитета против Леисхманије. Стога се сматрало да је интеракција између ТЛР-а и дизајнираног конструкта вакцине неопходна за изазивање ефикасног имунитета против инфекција лајшманијом. Ово је проверено извођењем молекуларног спајања пептида вакцине са више епитопа са људским ТЛР-2, 4, 5, 8 и мишјим ТЛР-9 користећи ПатцхДоцк сервер [ПатцхДоцк Сервер (тау.ац.ил )]. ПатцхДоцк алгоритам има три главне фазе, наиме, представљање молекуларног облика, подударање површинских закрпа и филтрирање и бодовање. То је алгоритам за молекуларно спајање заснован на геометрији који углавном функционише на комплементарности облика молекула између рецептора и лиганда. Комплементарне закрпе се поклапају и генеришу се трансформације кандидата. Свака од ових трансформација се даље рангира додељивањем функције бодовања која узима у обзир и енергију атомске десолватације и геометријске фт [59, 60]. У нашој студији, људски ТЛР-2 (ПДБ ид: 6НИГ), ТЛР-4 (ПДБ ид: 4Г8А), ТЛР-5 (ПДБ ид: 3Ј0А), и ТЛР-8 (ПДБ ид: 4КЦ0), и миш ТЛР-9 (ПДБ ид: 3ВПФ) су изабрани као рецептори, а њихове засебне ПДБ датотеке су преузете из Протеин ДатаБанк (ввв .рцсб.орг). Рафинисани 3Д модел пептида вакцине је коришћен као лиганд за све симулације пристајања. ПатцхДоцк сервер је подешен на подразумеване параметре (кластеризовање РМСД: 4.0). Даље смо анализирали најбољи модел пристајања користећи Цлуспро сервер на основу могућег алгоритма ротације везе, а везе су процењене коришћењем софтвера ПиМОЛ [61].

Оптимизација кодона, предвиђање структуре мРНА и клонирање ин силико за експресију протеина вакцине

Оптимизација кодона је потребна да би се постигла максимална експресија страних гена у организму домаћина када се употреба кодона од стране домаћина значајно разликује од употребе кодона нативног домаћина из којег су издвојене оригиналне секвенце за коначну конструкцију вакцине. ЈЦат (Јава Цодон Адаптатион Тоол), јавно доступан на (хттп://ввв. јцат.де/), коришћен је за реверзно превођење и оптимизацију кодона дајући примарну секвенцу коначног конструкта вакцине као улаз. Употреба кодона је оптимизована за прокариотски организам са највише секвенци, Е. цоли К12 [6]. Одабране су три додатне опције које пружа алатка да би се избегли терминатори транскрипције независни од рхо, места везивања прокариота за рибозоме и нежељена места рестриктивног цепања. Индекс адаптације кодона (ЦАИ) и садржај ГЦ, како је израчунао ЈЦат алат, показују колико је била добра оптимизација. Боља оптимизација обезбеђује већу експресију протеина вакцине. Даље, рестрикциона места за ензиме КсхоИ и НдеИ су уграђена у оптимизовану секвенцу цДНК коју обезбеђује ЈЦат алат да би се олакшало клонирање. Модификована секвенца (са рестрикцијским местима) је затим убачена у вектор плазмида Е. цоли пЕТ 28-а(+) коришћењем модула за рестрикционо клонирање алата СнапГене [6, 31, 62, 63]. Софтвер СнапГене је доступан на вебу на (хттпс://ввв.снапгене.цом/). Осим тога, користили смо и мфолд веб сервер (хттп://унафолд.рна.албани.еду/?к=мфолд/РНА-Фолди нг-Форм) за предвиђање секундарне структуре иРНК коју кодира гени химерног пептида. Обрнуто преведена оптимизована секвенца добијена из ЈЦат алата је обезбеђена као улаз. Програм мфолд је заснован на основном алгоритму који предвиђа минималну слободну енергију, ∆ Г, и минималну слободну енергију за савијања која садрже било који одређени пар база. Различита ограничења савијања се такође примењују за тачно предвиђање енергија савијања. Енергија савијања за савијање РНК је фиксирана на 37 степени, док су јонски услови фиксирани на [На+]=1 М и [Мг++]=0 [64].

Симулација имунитета заснована на Ц-иммсим

Ц-иммсим (хттпс://кракен.иац.рм.цнр.ит/Ц-ИММСИМ/индек. пхп?паге=1) је алатка за предвиђање имуног одговора заснована на серверу која користи класу засновану на агенту и његово предвиђање се ослања на неуронске мреже. Може предвидети и хуморалне и ћелијски посредоване имуне одговоре. Ц-иммсим користи модел Целда Сеиден, модел поликлоналне решетке низа битова и Симпсонов индекс да би карактерисао предвиђање активних, у мировању и меморијских ћелија и њихов век трајања. Помаже да се предвиди профил цитокина дате реакције да би се проценили инфламаторни одговори [65].

Цистанцхе екстракт у праху

Молекуларно-динамичка симулација

Молекуларна динамичка симулација је извршена да би се проценила стабилност нашег најбољег комплекса, тј. ТЛР, са предложеном вакцином користећи иМОД (иМод Сервер хоме паге (цсиц.ес) сервер. Овај веб-базирани сервер користи побољшану анализу нормалног режима (НМА)) за карактеризацију различитих динамичких својстава биомолекула, попут флексибилности и стабилности протеина, помоћу интра-атомског поља силе.У овој студији анализирали смо деформитете главног ланца, Б фактор, сопствене вредности, фактор коваријансе и модел еластичне мреже као стандардни НМА параметри за процену протеин-протеин комплекса добијених ин силицо приступима [66–69].

Резултати

Селекција и проналажење секвенци антигенских протеина Леисхманиа

The amino acid sequences of twelve Leishmania proteins were retrieved from the Uniprot database in FASTA format and subjected to further analysis for the purpose of designing a multi-subunit peptide vaccine against leishmaniasis. These proteins were selected based on previous studies that reported them as potential vaccine candidates as evaluated in experimental animal models or in silico prediction tools. Antigenicity analysis by the ANTIGENpro server showed all the chosen proteins as potential antigens with varying degrees of antigenicity, keeping with the information obtained from literature mining. However, ten among the twelve proteins were presented with relatively higher prediction scores (>0.51), што одражава њихову већу моћ за дизајн вакцине (Табела 1). Протеини су дискриминисани као секреторни и не-секреторни на основу предвиђања места цепања сигналних пептида од стране СигналП 1.4 сервера. Два одабрана протеина Леисхманиа, тј. Пронађено је да Л. мекицана цистеин протеиназа А (Унипрот ид: П25775) и површински гликопротеин Л. амазоенсис ГП-46/М2 (Унипрот ид: П21978) садрже сигналне пептиде и стога су предвиђени као секреторни протеини. За остатак од десет Леисхманиа антигена није нађено да имају сигнални пептид који указује на њихову не-секреторну природу. Анализа локализације је предвидела да ће протеин цистеин протеиназа А Л. мекицана (Унипрот ид: П25775) бити локализован у лизозому/вакуоли, протеинима лешманолизин Ц1 и протеофосфогликану Л. мекицана (Унипрот ид: П43150 мембрански протеини, односно К9ТВ13) , НЕДОСТАЈЕ заштитни антиген Л. доновани (Унипрот ид: К9БИЈ5) да буде у језгру и топлотни шок 70 повезан са протеином 1 Л. мајор (Унипрот ид: П12076) да буде локализован у митохондријама. Сви остали протеини су предвиђени као цитоплазматски (Табела 1). Поред овога, аминокиселинска секвенца алфа ланца хуманог ИЛ-12 је такође добијена из Унипрот базе података (Унипрот ид: П29459) да би се користила као помоћно средство у коначном конструкту вакцине.

Предвиђање ЦТЛ и ХТЛ епитопа

Од свих протеина који се истражују, НетЦТЛ 1.2 и СИФПЕИТХИ сервери су заједно идентификовали укупан број од 59 уобичајених нонамериц ЦТЛ епитопа. Сваком од предвиђених ЦТЛ епитопа је додељен одређени резултат који су израчунали одговарајући сервери. Само 26 од ових уобичајених 9-мер ЦТЛ мотива је одабрано због њихових виших резултата (што указује на већи афинитет за везивање МХЦ И). Ових двадесет и шест ЦТЛ епитопа које су оба сервера обично идентификовала са компатибилним вишим резултатима укључено је у коначну конструкцију вакцине (додатна табела С1). Слично, ИЕДБ алатка за анализу везивања МХЦИИ је предвидела 15-мер ХТЛ епитопе из свих одабраних протеина у односу на скуп од три хумана ХЛА алела (ХЛА-ДРБ1*01:01, ХЛА-ДРБ1*01:02 и ХЛАДРБ1* 01:03). Предвиђени ХТЛ епитопи са најнижим прилагођеним рангом за сваки од ових алела су документовани као у додатној табели С2. Из овог скупа, укупан број од девет секвенци је изабран на основу њихових ниских прилагођених рангова (Табела 2) који ове ХТЛ епитопе чине најмоћнијим МХЦ-ИИ везивним средствима за било који од три ХЛА алела. Одабрани ХТЛ епитопи су затим подвргнути даљој компјутерској анализи како би се предвиделе њихове способности за производњу цитокина.

Табела 1. Дванаест потенцијалних антигенских пептида из различитих врста Леисхманиа је искоришћено за израду вакцине и одабрано на основу њиховог високог резултата антигена како је предвидео АНТИГЕНпро сервер

Скрининг за ХТЛ епитопе са способношћу индукције цитокина

Свих девет одабраних ХТЛ епитопа (Табела 2) је процењено на њихову способност да производе интерферон коришћењем ИФНепитопе сервера. Сервер је предвидео (ИФН- вс. нонИФН, користећи СВМ и хибридну анализу засновану на мотивима) само три таква пептида као што је ФРРЛИКТЛГКЛВИКК из парафагеларног штапића протеина 2Ц Л. мајор, ДНГАИЛГМЕПССВАА из протеофосфогликана из Л. мекицана, и беГФлинтаСРХ ланца Л. мекицана као „позитиван“ са скором мањим од 1.0 (Табела 3). Ова три пептида су даље проверена за њихове способности производње ИЛ-4 и ИЛ-10- помоћу ИЛ4пред сервера и ИЛ10пред сервера, респективно. Оба сервера користе СВМ класификатор и узимају у обзир различите СВМ улазне параметре као што су састав аминокиселина, састав дипептида, склоност амино киселинама и физичко-хемијска својства за предвиђање [32, 33]. Одговарајући сервери су предвидели да су ова три епитопа која производе 15-мер ИФН- - такође индуктори за ИЛ-4 и ИЛ-10 (додатна табела С3). Стога су ова три епитопа 15-мер ХТЛ који се везују за МХЦ-ИИ коначно одабрана за израду вакцине с обзиром на њихову способност да изазову производњу цитокина ИФН-, ИЛ-4 и ИЛ{{24 }} чиме се посредује појачани имуни одговор.

Анализа очувања епитопа

ИЕДБ модул „конзервација преко антигена“ који је доступан у оквиру ИЕДБ сервера је коришћен да се пронађе степен конзервације одабраних ЦТЛ и ХТЛ епитопа који би били уграђени у коначну конструкцију вакцине. Сваки од двадесет шест ЦТЛ епитопа и три ХТЛ епитопа је појединачно прегледан у односу на специфичан скуп хомологних протеинских секвенци добијених помоћу Унипрот БЛАСТ-а. Резултати БЛАСТ-а су показали висок степен очуваности одабраних протеина у различитим врстама лајшманије, као и код других сродних паразитских протозоа, углавном Трипаносома. Утврђено је да су сви ХТЛ епитопи високо конзервирани (100%) у низу сродних протеина Леисхманиа коришћених у анализи, док је опсег конзервације за одабране ЦТЛ епитопе варирао од 0 до 100% (додатна табела С4). Уградња тако очуваних ЦТЛ и ХТЛ епитопа у коначну конструкцију вакцине би обезбедила унакрсни имунитет широког спектра против више врста патогених лајшманија које обично инфицирају људе.

Табела 2 Детаљи одабраних ХТЛ епитопа (15 мер) са њиховим изворним протеинима, одговарајућим алелима везивања и прилагођеним ранговима предвиђеним ИЕДБ МХЦ-ИИ алатом за везивање

Табела 3 ИФНепитопе сервер је предвидео епитопе који индукују МХЦ ИИ који су способни за производњу интерферона

Конструкција секвенце мулти-епитопне вакцине

Примарна секвенца пептидне вакцине са више подјединица конструисана је спајањем секвенци од двадесет шест ЦТЛ епитопа и три ХТЛ епитопа одабраних на основу њихове антигености, афинитета МХЦ-везивања и способности индукције цитокина. Појединачни ЦТЛ и ХТЛ епитопи су спојени коришћењем ААИ и ГПГПГ линкера, респективно, а укупна дужина резултујућег пептида вакцине била је 369 аминокиселина. Адјуванс, 219 аминокиселина дугог алфа ланца хуманог ИЛ-12 (Унипрот ид: П29459), додат је на Н терминал дизајнираног пептида помоћу ЕААК линкера. Додавање ИЛ-12 као природног адјуванса требало је да побољша ефикасност вакцине убрзавањем имунолошког одговора, као што је већ потврђено у студијама на животињама [3, 37]. Поред тога, 6КСХис ознака је такође додата на Ц терминал пептида да би се олакшала идентификација и пречишћавање протеина након његове производње технологијом рекомбинантне ДНК. Након додавања линкера, адјуванса и хистидинске ознаке, утврђено је да дужина коначног пептида вакцине износи 598 аминокиселинских остатака (слика 1).

Предвиђање линеарног, континуираног и дисконтинуалног епитопа Б ћелија

Присуство антигенских детерминанти у примарној секвенци дизајниране вакцине идентификовано је коришћењем два различита сервера, наиме, АБЦпред и БепиПред 2.0, ради ефикаснијег предвиђања. АБЦпред сервер предвиђа епитопе Б ћелија коришћењем обучене рекурентне неуронске мреже и представља секвенце кандидата као 16-мер пептиде рангиране према резултатима њиховог везивања (додатна табела С5). Већи резултат пептида значи већу вероватноћу да буде епитоп. Утврђено је да дизајнирани пептид вакцине има седам непоклапајућих 16-мер пептида са предвиђеним резултатима од 0.90 и више при подразумеваној граничној вредности од 0.51 , што одражава њихову веома високу моћ да везују и стимулишу Б ћелије. Други сервер, БепиПред 2.0, предвиђа вероватноћу да сваки аминокиселински остатак у улазној секвенци буде део епитопа Б ћелије и приказује излаз као илустрацију са градацијом наранџасте боје која указује на степен вероватноћа. Предвиђени остаци који припадају епитопима Б ћелија су означени са "Е." Сервер је идентификовао велики број остатака који су линеарни епитопи Б ћелија са великом вероватноћом у оквиру остатка од 380–53{{20}} позиције пептида (слика 2) када праг епитопа је постављен на 0.5 (подразумевано). Дакле, идентификација антигенских детерминанти рецептора Б ћелија од стране два независна сервера утврдила је чињеницу да би пептид, када се примењује као вакцина, био у стању да стимулише производњу антитела од стране Б ћелија како би заштитио појединце од инфекција лајшманијом. Еллипро одело (доступно на ИЕДБ порталу) је предвидело укупно 323 аминокиселинске остатке лоциране у осам дисконтинуираних епитопа Б ћелија у рафинисаној терцијарној структури пептидне вакцине, са резултатима у распону од 0.509 до 0.802. Међу њима, највећи конформациони епитоп је садржао 107 аминокиселинских остатака са предвиђеним резултатом од 0,772. За анализу су коришћени подразумевани параметри сервера. Еллипро је такође предвидео дванаест линеарних епитопа Б ћелија са укупним бројем од 324 остатка у опсегу резултата од 0,535–0,885 (додатна табела С6 и додатна слика М1).

Профилирање антигености, алергености и токсичности конструкта вакцине

Антигеност коначне секвенце вакцине (са адјувансом) процењивали су АНТИГЕНпро и ВакиЈен 2.0 сервери. АНТИГЕНпро сервер је предвидео да је исти вероватно антиген са оценом антигености од 0.745396. ВакиЈен 2.0 сервер је проценио пептид вакцине као вероватан антиген са резултатом 0,5325 на прагу од {{10}}},5 када је циљни организам је изабран да буде паразит (Табела 4). Међутим, када је ВакиЈен 20 анализирао оригиналну секвенцу вакцине без адјуванса, она је такође била предвиђена као вероватан антиген са резултатом 0.5768 у моделима паразита. АНТИГЕНпро резултат предвиђања за оригиналну секвенцу је био 0.714582. Стога је утврђено да су обе конструисане секвенце вакцине (са и без адјуванса) по природи антигенске, што потврђује чињеницу да су пептидне компоненте вакцине саме по себи антигене, чак и у одсуству доданог адјуванса (Табела 4). Што се тиче алергености, АлгПред је утврдио да коначна секвенца вакцине није алергена са предвиђеним резултатом од 0.4018 на прагу од 0.4. Поред тога, није пронађено да секвенца протеина садржи било какав експериментално доказан ИгЕ епитоп и нису пронађени погоци за БЛАСТ резултате за пептиде који представљају алергене (АРП), што указује на неалергену природу вакцине. АллерТОП в.2.{38}} сервер је такође дефинисао протеин као вероватан неалерген. Анализа токсичности коју је спровео сервер ТокинПред предвидела је да пептид није токсичан када је приступ заснован на СВМ (ТрЕМБЛ)+мотиву усвојен на СВМ прагу од 0,1, а гранична вредност Е вредности за базирану на мотиву је постављена на 10,0. Дакле, генерисана секвенца вакцине је предвиђена као вероватан антиген, неалергена и нетоксична, што су сви важни критеријуми за идеалну мулти-подјединичну пептидну вакцину.

Слика 1 Шематски приказ дизајниране мулти-епитопне пептидне вакцине која садржи укупно 598 аминокиселинских секвенци које представљају могући конструкт вакцине са Н терминалним природним адјувансом (зелено) повезано са ЕААК (љубичасто) са 26 ЦТЛ (наранџасто) користећи ААИ (плави) линкер , и 3ХТЛ (жути) су повезани са ГПГПГ (црвеним) линкером. Завршава се са 6-Његовом ознаком на Ц терминалу у сврху прочишћавања

Слика 2 Епитоп Б ћелије који је предвидео Бепипред 2.0 сервер. Предвиђена су дужина у различитим тачкама од 1 до 590 аминокиселинских секвенци са потенцијалним епитопом изнад подразумеваног нивоа прага. Први ред означен као Е приказује предвиђену локацију епитопа

Процена физичкохемијских параметара

Физичко-хемијске параметре коначног конструкта вакцине израчунао је Протпарам сервер на основу аминокиселинских остатака присутних у датој секвенци. Молекуларна тежина (МВ) дизајнираног пептида је израчуната на 65,68 кДа што га чини погодним за изазивање имуногеног одговора. Теоретски пИ (изоелектрична тачка) је израчунат као 5,98, што означава да је пептид благо киселе природе. Укупан број позитивно наелектрисаних и негативно наелектрисаних остатака у пептиду био је 48 и 55, респективно. Полуживот је израчунат као 30 х у ретикулоцитима сисара ин витро, више од 20 х у квасцу и више од 10 х у Е. цоли ин виво. Перзистентност протеина током 30 х у ћелијама сисара (укључујући људе) била је довољна за изазивање пожељног имунолошког одговора пошто механизам захтева обраду и презентацију протеина од стране имуних ћелија. Алифатски индекс (релативна запремина коју заузимају алифатски бочни ланци) је предвиђена на 78,34, што указује да је протеин по природи термостабилан јер се алифатски индекс може сматрати позитивним фактором који доприноси повећању термостабилности глобуларних протеина. Индекс нестабилности је израчунат на 47,10. Предвиђена вредност великог просека хидропатије (ГРАВИ) конструкта вакцине је -0,140; негативна вредност га дефинише као хидрофилну по природи и биће у интеракцији са молекулима воде [28, 70–72]. Да закључимо, имуноинформатичка анализа је предвидела дизајнирани пептидни конструкт као антиген, термостабилан, постојан у ћелијама сисара и хидрофилан. Сви ови фактори утичу на ефикасност конструкта као вероватног кандидата за вакцину.

Предвиђање секундарне структуре

Предвиђање секундарне структуре за 592 остатка дугачког химерног пептида од стране ПСИПРЕД сервера открива присуство 45,77% алфа хеликса, 4,89% бета-листа и 49,32% калема, као што је приказано на следећој слици 3. Поред тога, РапторКс структура сервер за предвиђање је анализирао релевантну доступност растварача за пептид у којем је предвиђено да ће 36% остатака бити изложено, 28% је предвиђено као средње закопано, а 35% остатака је предвиђено као закопано, што указује да ће протеин имати свеукупни фер контакт са водом (растварачем). РапторКс сервер је предвидео да ће само 32 остатка (5% пептида) бити у поремећеном домену протеина.

Предвиђање терцијарне структуре

I-TASSER web server was utilized for the prediction of the 3-D structure of the designed vaccine. The server predicted five models for the said peptide on the basis of multiple threading alignments using ten different templates, among which the template with PDB id 7e2cl showed the best alignment with an TM score of 0.931 and an RMSD value of 2.75. The top-ranked model exhibiting the highest confidence score (C-score) of−1.11 and an estimated RMSD of 10.3±4.6 Å (Fig. 4a) was selected for further refinement. A higher C-score indicates a higher level of confidence with which the server predicts the tertiary structure of the target protein based on the predictions obtained from modeling simulations [46, 66]. The C-score has a strong correlation with the overall quality of the tertiary structure, and it has been used widely for quantitative estimation of the RMSD and TM scores of predicted models in comparison with the native models; further, the estimated TM score of the chosen model was found to be 0.58±0.14 which is another strong indicator of good modeling strategy since a TM score of>0.5 означава модел са исправним преклопом. ТМ скор је параметар независно од дужине секвенце за мерење структурне сличности предвиђеног модела са другим идентичним протеинима у истој СЦОП/ЦАТХ фамилији набора [47].

Табела 4 Резултати антигености израчунати са АНТИГЕНпро сервера и Вакијен2.0 сервера са и без антигена

Слика 3 Предвиђање секундарне структуре линеарне секвенце вакцине од стране ПСИПРЕД сервера

Слика 4 Предвиђање и прецизирање терцијарне структуре 3-Д моделирање структуре вакцине како је предвидео И-ТАССЕР сервер. б Пречишћавање сировог 3-Д модела од стране ГалакиРефне сервера

Пречишћавање и валидација 3‑Д модела вакцине

„Сирови“ терцијарни модел за пептидну вакцину је накнадно рафиниран обрадом преко ГалакиРеоне сервера. ГалакиРефне је дао пет модела, од којих је модел 1 био најбољи након процене и поређења повезаних параметара као што је ГДТ-ХА (0.8826); РМСД (0.608); МолПробити (2.398); резултат судара (21,1); лоши ротамери (0.6); и регион фаворизован Рама (88,8) са осталим моделима (слика 4б). Рамацхандран график генерисан од МолПробити сервера показао је да рафинисани 3-Д модел има 88,8% остатака у фаворизованом региону, 98,6% остатака у дозвољеном региону и само 0.013% одступања. Насупрот томе, утврђено је да почетни сирови модел има 77,1%, 94,2% и 0,057% остатака у фаворизованим, дозвољеним и удаљеним регионима, респективно. Ови резултати јасно закључују да је квалитет рафинисаног терцијарног модела значајно побољшан. ЕРРАТА сервер је такође искоришћен за додатну валидацију побољшаног модела. ЕРРАТА сервер је анализирао модел са укупним фактором квалитета од 43,542, што заправо представља проценат модела улазног протеина који пада испод границе одбацивања од 95%. Тако смо успешно добили значајно рафинирану и валидирану терцијарну структуру за конструкт вакцине. Рафинисана терцијарна структура вакцине, заједно са дијаграмима добијеним са МолПробити сервера и ЕРРАТ сервера, представљена је на слици 5. ПроСА веб сервер је показао З резултат од −1,08 (додатна слика М2), на којој је негативна вредност указује да модел не спада у опсег резултата сличних протеина упоредивих величина чије су структуре одређене дифракцијом рендгенских зрака или НМР [51].

Дисулфидни инжењеринг пептида вакцине

Дисулфиде би Десигн 2.12 сервер је вратио 45 парова аминокиселинских остатака који су вероватна места за формирање дисулфидне везе. Идентификовали смо четири најважнија пара кандидата који се могу налазити у региону флексибилне петље протеина вакцине на основу њихове високе енергије везе и вредности Цхи3 (додатна табела С7). Ови остаци, ТХР58-ПХЕ61 (цхи3:+126.18), ЛЕУ216-АЛА234 (цхи3:+125.92), ТХР323-ГЛУ359 (цхи3 :+121.54), и ТИР472-АРГ504 (цхи3: + 125.75), замењени су цистеином у рафинисаном терцијарном моделу коначног протеина вакцине, чиме је побољшана термичка стабилност пептида (слика 6). Међутим, тачност фактора Б је ограничена на слабљење расејања неутрона или рендгенских зрака термичким кретањем молекула у кристалографији протеина. Стога смо строго одабрали високу енергију везе и вредности Цхи3 у односу на фактор Б за овај компјутерски потпомогнут модел рафинисане вакцине [73, 74].

Анализа пристајања интеракција пептида вакцине са ТЛР

Интеракције химерног пептида са имуним рецепторима (људски ТЛР{{0}}, 4, 5, 8 и мишји ТЛР-9) проучаване су извођењем доцкинг анализе помоћу ПатцхДоцк сервера у којем је везивање процењени су афинитети вакцине (лиганда) са различитим ТЛР (рецепторима). Размотрено је десет најбољих модела које је ПатцхДоцк генерисао за свако пристајање, међу којима су за сваки случај одабрани модели са најбољим рангом са највишим резултатима пристајања. Резултати су представљали облик и добротворност електростатичког комплемента између рецептора и лиганада. Најбоља комплементарност је пронађена у случају људског ТЛР-2 (ПДБ ид: 6НИГ) са резултатом од 18,714, површином 3963,10 и атомском контактном енергијом (АЦЕ) 217,99 (слика 7а) . Вакцина је такође показала ефикасно везивање са ТЛР-5 (ПДБ ид: 3Ј0А) и ТЛР-9 (ПДБ ид: 3ВПФ) са резултатом пристајања од 18,258; површина 2879,80 и АЦЕ од −666,94 и пристајање 18,164; и површина 4090,70 и АЦЕ од 495,74, респективно. Спајање са другим ТЛР-овима показало је слабије афинитете везивања што се огледа у нижим резултатима пристајања које генерише ПатцхДоцк, 16.708 за ТЛР-4 (ПДБ ид: 4Г8А) и 17.800 за ТЛР-8 (ПДБ ид: 4КЦ0). Дакле, наш конструкт вакцине је био у стању да се веже за различите имуне рецепторе са различитим афинитетима везивања. Ово би било веома пожељно за ефикасну вакцину у смислу изазивања одговарајућег и појачаног имунитета за спречавање инфекција лајшманијом. Даље, ФиреДоцк веб алат је коришћен за пречишћавање и поновно оцењивање најбољег комплекса (ТЛР-2 комплекс вакцине), који га је рафинисао са минималном глобалном енергијом од −19,01, Ван Дер Ваалс асоцијацијама (−25,74), атомским контактом енергија (−0,03), и слободна енергија везивања (−24,26). Ови резултати потврђују чињеницу да пептид вакцине најефикасније реагује са хуманим ТЛР-2 и на тај начин формира разумно стабилан комплекс који би могао да изазове изражен имуни одговор против паразита Леисхманиа. Поред овога, даље истражујемо повезивање ТЛР-2 и вакцине; коришћењем Цлуспро веб сервера, најбољи модел (слика 7б) је изабран на основу 5Д ротационог ФФТ и ЦАПРИ (критичка процена предвиђених интеракција) са избалансираним пондерисаним резултатом −1192,5 који има највећу величину кластера од 42 члана. Табела 5 садржи листу од 10 аминокиселинских остатака у интеракцији са слике 7б који формирају стабилан комплекс рецептор-лиганд.

Слика 5 Рамацхандран графика за модел ГалакиРефне. б ЕРРАТ сервер је предвидео процену квалитета структуре протеина

Слика 6 Дисулфид по дизајну 2.0 предвиђа четири (означене стрелицом) потенцијалне формације дисулфидне везе за побољшање термичке стабилности коначног конструкта вакцине

Оптимизација кодона и ин силиконско клонирање за експресију протеина вакцине

У покушају да се превазиђе проблем пристрасности кодона, за оптимизацију кодона је коришћен ЈЦат алат који је вратио улазну аминокиселинску секвенцу пептида вакцине у облику обрнуто преведене цДНК секвенце са оптимизованом ЦАИ вредношћу од 1. Ова вредност лежи унутар прихваћеног опсега вредности ЦАИ од 0.8–1.0 [28], обезбеђујући високу стопу експресије гена у организму домаћина, Е. цоли К12. Што је већа вредност ЦАИ, то ће бити боља стопа експресије страног гена. Поред тога, утврђено је да је ГЦ садржај побољшане секвенце 51,85%, што указује на добру оптимизацију кодона. За бољу експресију гена потребно је 35–70% ГЦ садржаја [63]. Рестрикциона места за ензиме КсхоИ и НдеИ су створена на 5/ и 3/ крајевима секвенце, након чега је уследило уметање модификоване секвенце у пЕТ28 а(+) вектор. Клонирани уметак, представљен црвеном бојом, лежи између наведених рестрикцијских места у вектору. Део од шест хистидинских остатака се такође налази на оба краја клониране секвенце да би се олакшао процес пречишћавања након производње протеина рекомбинантне вакцине [6, 31]. Величина коначног конструкта плазмидног вектора са уметнутим фрагментом гена била је око 7 кб (слика 8). Мфолд веб сервер је предвидео укупан број од педесет преклопних конформација мРНК, међу којима је изабрана највиша структура због најнижег енергетског резултата (ΔГ= −492,50). Предвиђено је да ова конформација садржи једну спољашњу петљу и четири стека са минималним слободним енергијама што указује на стабилност конформације. Петља је формирана са 21 једноланчаном базом и две спирале за затварање. Тачкаста дијаграма енергије израчунала је да оптимална енергија (δГ) буде 494,4 кцал/мол. Различите обојене тачке у пољу односе се на различите енергетске нивое одређеног пара база присутног у мРНК с обзиром на δГ који је израчунао сервер [64]. Према дијаграму, слободне енергије већине парова база су унутар −487,5<δg <="−485.8" kcal/mol="" range="" (supplementary="" image="" m3).="" conclusively,="" a="" thermodynamically="" favored="" and="" energetically="" stable="" secondary="" structure="" of="" the="" mrna="" was="" predicted="" (supplementary="" image="" m4).="" all="" the="" folding="" constraints="" were="" set="" at="" their="" default="" values,="" and="" the="" rna="" was="" considered="" to="" be="" linear="" in="">

Табела 5 ПиМОЛ је генерисао десет интерагујућих аминокиселинских остатака рецептора и лиганда са слике 7б, а број у () указује на одговарајући положај аминокиселина у рецептору и лиганду

Симулација имунитета

Ин силицо имунолошка симулација коришћењем Ц-иммсим веб сервера је предвидела да број антигена достиже до 6,9× 105 /мл у року од 2 дана од почетне дозе ињекције, а ниво антигена је пао на 0 четвртог дана надаље. Ово повећање броја антигена је у корелацији са значајним повећањем концентрације и нивоа ИгМ ИгГ и самог ИгМ нивоа током раног периода инфекције и достизањем вршног нивоа приближно у року од 12 дана од циклуса инфекције на произвољној скали. Други подтипови нивоа ИгГ1+ИгГ2 и ИгГ1 значајно се повећавају као резултат секундарног имунолошког одговора (слика 9а). Профили цитокина показују инфламаторне медијаторе као што је ИНФ- који достижу нивое до 4×106 нг/мл 12. дана, док остали нивои цитокина остају прилично ниски (слика 9б). Ћелијски посредовани имунолошки одговори на које указује присуство активних и у мировању цитотоксичних Т лимфоцита повећавају се након 2-3 дана након иницијалне ињекције, а присуство пролиферативне меморијске помоћне Т ћелије је такође било истакнуто (Слике 9ц и д). Укупна популација Б ћелија такође расте у року од 2-3 дана, заједно са стварањем меморијских Б ћелија након 1 недеље примене примарне дозе (слика 9е).

Слика 8 Експресиони систем вакцине против Лешманије користећи пЕТ28 а(+) вектор, црвени регион указује на уметнуту секвенцу нуклеинске киселине вакцине окружену рестрикцијским местима НдеИ и КсхоИ

Интерпретација молекуларне динамичке симулације

Најбољи резултат пристајања постигнут ТЛР2-комплексом вакцине даље је анализиран симулацијом молекуларне динамике уз помоћ НМА. Деформабилност главног ланца представљена је високим шаркама (сл. 10а), што значи високу деформабилност. Б фактор (слика 10б) је израчунат помоћу НМА, што означава флексибилност протеина на основу параметара атомског померања [73]. Сопствена вредност (слика 10ц) оцртава потребну енергију за деформисање структуре. ТЛР-2 комплекс вакцине показује сопствену вредност од око 7,778×10−7. Варијанца (слика 10д) је обрнуто повезана са сопственом вредношћу. Матрица коваријансе (слика 10е) илуструје да ли су парови остатака корелирани (црвени), некорелирани (бела) или антикорелирани (плави). Модел еластичне мреже (слика 10ф) израчунава опруге између одговарајућих парова атома, тачке на графикону су представљене градијентом боје који указује на крутост или флексибилност опруге, а тамнија боја одражава чвршћу опругу. Дакле, резултати молекуларне динамичке симулације сугеришу да је наша предложена пептидна вакцина стабилна.

Дискусија

Лајшманијаза се сматра једном од најзанемаренијих тропских болести која првенствено погађа људе који живе у сиромашним подручјима земаља у развоју, укључујући Индију [2]. Према извештајима СЗО, Индија је ендемична за оба облика болести, ЦЛ и ВЛ. ЦЛ изазван Л. тропица и Л. мајор јавља се у северозападним државама Индије, Пенџабу и Раџастану као жаришта (хттпс://ввв.вхо.инт/леисхманиасис/бурден/Леисхманиасис_Индиа/ен/ ). Штавише, са све већом појавом епидемије вируса хумане имунодефицијенције (ХИВ) широм света, лајшманијаза се појавила као опортунистички патоген код пацијената са АИДС-ом, чинећи ситуацију још страшнијом [22, 38]. У тренутној студији, имали смо за циљ да дизајнирамо нову поливалентну општу вакцину за лајшманијазу која би могла да пружи хетерологну заштиту од уобичајених патогених врста паразита. Одабрали смо дванаест протеина специфичних за Леисхманиа који обухватају пет патогених сојева паразита који узрокују ВЛ и ЦЛ инфекције код људи. Ови протеини су већ били процењени због њихове улоге у вируленцији и имуногености и њиховог потенцијала као кандидата за вакцину у различитим имунолошким студијама[1, 8–10, 75]. Стога, конструкт вакцине дизајниран у силикону тако што укључује тако добро окарактерисане и високо очуване имуногене протеине из различитих патогених врста лајшманије може да обезбеди унакрсни имунитет против свих облика хумане лајшманије (углавном ВЛ и ЦЛ) и, према томе, може да се користи за општи програм вакцинације за спречавање инфекција лајшманијом код људи. Одабрани протеини су првенствено прегледани на присуство потенцијалних ЦТЛ и ХТЛ епитопа. Детекција епитопа Т ћелија је важна јер Т ћелије могу да препознају антигене само када су обрађене било ендогеним или егзогеним путем, у комплексу са молекулима МХЦ класе И или МХЦ класе ИИ, а затим их ћелије које представљају антиген представљају рецепторима Т ћелија ( АПЦ). МХЦ-И је специфичан за ЦД8+ЦТЛ, док се МХЦ-ИИ специфично везује за ЦД4+ХТЛ рецепторе. Идентификација за ЦТЛ епитопе је извршена стриктно коришћењем два независна сервера истовремено. Само они епитопи које су предвидела оба сервера са значајно већим афинитетима везивања за МХЦ коначно су укључени у пептид вакцине. Идентификовани ХТЛ епитопи су даље процењени због својих способности индуковања цитокина коришћењем три веб сервера. Они који би могли да стимулишу производњу широког спектра цитокина, наиме, ИФН-, ИЛ{{20}} и ИЛ-10, одабрани су за дизајнирање химеричне пептидне вакцине како би се осигурало да то би подстакло производњу свих ових цитокина специфичних за паразите у домаћину. Ово је од највеће важности пошто су Кедзиерски и колеге предложили да је лучење ИЛ-10 једнако важно као и лучење ИФН-а да би се утврдило да ли вакцина може да изазове заштитни имуни одговор и да се одговарајући имунитет не индукује ако ИЛ Нивои -10 нису пропорционално повишени [8, 75]. Ексклузивни ЦТЛ и ХТЛ епитопи су затим фузионисани коришћењем ААИ и ГПГПГ линкера за конструисање химерног пептида. Раније је пријављено да су ААИ и ГПГПГ линкери корисни за дизајн вакцине са више епитопа јер омогућавају минималну имуногеност споја и олакшавају обраду и презентацију одабраних епитопа помоћу МХЦ-ИИ [6, 28, 71]. Адјувантни алфа ланац хуманог ИЛ-12 је везан за Н терминал резултујућег пептида преко ЕААК линкера. ИЛ-12 је изабран као адјуванс пошто је један од најефикаснијих адјуванса за вакцину против Леисхманиа на животињским моделима, као што је документовано у претходним имуногеним студијама [3, 37, 71]. Пошто је вакцина намењена за примену код људи, очекује се да ће уградња хуманог ИЛ-12 као природног адјуванса уместо било ког синтетичког ТЛР агониста повећати имунитет без изазивања нежељених нуспојава. Улога ИЛ-12 као општег адјуванса за вакцине је такође наглашена због његове моћи у побољшању одговора антитела на протеин и полисахаридну вакцину и изазивању адекватне локалне упале која дозвољава ексудацију ИгГ која доводи до појачаног имунолошког одговора [72]. ЕААК линкер је додат да би се постигла већа брзина експресије и промовисала биолошка функција фузионог пептида ограничавањем интеракције између домена вакцине [76, 77]. Имуноинформатичка анализа је показала да наш конструкт вакцине има много линеарних епитопа Б ћелија који су веома пожељни за вакцину направљену за имунопрофилактичку употребу. Опет, користили смо два различита алата за прецизнија предвиђања. Оба сервера су предвидела довољно епитопа Б ћелија у секвенци вакцине. Предвиђено је да дизајнирана вакцина није алергена, нетоксична и довољно имуногена да изазове одговарајућу имунолошку реакцију. Накнадна физичко-хемијска анализа открила је да је пептид вакцине благо кисео (пИ 5,98) са знатно вишим алифатичним индексом (78,34), што указује на његову термостабилну природу. Негативна ГРАВИ вредност (-0,14) указује на то да је пептид хидрофилан, што додатно доприноси његовој снази као вакцине. Секундарне структурне елементе вакцине одредио је сервер ПСИПРЕД в 4.0, који је једна од најтачнијих и најшире коришћених рачунарских метода за предвиђање секундарне структуре протеина. Штавише, 3Д структура дизајнираног пептида је такође предвиђена коришћењем И-ТАССЕР сервера који је пружио детаљне информације о координатама важних остатака протеина, што је од највеће важности за проучавање динамике, биоактивности и интеракције вакцине. са другим лигандима. Почетна терцијарна структура је пречишћена и валидирана коришћењем алата за валидацију структуре протеина да би се лоцирали и исправиле потенцијалне грешке у бочном ланцу или окосници предвиђеног модела. Анализа Рамацхандран плота је показала да више од 90% остатака рафинисаног модела спада у дозвољени регион са малим процентом одступања, док је ЕРРАТ сервер показао фактор квалитета од 43.542, што све указује на задовољавајући квалитет модела. ЕллиПро сервер је открио да валидирани 3Д модел има адекватан број конформационих епитопа Б ћелија, што имплицира да би могао да генерише пожељан одговор Б ћелија и стимулише производњу специфичних антитела у домаћину. Активација Б ћелија је такође кључна у имунолошком памћењу и одговорна је за дуготрајан имунитет код вакцинисаних особа. Интеракција вакцине са имуним рецепторима (ТЛР) је такође процењена извођењем доцкинг анализе. Утврђено је да пептид вакцине има највећи афинитет за ТЛР-2, а затим за ТЛР-5, иако је био у стању да се веже са другим ТЛР у мањој мери. Интеракција са ТЛР-има је од суштинског значаја за изазивање заштитног имунитета јер су претходне студије које су укључивале животињске моделе документовале да различите врсте лајшманије или њихове антигене компоненте интерагују са различитим ТЛР-има што доводи до интензивног имунолошког одговора код изазваних домаћина. Да би се испунили захтеви за задовољавајућу експресију протеина рекомбинантне вакцине у систему домаћина Е. цоли (К12), оптимизација кодона је извршена применом ЈЦат алата који је прилагодио ЦАИ и ГЦ садржај секвенце, чинећи је погодном за експресију у Е. цоли. Ин силико клонирање је такође изведено коришћењем експресионог вектора на бази плазмида пЕТ28а(+) да би се показала изводљивост секвенце за клонирање и прекомерну експресију да би се постигла повећана производња протеина рекомбинантне вакцине. Предвиђање секундарне структуре мРНК кодиране секвенцом химерног гена је направљено да покаже стабилност савијене конформације мРНК која ће утицати на ефикасан процес транслације у бактеријском домаћину. Стабилизирајуће мутације су створене додавањем нових дисулфидних веза у протеин вакцине јер би то допринело јачини природног протеина, чинећи га подложним додатним биохемијским, имунолошким и биотехнолошким истраживањима.

Слика 9 Имунска симулација заснована на Ц-иммсим серверу. а Генерација укупног антигена и одговарајућих антитела, б профил производње цитокина, ц и д генерација помоћних Т ћелија и укупан број (активних и у мировању) цитотоксичних Т лимфоцита, е одговор Б ћелија након примене вакцине

Слика 10 Молекуларна динамичка симулација. а Главна деформабилност ланца назначена шаркама, б НМА генерисани Б фактор који показује стабилност протеина, ц властита вредност да деформише структуру комплекса пристајања, д појединачни (љубичасти) % варијансе и кумулативна (зелена) структуре, е корелација матрице коваријансе (црвена), некорелирана (бела) или антикорелирана (плава) између парова атома, ф еластични мрежни модел који приказује повезане опруге између парова атома, тамније сиве означене круте опруге и обрнуто

бенефиције додатка цистанцхе-повећавају имунитет

Кликните овде да видите производе Цистанцхе Енханце Иммунити

【Затражите више】 Е-пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Вхатс Апп: 0086 18599088692 / Вецхат: 18599088692

Закључак

У овом раду, ми смо искористили приступ обрнуте вакцинологије за ин силицо дизајнирање поливалентне мулти-подјединичне пептидне вакцине против хумане лајшманијазе (и висцералне и кожне) која би могла да пружи хетерологну заштиту од уобичајених паразита лајшманије који инфицирају људе и, према томе, може се сматрати широког спектра по природи. Исто би се могло користити за општи програм вакцинације за контролу и искорењивање болести као комплементарна стратегија заједно са тренутно доступним хемотерапијским агенсима. Поред тога, користили смо ИЛ-12 као природни адјуванс уместо било ког нехуманизованог синтетичког пептида. Коришћење ИЛ-12 као помоћног средства ће повећати имуногеност вакцине без изазивања нежељених нежељених ефеката у телу домаћина. Под условом да се пептид вакцине састоји од низа високо конзервираних и потенцијално имуногених пептида добијених од пет врста патогене лајшманије, корисно је изазвати унакрсни имунитет код вакцинисаних појединаца, тако да има и терапеутске и профилактичке предности. Различите строге имуноинформатичке анализе које користе неколико компјутерских алата откриле су да је предложена вакцина имуногена, стабилна и репродуцибилна као рекомбинантни протеин и безбедна за испитивања на људима. Ипак, остаје да се изврши експериментална валидација како би се гарантовало правилно изазивање заштитног и дуготрајног имунитета и искључила токсичност.

Референце

1. Де-Брито РЦФ, Цардосо ЈМО, Реис ЛЕС, Виеира ЈФ, Матхиас ФАС, Роатт БМ, Агиуар-Соарес РДДО, Руиз ЈЦ, Ресенде ДМ ет ал. (2018) Пептидне вакцине за лајшманиозу. Фронт Иммунол 9:1043

2. Оквор И, Узонна Ј (2016) Друштвено и економско оптерећење хумане лајшманиозе. Ам Ј Троп Мед Хиг 94(3):489–493. хттпс://дои. орг/10.4269/ајтмх.{8}}

3. Мутисо ЈМ, Мацхариа ЈЦ, Гицхеру ММЈ (2010) Биомед Рес 24(1):16–25. хттпс://дои.орг/10.1016/С1674-8301(10)60004-8

4. Гиллеспие ПМ, Беаумиер ЦМ, Стрицх У, Хаивард Т, Хотез ПЈ, Боттаззи МЕ (2016) Статус истраживања вакцине и развоја вакцина за лишманијазу. Вакцина 34(26):2992–2995. хттпс:// дои.орг/10.1016/ј.ваццине.2015.12.071

5. Јосхи С, Рават К, Иадав НК, Кумар В (2014) Сиддики МИ и Дубе А (2014) Висцерална лишманијаза: напредак у развоју вакцине путем класичних и молекуларних приступа. Фронт Иммунол 5:380. хттпс://дои.орг/10.3389/фмму.2014.00380

6. Кхатоон Н, Пандеи РК, Прајапати ВК (2017) Истраживање секреторних протеина Леисхманиа за дизајнирање вакцине са више епитопа Б и Т ћелија коришћењем имуноинформатичког приступа. Сци Реп 7:8285

7. Гото И, Бхатиа А, Раман ВС, Лианг Х, Мохаммад Р, Пицоне АФ, Видал СЕЗ, Ведвицк ТС ет ал (2011) КСАЦ, први дефинисани кандидат за полипротеинску вакцину за висцералну лајшманијазу. Цлин Ваццине Иммунол 18(7):1118–1124. хттпс://дои.орг/10.1128/ЦВИ. 05024-11

8. Кедзиерски Л (2010) Вакцина против лајшманијазе: где смо данас? Ј Глоб Инфецт Дис 2(2):177–185. хттпс://дои.орг/10.4103/0974- 777Кс.62881

9. Нагилл Р, Каур С (2011) Кандидати за вакцину за лишманијазу: преглед. Инт Иммунопхармацол 11(10):1464–1488. хттпс://дои.орг/ 10.1016/ј.интимп.2011.05.008

10. Цолер РН, Реед СГ (2005) Вакцине друге генерације против лајшманијазе. Трендс Параситол 21(5):244–249

11. Фернандез Л, Царрилло Е, Санцхез-Сампедро Л, Санцхез Ц, Ибарра Менесес АВ, Јименез МА, Алмеида ВДА, Естебан М ет ал (2018) Антигеност антигена ц-киназе активираног Леисхманиа (ЛАЦК) у мононуклеару периферне крви људи ћелије, и заштитни ефекат приме-боост вакцинације са пЦИ-нео-ЛАЦК плус атенуираним ЛАЦК-експримирајућим вирусима вакциније код хрчака. Фронт Иммунол 9:843. хттпс://дои.орг/10.3389/фмму.2018.00843

12. Келли БЛ, Стетсон ДБ, Лоцкслеи РМ (2003) Леисхманиа мајор ЛАЦК антиген је неопходан за ефикасну паразитизацију кичмењака. Ј Екп Мед 198(11):1689–1698. хттпс://дои.орг/10.1084/јем.{8}}

13. Де Мендонца СЦ, Цисне-Финкелстеин Л, Матос ДЦ (2015) Кинетопластидни мембрански протеин-11 као кандидат за вакцину и фактор вируленције у Леисхманији. Фронт Иммунол 6:524. хттпс://дои.орг/ 10.3389/фмму.2015.00524

14. Јосхи ПБ, Келли БЛ, Камхави С, Сацкс ДЛ, МцМастер ВР (2002) Циљана делеција гена код Леисхманиа мајор идентификује леисхманолисин (ГП63) као фактор вируленције. Мол Биоцхем Параситол 120(1):33–40. хттпс://дои.орг/10.1016/с0166-6851(01)00432-7

15. МцМахон-Пратт Д, Родригуез Д, Родригуез ЈР, Зханг И, Мансон К, Бергман Ц, Ривас Л, Родригуез ЈЛ ет ал (1993) Рекомбинантни вируси вакциније који експримирају ГП46/М-2 штите од инфекције Леисхманиа. Инфецт Иммун 61(8):3351–3359

16. Холакуиее М, Махдави М, Зухаир МХ, Аболхасани М (2012) Промастиготи обогаћени протеином топлотног шока Леисхманиа мајор изазивају Тх2 имуни одговор код БАЛБ/ц мишева. Иран Биомед Ј 16(4):209–217. хттпс://дои.орг/10.6091/ибј.1098.2012

17. МацЛеан Л, Прице Х, О'Тооле П (2016) Истраживање пута извоза Леисхманиа хидрофилног ацилираног површинског протеина Б (ХАСПБ) методама снимања живих ћелија. Методе Мол Биол 1459: 191–203. хттпс://дои.орг/10.1007/978-1-4939-3804-9_13

18. Махарана БР, Тевари АК, Сингх В (2015) Преглед кинетопластидног парафагеларног штапа. Ј Парасит Дис 39(4):589–595. хттпс:// дои.орг/10.1007/с12639-014-0422-к

19. Махмоудзадех НХ, МцКерров ЈХ (2004) Леисхманиа тропица: цистеинске протеазе су неопходне за раст и патогеност. Екп Параситол 106 (3–4): 158–163. хттпс://дои.орг/10.1016/ј.екппара. 2004.03.005

20. Мундоди В, Куцкноор АС, Гедаму Л (2005) Улога Леисхманиа (Леисхманиа) цхагаси амастиготе цистеин протеазе у преживљавању путоносних паразита: студије поремећаја гена и инхибиције антисенс мРНА. БМЦ Мол Биол 6:3. хттпс://дои.орг/10.1186/ 1471-2199-6-3

21. Рогерс МЕ (2012) Улога протео фосфогликана лешманије у преносу пешчане мушице и инфекцији домаћина сисара. Фронт Мицробиол 3:223. хттпс://дои.орг/10.3389/фмицб.2012.00223

22. Бховмицк С, Али Н (2009) Идентификација нових Леисхманиа доновани антигена који помажу у дефинисању корелата заштите посредоване вакцином код висцералне лајшманијазе. ПЛоС Оне 4(6):е5820. хттпс:// дои.орг/10.1371/јоурнал.поне.0005820

23. Ассис ТМ, Манцини ДТ, Рамалхо ТЦ, да Цунха ЕФФ (2014) Ин силицо студија о Леисхманиа доновани - тубулин и инхибитори. Ј Цхем. хттпс://дои.орг/10.1155/2014/492579