Цистанцхе Херба има антидепресивну ефикасност код хроничног непредвидивог стреса

Контакт: Аудреи Ху Вхатсапп/хп: 0086 13880143964 Е-пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Ианг Ли, ет ал

АПСТРАКТАН

Цистанцхе тубулоса, једна врста Цистанцхес Херба, недавно је потврђено да има антидепресивну ефикасност код пацова инхроног непредвидивог стреса (ЦУС) обнављањем хомеостазе цревне микробиоте. У овом раду, циљ нам је да истражимо метаболички профил Ц. тубулоса код нормалних и ЦУС-индукованих депресивних модела пацова ин витро и ин виво. Користећи УПЛЦ-К-ТОФ-МС, ин витро гастроинтестинални метаболизамЕкстракт Цистанцхе тубулоса(ЦТЕ) је процењен и код нормалних и код ЦУС пацова. Истовремено, ин виво метаболизам ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)код нормалних и депресивних пацова је такође испитиван у урину и фецесу пацова. Укупно 20 и 26 метаболита је окарактерисано из ин витро и ин вивометаболизма код нормалних и ЦУС пацова, респективно. ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)се метаболише у агликоне и продукте разградње фенилетаноидних гликозида (ПхГ) и иридоидних гликозида, било нормалном или депресивном цревном микробиотом пацова ин витро. Метаболити фазе ИИ агликона и производи разградње ПхГс и иридоидних гликозида били су главни метаболити у урину и фецесу пацова. Поред тога, метаболичка способност стварања секундарних гликозида и агликона у депресивној цревној микробиоти пацова била је много слабија од оне у нормалној цревној микробиоти пацова, што се приписује поремећеним гликозидним хидролазама које производи цревна микробиота код пацова са депресијом ЦУС. Резултати ове студије поставили су основу за разумевање метаболичког процеса и терапијског механизма антидепресивног својства ЦТЕ.

Кључне речи: Цистанцхе тубулоса, ДепресијаМетаболизам, Ин витро, Ин виво, Интестинална микробиота

1. Представљање

Цистанцхес Херба је званично забележена као осушене сочне стабљике Цистанцхе десертицола (ИЦ Ма) и Ц. тубулоса (Сцхренк), које се користе за лечење недостатка бубрега, импотенције, женског неплодности, морбидлеукореје, обилне метрорагије и сенилног затвора [1]. Савремена фармаколошка истраживања су показала да Цистанцхес Херба поседује различите биолошке активности као што су анти-неуродегенерација, имунорегулација и анти-инфламација [2,3]. Наше претходне истраге су то потврдилеЕкстракт Цистанцхе тубулоса(ЦТЕ), који се састоје од 48,6 процената фенилетаноидних гликозида (ПхГ), 6,9 процената иридоидних гликозида и 20,0 процената укупних сахарида, могу значајно да ублаже депресивне симптоме код депресивних пацова изазваних хроничним непредвидивим стресом (ЦУС) обнављање хомеостазе цревне микробиоте [4]. Недавне студије показују да су промене у саставу цревне микробиоте биле повезане са развојем и напредовањем депресије [5,6]. Релативна заступљеност микробних родова била је значајно поремећена код пацова са моделом ЦУС-депресива у поређењу са нормалним контролама [7]. Код пацијената са депресијом, разноврсност и богатство цревне микробиоте су такође значајно измењени [8]. Штавише, различита једињења укључујући фенилетаноидне гликозиде (ПхГс) и иридоидне гликозиде су сматрана главним састојцима Цистанцхес Херба [2,3], који су се лако метаболизовали у своје секундарне гликозиде и агликоне укључујући хидрокситиросол (ХТ), 3,{{15}етилдихидроксил гликозид, дегликозилована генипосидна киселина, итд. од стране људске цревне микробиоте. Ови метаболити се лакше апсорбују кроз црева и испољавају биолошку активност у складу са компонентом прототипа[9–11]. Стога сматрамо да ће током настанка и развоја депресије, поремећај структуре цревне микрофлоре неизбежно утицати на метаболизам оралних традиционалних кинеских лекова (ТЦМ) у гастроинтестиналном тракту, осим што утиче на физиолошко стање домаћина. Већина постојећих метаболичких података за Цистанцхес Херба потиче из метаболичких студија на здравим животињама[12–15]. Стога би било од већег клиничког значаја истражити метаболички профил ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)у патолошком стању у расветљавању његових биоактивних компоненти и разумевању механизма деловања за његову антидепресивну ефикасност.

У овој студији, циљ нам је да окарактеришемо метаболичке профиле ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)и код здравих и код пацова депресивних модела изазваних ЦУС-ом, течном хроматографијом ултра-перформансе квадруполном временском масеном спектрометријом (УПЛЦ-К-ТОФ-МС). Желудачни сок, цревна течност и микробиота нормалних и депресивних патолошких пацова коришћени су за симулацију метаболичког процеса ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)у гастроинтестиналном тракту ин витро, независно и узастопно. Метаболити ин виво су такође разјашњени након оралне примене ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)код нормалних и ЦУС пацова. Ова студија пружа нове увиде у метаболизам и активне метаболите ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)за депресију.

2. Материјал и методе

2.1. Материјал

Осушене стабљике Ц. тубулоса сакупљене су из округа Хетиан (Сињианг, Кина). Узорке узорака ваучера је потврдио проф. Ксиаобо Ли и депоновао их је у хербаријум Фармацеутског факултета Универзитета Јиао Тонг у Шангају (Шангај, Кина). Метода екстракције је коришћена као што је наведено у нашој претходној публикацији [4]. ТхеЕкстракт Цистанцхе тубулоса(ЦТЕ) узорци су чувани на 4 степена и поново растворени у стерилној води пре употребе. Стерилни водени раствори ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)узорци су затим филтрирани кроз 0.22 μм мембрану, а филтрати су сакупљени у стерилне епрувете.

Ехинакозид је обезбедила лабораторија др Пенгфеи Ту, Пекиншки универзитет (Пекинг, Кина). Актеозид, изоактеозид, 2′-ацетилактеозид и цистанозид А су купљени од Сицхуан Веикеки БиологицалТецхнологи Цо., Лтд. (Ченгду, Кина). Хидрокситиросол, кафеинска киселина, 3,4-дихидроксибензенпропионска киселина, 3-хидроксифенилпропионска киселина и 3-фенилпропионска киселина су купљени од Аладдин ИндустриалИнц. (Шангај, Кина). Чистоћа сваке компоненте је одређена да буде > 95 процената помоћу ХПЛЦ-УВ. ХПЛЦ ацетонитрил је набављен од Мерцк-а (Дармстадт, Немачка). Дејонизована вода је припремљена од дестиловане воде коришћењем Милли-К система за пречишћавање воде (Миллипоре, Бедфорд, МА, САД). Сви остали коришћени реагенси и хемикалије су биле аналитичке чистоће.

2.2. Експерименти на животињама

Мужјаци Спрагуе-Давлеи пацова (200 ± 20 г) набављени су од компаније Беијинг Витал Ривер Лаборатори Анимал Тецхнологи Цомпани (Пекинг, Кина) и смештени у Центру за лабораторијске животиње Шангајског универзитета ЈиаоТонг (Шангај, Кина). Животиње су биле групно-држане под контролисаном собном температуром (25 ± 2 степена, 55 ± 10 процената релативне влажности) са циклусом светло-мрак од 12:12 х. Пацовима је дозвољен слободан приступ редовним лабораторијским пацовима који се хране и воде током 1 недеље. Објекти и протоколи за животиње су одобрени од стране Комитета за етику животиња на Шангајском универзитету Јиао Тонг (Шангај, Кина).

Након једнонедељне аклиматизације, дванаест наивних пацова насумично је подељено у две групе (н=6), контролну групу и групу са хроничним непредвидивим стресом (ЦУС). ЦУС пацови су развијени као у нашем претходном извештају [4], који су били подвргнути разним стресорима: бели шум (100 дБ) 1 х, стробоскопско осветљење ниског интензитета преко ноћи (120 бљескова/мин), недостатак воде 24 х, празан флаше са водом 1 х (након лишења воде), ускраћивање хране 24 х, физичко обуздавање (1-2 х), принудно пливање (5 мин), запрљан кавез 24 х (200 мЛ воде у 100 г подлоге од струготине), штипање репа ( 1 мин), шок у трајању од 30 мин, нагиб кавеза од 45 степени током 24 х, и осветљење преко ноћи (12 х). Стресори су примењивани континуирано и насумично током 4 недеље, детаљан распоред је описан у Табели С1. Након 4 недеље стреса, тест преференције сахарозе, тест на отвореном пољу и тест храњења са сузбијањем новости су изведени као што је претходно описано [4]. Нацрт ЦУС-а и тест понашања приказан је на слици С1. Након тестова понашања, најмање 4 фекалне пелете су добијене од сваког пацова и стављене у стерилне коничне епрувете за ин витро анализу ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)метаболизам.

2.3. Гастроинтестинални метаболизам ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)нормалним и ЦУС пацовима ин витро

2.3.1. Метаболизам ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)у симулираним желучаним и цревним соковима

Педесет милиграма ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)су додати у 10 мЛ симулираног желудачног сока и цревног сока, респективно. Затим ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)је инкубиран на 37 степени 4 х у желудачном соку и 6 х у цревном соку. Култивисана смеша (1 мЛ) је угашена са 3 мЛ водом засићеног н-бутанола одмах у 0 и 4 х у желудачном соку, а на 0 и 6 х у цревном соку. Метода обраде коришћеног узорка је као што је претходно описано [9].

2.3.2. Метаболизам ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)нормалном и ЦУС цревном микробиотом пацова

Свежи нормални и ЦУС фекални узорци пацова су прво помешани и хомогенизовани са 25 пута већом запремином ГАМ бујона. Седименти су уклоњени филтрацијом кроз три комада газе. Суспензија је затим инкубирана на 37 степени у анаеробном инкубатору у коме је ваздух замењен мешавином гаса (Х2 5 процената, ЦО2 10 процената, Н2 85 процената). Педесет милиграма ЦТЕ је одвојено додато у 5 мЛ нормалне и ЦУС фекалне суспензије пацова, а суспензија је инкубирана на 37 степени током 48 х. Култивисана смеша је уклоњена и екстрахована водом засићеним н-бутанолом у 0, 12, 24 и 48 х. Метода обраде узорка је претходно описана [9].

2.3.3. Секвенцијски метаболизам ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)помоћу желудачног сока, цревног сока, нормалног и ЦУС цревне микробиоте пацова

Прво, 100 мг ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)је додат у 1{{10}} мЛ симулираног желудачног сока и инкубиран на 37 степени током 4 х. Цела реакција је угашена 3 пута већом запремином н-бутанола засићеног водом и центрифугирана на 3000 рпм током 15 минута, након чега је уследило испаравање супернатанта под струјом азота гас на 37 степени. Друго, остатак је поново растворен у 0,4 мЛ стерилне воде, додат у 8 мЛ симулираног цревног сока и инкубиран на 37 степени током 6 х. На исти начин је припремљен и узорак са желудачним соком. Коначно, остатак је поново растворен у 0,3 мЛ стерилне воде, додат у 6 мЛ нормалне и ЦУС фекалне суспензије пацова, респективно, и инкубиран на 37 степени током 48 х у анаеробиккубатору. Један милилитар реакције је угашен са 3 мЛ воде засићеног н-бутанола одмах на 0 и 4 х у желудачном соку, на 0 и 6 х у цревном соку и 0, 12, 24 и 48 х у цревној микробиоти пацова. . Узорак је обрађен идентично ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)у симулираном желудачном соку.

2.4. Метаболизам ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)нормалним и ЦУС пацовима ин виво

Сваки пацов у две групе је затим смештен у индивидуални метаболички кавез. Након гладовања преко ноћи које је омогућавало само слободан приступ води, свим пацовима је орално дато 2 мЛ воде преко агастричне сонде. Празни узорци урина и фекалија су прикупљени од свих пацова од 0 х до 12 х. Даље, ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)(400 мг/кг) је примењен сондом. Узорци урина и фекалија су прикупљени од 0 х до 24 х. Сви узорци урина и фекалија су одмах ускладиштени на -80 степени.

Узорци урина и фекалија нормалних и ЦУС пацова су претходно третирани као што је претходно описано [12]. Сви добијени узорци су анализирани помоћу УПЛЦ-К-ТОФ-МС.

2.5. Аналитичка метода

УПЛЦ је изведен на Ватерс АЦКУИТИ УПЛЦ систему (ВатерсЦорп., Милфорд, МА, САД) са АЦКУИТИ УПЛЦ БЕХ Ц18 колоном (100 мм × 2,1 мм ид, 1,7 μм, Ватерс Цорп. , САД) градијентним елуирањем коришћењем {{10}}.1 процента мравље киселине ацетонитрила (А) и 0.1 процента мравље киселине у води (Б) при брзини протока од 0,4 мЛ/мин . Профил градијента је био: 0–5 мин (А: 5–20 процената), 5–7,5 мин (А: 20–30 процената), 7,5–10 мин (А: 30–70 процената), 10–11 мин (А : 70–100 процената), и држао се 1,5 мин. Градијент је враћен на 5 процената за 0,5 мин и држан је 2,5 мин за следећу вожњу. Запремина ињекције била је 3 μЛ. Температура пећи на колони је подешена на 35 степени.

Масена спектрометрија је изведена коришћењем Ватерс Вион ИМС масеног спектрометра (Ватерс Цорп., Милфорд, МА, САД). Јонизација је изведена у негативном електроспреј (ЕСИ−) режиму. МС параметри су били следећи: капиларни напон, −2.0 кВ; напон конуса, 20 В; температура извора, 120 степени; температура десолватације, 500 степени; токови гаса конуса и десолватације, 50 и 1000 Л/х, респективно. За прецизно мерење масе, леуцин-енкефалин је коришћен као блокада за стварање јона [М–Х]− (м/з 554,2615). Експеримент МСЕ (Масс СпецтрометриЕлеватедЕнерги) у две функције скенирања изведен је на следећи начин: функција 1 (ниска енергија): м/з 50–1000, време скенирања 0,25 с, кашњење између скенирања 0,02 с, енергија судара 6 еВ; функција 2 (висока енергија): м/з50–1000, време скенирања 0,25 с, кашњење између скенирања 0,02 с, рампа енергије судара од 20–45 еВ.

2.6. Обрада података

Подаци су обрађени коришћењем софтвера УНИФИ 1.8.1 (Ватерс Цорп., Милфорд, МА, САД) за идентификацију метаболита у оквиру тачне масе сирових података потпуног скенирања прикупљених преко МСЕ. Једињења су идентификована на основу тачне масе, фрагмената у масспектрометрији високе енергије. Праг интензитета је постављен на 100,0 број. Идентификација циља, толеранција подударања фрагмената и други параметри су аутоматски подешени.

3. Резултати

3.1. Промене у понашању у ЦУС-у изазвале су депресију пацова

Пацови са симптомима депресије изазваним ЦУС-ом су процењени тестовима понашања укључујући тест преференције сахарозе, тест отвореног поља и тест храњења са сузбијањем новости. Студентов т-тест је открио да су преференција сахарозе у тесту преференције сахарозе (п < .001),="" укупна="" пређена="" раздаљина="" у="" тесту="" отвореног="" поља="" (п="">< .001)="" и="" латенција="" за="" јело="" у="" тесту="" храњења="" са="" сузбијањем="" новости="" (п="">< .01)="" били="" значајно="" различито="" у="" поређењу="" са="" контролном="" групом="" након="" 4-недељног="" третмана="" цус-ом="" (слика="" 1).="" ови="" налази="" су="" показали="" да="" је="" модел="" хроничног="" непредвидивог="" стреса="" успешно="">

3.2. Карактеризација хемијских састојака ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)

Свеобухватна анализа прототипних састојака ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)је спроведен помоћу УПЛЦ-К-ТОФ-МС. Укупно 27 састојака из ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)су откривени и условно окарактерисани, укључујући 20 ПхГ, 5 иридоидних и иридоидних гликозида и 2 олигосахарида. Детаљне информације, укључујући време задржавања, тачне МС и МС/МС јоне фрагмената, наведене су у пратећим информацијама (Табела С2) како би се пружио увид у структуру ових хемијских састојака. УПЛЦ-К-ТОФ-МС укупни јонхроматограм (ТИЦ) ЦТЕ је приказан на слици С2.

3.3. Гастроинтестинални метаболизам ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)нормалним и ЦУС пацовима ин витро

У овој студији, потенцијални метаболити ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)код нормалних и ЦУС пацова ин витро су откривени из ТИЦ-а и идентификовани комбинацијом елементарних композиција и масених спектра МС/МС фрагмента након поређења са контролним узорцима. Сви метаболити из ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)у симулираним желучаним и цревним соковима, нормална и ЦУС цревна микробиота пацова су наведена у табели 1.

3.3.1. Метаболизам ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)у симулираним желучаним и цревним соковима

Седам метаболита ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)у симулираном желудачном соку су условно идентификовани тачним информацијама о маси и фрагментима МСЕ: М1 (м/з315.1074, Ц14Х20О8, 1.66 мин), М4 (м/з 459.1501, Ц20Х28О12,2.36 мин), М4 (м/з,1035, м/з,1035 2,60 мин), М7 (м/з 179,0338, Ц9Х8О4, 2,85 мин), М12 (м/з 785,2481, Ц35Х46О20, 4,77 мин), М16 (м/з 827,2580, Ц37Х48О23 мин, 6 м/з 785,2481, Ц35Х46О20, 4,77 мин), М16 (м/з 827,2580, Ц37Х58О731 мин, 61 з .1968, Ц29Х36О15, 5,81 мин). Дегликозилација, дехидроксилација, дехидрогенација и изомеризација се сматрају главним метаболичким путевима за ЦТЕ у желудачном соку. Утврђено је да М4 и М5 имају молекулску масу од 2 Да и 16 Да нижу од њихове прототипске компоненте, декафеоилактеозида, и на тај начин идентификовани као његови дехидрогенисани и дехидроксиловани производи, респективно. М12 је идентификован као изомер ехинакозида, који производи исте јоне као и ехинакозид на м/з 623.2178, 477.1601, 315.1055, 161.0237.

Исти метаболити су откривени након ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)инкубација у цревима. Важно је напоменути да се кафеоил група на позицији Ц-6′ у ПхГс лако метаболише дигестивним ензимима у цревном соку да би се произвели декафеил метаболити и кафеинска киселина.

3.3.2. Метаболизам ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)нормалном и ЦУС цревном микробиотом пацова

Укупно 20 метаболита биотрансформисаних из ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)у нормалној ратинтестиналној микробиоти су откривени и идентификовани (слика 2). Из тих резултата, примећено је да су ПхГс деградирани до агликон хидрокситирозола (ХТ) М2 (м/з 153,0550, Ц8Х10О3, 1,78 мин), и кафеинске киселине (ЦА) М7 (м/з 179,0338, Ц9Х8О5 мин, 2). су даље метаболизовани у М3 (м/з 163,0390, Ц9Х8О3, 2,02 мин), М6 (м/з181,0501, Ц9Х10О4, 2,76 мин), М10 (м/з 195,0655, Ц10Х12О4, 4,115 мин. , Ц9Х10О3, 4,36 мин) кроз дехидроксилацију, редукцију и метилацију. Поред тога, централни метаболички путеви који производе директне метаболите прототипских једињења ПхГ из ЦТЕ у нормалној цревној микробиоти пацова су редукција, метоксилација, дегликозилација, декафеоил, дехидрогенација и изомеризација.

После инкубације у цревној микробиоти пацова изазваном депресијом, ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)је претворен у 20 метаболита истим метаболичким путевима као и нормални пацови.

3.3.3. Секвенцијални метаболизам ЦТЕ помоћу желудачног сока, цревног сока, нормалне и ЦУС цревне микробиоте пацова

Након секвенцијалне инкубације у желудачном соку, цревном соку, нормалној и ЦУС цревној микробиоти пацова, ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)се метаболише у 14 метаболита (укључујући 8 са желучаним соком, 7 са цревним соком, 11 са нормалном и 10 са ЦУС цревном микробиотом пацова). Међу њима, М2(ХТ) и М11 (3-хидроксифенилпропионска киселина, 3-ХПП) су били коначни метаболити ПхГ након секвенцијалне инкубације ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)у желудачном соку, цревном соку и цревној микробиоти. Није било значајне разлике у метаболитима између нормалног и ЦУС пацова.

М8, М9, М14, М17, М19 и М20 откривени су само у независном метаболизму ЦТЕ нормалном и ЦУС цревном микробиотом пацова. Ови метаболити су углавном били метаболички интермедијери који су у потпуности метаболизовани у коначне метаболите у проучавању секвенцијалног метаболизма ЦТЕ и стога их је тешко открити.

3.3.4. Разлике између метаболичке стопе ЦТЕ према нормалној и ЦУС ратинтестиналној микробиоти

Да би се разјасниле разлике између метаболичке стопе ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)бинормална и ЦУС цревна микробиота пацова, релативни садржај 27 прототипских једињења и 20 метаболита након инкубације са желудачним соком, цревним соком, нормалне и ЦУС цревне микробиоте пацова одређивани су одвојено и узастопно (табеле С3 и С4). Резултати су показали да иако није било значајних разлика између ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)метаболита нормалних и депресивних пацова, примећена је значајна разлика у њиховим метаболичким стопама. На пример, Ц2 и Ц5 су идентификовани као 8-епилоганска киселина или њен изомер. Потпуно су метаболизовани у нормалним узорцима у року од 12 х инкубације. Међутим, у патолошки депресивној цревној микробиоти пацова, они су темељно метаболисани након 48 х инкубације. Било је евидентно да је брзина метаболизма код нормалног пацова била бржа него код ЦУС пацова. Слични резултати су откривени из Ц18 (изоактеозид). Штавише, вреди напоменути да је површина врха М12 (изомеризација ехинакозида) и М16 (изомеризација тубулозида А) у нормалним узорцима била много већа од оне у ЦУС узорцима, што указује да је реакција изомеризације ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)био је чешћи у нормалној цревној микробиоти пацова него код депресивне цревне микробиоте пацова.

3.4. Метаболизам ЦТЕ код нормалног и ЦУС пацова ин виво

Поређењем биолошких узорака групе третиране ЦТЕ са празним биолошким узорцима, укупно 26 метаболита (једињење 1–26) ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)откривени су иннормални и ЦУС пацови (Табела 2). Типични УПЛЦ хроматограми нормалних и ЦУС узорака урина пацова представљени су на слици 3.

3.4.1. Карактеризација метаболита ЦТЕ у нормалном и ЦУС ратурине

Укупно 18 ин виво метаболита ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)у нормалном узорку урина пацова су пробно идентификовани. Метаболити деградације ПхГ укључујући ХТ и ЦА, и њихова даља сулфатизација (једињење 1, 2, 3, 5, 8 и 16), метилација (6, 21, 22 и 24) и метоксилација (13 и 14) су били метаболити главни метаболити у нормалном урину пацова. Иридоидни гликозиди су се лако метаболизовали у агликоне (23, 25 и 26) кроз дегликозилацију. Важно је напоменути да ниједна прототипна компонента није откривена у нормалном узорку урина пацова.

У узорку урина депресивног пацова, 22 метаболита ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)су откривени и окарактерисани. Једно прототип једињења, 8-епилоганска киселина, откривен је у патолошком урину пацова. Остали метаболити су били у складу са онима пронађеним у нормалном урину пацова, укључујући сулфатиране метаболите (1, 2, 3, 8, 10 и 16), метиловане метаболите (6, 11, 19 и 22), метоксиловане метаболите (13 и 14) ХТ и ЦА, и теагликони иридоидних гликозида (25 и 26).

3.4.2. Карактеризација метаболита ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)у нормалном и ЦУС пацовском измету

У овој студији, само један метаболит (једињење 20, 3-ХПП) ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)је идентификован у нормалном измету пацова. Већина ПхГ је прво разграђена у ЦА и последично је подвргнута даљем метаболизму до свог главног микробног метаболита, 3-ХПП. У узорку фекалија од ЦУС пацова, 3 метаболита су условно окарактерисана, укључујући сулфатизовани 3-ХПП (једињење 16) и сулфатни ХТ (једињења 2 и 3).

3.4.3. Разлике између ин виво метаболита ЦТЕ код нормалних и ЦУС пацова

Након оралне примене ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса), ин виво метаболити су показали очигледне разлике код здравих и депресивних пацова. 21 метаболит (једињење 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 и 19–26) је откривен иу здравим и ЦУС узорцима пацова. Једињење 23 (дегликозилованагенипозидна киселина) је идентификовано само у узорцима здравих пацова, док једињења 4 (ХТ), 7 (8-епилоганска киселина), 15 (3, 4-дихидроксибензенпропионска киселина) и 18 ({{ 19}}ХПП глукуронидна коњугација) откривени су само у узорцима пацова ЦУС модела. Укратко, прототипни састојци су откривени само код ЦУС пацова, док су метаболити више фазе ИИ откривени код нормалних пацова.

4. Дискусија

У овој студији, три ин витро модела инкубације, укључујући желудачни сок, цревни сок, нормалну и ЦУС цревну микробиоту пацова, коришћена су независно и узастопно да би се истражио гастроинтестинални метаболички профил ЦТЕ.(Екстракт Цистанцхе тубулоса)ин витро. Утврђено је да ПхГ и иридоидни гликозиди у ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)су се лако метаболисали у своје секундарне гликозиде и агликоне од стране депресивне цревне микробиоте пацова изазване ЦУС-ом. Након тога, ин виво метаболизам ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)код нормалних и ЦУС пацова је такође верификовано. Предложени метаболички путеви за ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)код здравих и депресивних пацова изазваних ЦУС-ом приказани су на слици 4. ПхГс, као што су ехинакозид и актеозид, су се метаболисали у ХТ и ЦА, а ЦА је подвргнут даљем метаболизму до свог главног микробног метаболита, 3-ХПП. ХТ, ЦА и 3-ХПП су затим метаболисани у своје сулфатне, метиловане и метоксиловане метаболите. Иридоидни гликозиди, укључујући генипосидну киселину, канканозид А и канканозид Н, метаболизирани су у своје агликоне путем дегликозилације. Ово је даље показало да ПхГ и иридоидни гликозиди у ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)су се лако метаболисали у секундарне гликозиде и агликоне код ЦУС пацова. Ови метаболити обично показују бољу цревну апсорпцију и биорасположивост да се даље апсорбују у крв да би испољили биолошку активност [16–18]. Вреди напоменути да је изомеризација била преовлађујућа за ПхГ у гастроинтестиналном тракту, релевантни метаболити су идентификовани након упоређивања са УПЛЦ временом задржавања њихових прототипних једињења на основу оптимизованог идеалног УПЛЦ градијентног профила.

Кафеинска киселина је била примарни производ разградње ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)депресивном патолошком цревном микробиотом пацова. Претходне публикације су објавиле да кафеинска киселина производи ефекте сличне антидепресивима у тесту присилног пливања код мишева. Ниво мРНА оба неуротрофичног фактора (БДНФ) у фронталном кортексу и ниво ТркБ мРНА у амигдали је значајно смањен након теста присилног пливања, а прво смањење је значајно инхибирано кафеинском киселином [19]. Хидрокситиросол је био агликон ПхГс, који штити неурогенезу и когнитивне функције спречавањем стресом изазване регулације неуралног протеина БДНФ [20]. Стога је потребно више пажње посветити неким биоактивним метаболитима (тј. ХТ и ЦА) трансформисаним цревном микробиотом након оралне примене.

Поред тога, садашњи налази пружају доказе да је код депресивне цревне микробиоте, метаболичка способност стварања секундарних гликозида и агликона била знатно слабија од ненормалне цревне микробиоте пацова. Разлог се вероватно може приписати депресијом изазваним структурним променама цревне микробиоте, што доводи до смањене активности метаболичких ензима које производи цревна микробиота [21]. Занимљиво је да је претходна студија показала да тип Бацтероидетес кодира најзаступљеније гене гликозидне хидролазе и полисахарид лиазе за хидролизу гликозида и цепање сложених угљених хидрата са механизмом елиминације [22]. Конкретно, Бацтероидес спп. укључујући Б. цаццае, Б. дореи, Б. финеголдии, Б. фрагилис, Б. интестиналис, Б. оватус, Б. тхетаиотаомицрон, Б. униформис и Б. ксиланисолвени су показали доминантан укупан број гена који кодирају ГХ и ПЛ. Парабацтероидес дистасонис такође поседује исте карактеристике [22]. Наше претходне студије су потврдиле да 28-дневна хронична непредвидива стресна стимулација смањује релативну бројност родова Бацтероидес, Парабацтероидес, Бутирицимонас и Веисселла, док је код пацова повећана количина Руминоцоццус и Деиноцоццус [4]. Важно је напоменути да су Бацтероидес и Парабацтероидес биле две најзаступљеније микробне таксоне које су чиниле приближно 20 процената релативног обиља код нормалних пацова. Након третмана ЦУС-ом, релативна количина Бацтероидес и Парабацтероидес нагло је опала на приближно 5 процената код депресивних моделних пацова. Према томе, ово ће неизбежно довести до смањења укупног броја ГХ и ПЛ ензима код ЦУС пацова, и даље ремети дегликозиловану реакцију ЦУС депресивне цревне микробиоте након оралне примене ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)код модела пацова.

5. Закључак

У овој студији, УПЛЦ-К-ТОФ-МС техника је успостављена и примењена за скрининг и идентификацију метаболитаЦистанцхе тубулосаектрацткод нормалних и ЦУС депресивних пацова ин витро и ин виво. Резултати су показали да ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)се метаболише у агликоне и продукте разградње ПхГс и иридоидних гликозида од стране здраве и депресивне цревне микробиоте. Након оралне примене ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса), метаболити фазе ИИ агликона и продукти разградње ПхГс и иридоидгликозида су се претежно налазили у урину пацова. Метаболичка способност генерисања секундарних гликозида и агликона у депресивној ратинтестиналној микробиоти била је много слабија од оне у цревној микробиоти нормалног пацова, што се приписује поремећеним гликозидхидролазама које производи цревна микробиота код пацова са депресијом ЦУС. Ова студија пружа нову перспективу за каснију перспективу развој ЦТЕ(Екстракт Цистанцхе тубулоса)као потенцијални антидепресив.

Признања

Овај рад је подржан грантовима из Националног кључног програма за истраживање и развој Кине (2017ИФЦ1702400).

Додатак А. Додатни подаци

Додатни подаци за овај чланак могу се наћи на мрежи на ХТТПС://дои.орг/10.1016/ј.јцхромб.2019.121728

Од: ' Ин витро и ин виво метаболизамЕкстракт Цистанцхе тубулосакод нормалних и хроничних непредвидивих депресивних пацова изазваних стресом' одИанг Ли, ет ал

---Часопис за хроматографију Б 1125 (2019) 121728

Референце

[1] Комисија за кинеску фармакопеју, Тхе Пхармацопеиа оф тхе Пеопле'с Републиц оф Цхина, 2015 ед., Цхина Медицал Сциенце Пресс, Пекинг, Кина, 2015, стр. 135 И део.
[2] И. Јианг, П.-Ф. Ту, Анализа хемијских састојака у врстама Цистанцхе, Ј. Цхроматогр. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] З. Фу, Кс. Фан, Кс. Ванг, Кс. Гао, Цистанцхес Херба: преглед његове хемије, фармакологије и фармакокинетике, Ј. Етхнопхармацол. (2017), хттпс://дои.орг/10.1016/ј.јеп.2017.10.015.
[4] И. Ли, И. Пенг, П. Ма, Х. Ианг, Х. Ксионг, М. Ванг, Ц. Пенг, П. Ту, Кс. Ли, Ефекти слични антидепресивимаЕкстракт Цистанцхе тубулосана пацовима од хроничног непредвидивог стреса кроз обнављање хомеостазе цревне микробиоте, Фронт. Пхармацол. (2018), хттпс://дои.орг/10.3389/фпхар.2018.00967.
[5] ЈА Фостер, МВ Неуфелд, Оса црева и мозга: како микробиом утиче на анксиозност и депресију, Трендс Неуросци. 36 (2013) 305–312.
[6] Е. Схервин, ТГ Динан, ЈФ Цриан, Недавни развоји у разумевању улоге цревне микробиоте у здрављу и болести мозга, Анн. НИ Ацад. Сци. 12 (2017) е0177977.
[7] И. Менг, Х. Јиа, З. Цхао, И. Ионг, З. Ианг, М. Ианг, З. Зоу, Варијације у цревној микробиоти и фекалном метаболичком фенотипу повезане са депресијом секвенцирањем 16С рРНА гена и ЛЦ/ МС-басед метаболомицс, Ј. Пхарм. Биомед. Анал. 138 (2017) 231–239.

[8] ЈР Келли, И. Борре, БЦ О', Е. Паттерсон, АС Ел, Ј. Деане, ПЈ Кеннеди, С. Беерс, К. Сцотт, Г. Молонеи, Пренос блуза: микробиота повезана са депресијом индукује неуробихејвиоралне промене код пацова, Ј. Псицхиатр. Рес.. 82 (2016) 109–118.
[9] Л. Ианг, П. Иинг, М. Ванг, П. Ту, Кс. Ли, Хумани гастроинтестинални метаболизам воденог екстракта Цистанцхес Херба ин витро: разјашњавање метаболичког профила на основу свеобухватне идентификације метаболита у желудачном соку, цревима сок, људске цревне бактерије и цревни микрозоми, Ј. Агриц. Фоод Цхем. 65 (2017) 7447–7456.
[10] И. Ли, Г. Зхоу, С. Ксинг, П. Ту, Кс. Ли, Идентификација метаболита ехинакозида које производе људске цревне бактерије коришћењем течне хроматографије ултра-перформансе/квадруполне масене спектрометрије времена лета, Ј. Агриц. Фоод Цхем. 63 (2015) 6764–6771.
[11] И. Ли, Г. Зхоу, И. Пенг, П. Ту, Кс. Ли, Скрининг и идентификација три типична метаболита фенилетаноидних гликозида из Цистанцхес Херба од стране хуманих цревних бактерија коришћењем УПЛЦ/К-ТОФ-МС, Ј. Пхарм. Биомед. Анал. 118 (2016) 167–176.
[12] Л. Ианг, П. Иинг, М. Ванг, Г. Зхоу, И. Зханг, Кс. Ли, Брзи скрининг и идентификација разлика између метаболита Цистанцхе десертицола и Ц. тубулоса воденог екстракта код пацова помоћу УПЛЦ- К-ТОФ-МС комбинована анализа препознавања образаца, Ј. Пхарм. Биомед. Анал. 131 (2016) 364–372.
[13] Ц. К, П. И, Б. Кс, З. В, Ц. Л, Л. Кс, Систематски карактеришу метаболите ехинакозида и актеозида из Цистанцхе тубулоса у плазми, жучи, урину и фецесу пацова на основу УПЛЦ-ЕСИ-К-ТОФ-МС, Биомед. Цхроматогр. 30 (2016) 1406–1415.
[14] И. Ванг, Х. Хао, Г. Ванг, П. Ту, И. Јианг, И. Лианг, Л. Даи, Х. Ианг, Л. Лаи, Ц. Зхенг, Приступ идентификацији секвенцијалних метаболита типичан фенилетаноидни гликозид, ехинакозид, заснован на течној хроматографији-време заробљавања јона
анализа масене спектрометрије лета, Таланта 80 (2009) 572–580.
[15] Ц. Јиа, Х. Схи, В. Јин, К. Зханг, И. Јианг, М. Зхао, П. Ту, Метаболизам ехинакозида, доброг антиоксиданса, код пацова: изолација и идентификација његових билијарних метаболита, Друг Метаб. Диспос. 37 (2009) 431–438.
[16] Ј. Ксу, ХБ Цхен, СЛ Ли, Разумевање молекуларних механизама интеракције између биљних лекова и цревне микробиоте, Мед. Рес. Рев. 37 (2017) 1140–1185.
[17] Х. Лиу, Ј. Ианг, Ф. Ду, Кс. Гао, Кс. Ма, И. Хуанг, Ф. Ксу, В. Ниу, Ф. Ванг, И. Мао, Апсорпција и диспозиција гинсенозида након оралног примена екстракта Панак нотогинсенг пацовима, Друг Метаб. Диспос. 37 (2009) 2290–2298.
[18] ЈМ Лапарра, И. Санз, С. Сцхаффер, Ф. Висиоли, Интеракције цревне микробиоте са функционалним компонентама хране и нутрацеутицима, Пхармацол. Рес. 61 (2010) 219–225.
[19] Х. Такеда, М. Тсуји, Т. Иамада, Ј. Масуиа, К. Матсусхита, М. Тахара, М. Иимори, Т. Мацумииа, Кафеинска киселина ублажава смањење експресије кортикалне БДНФ мРНА изазване излагањем принудном стрес пливања код мишева, Еур. Ј. Пхармацол. 534 (2006) 115–121.
[20] А. Зхенг, Л. Хао, Ц. Ке, Кс. Јие, З. Ксуан, Л. Иуан, Ц. Цонг, Ј. Лиу, З. Фенг, Примена хидрокситирозола код мајке побољшава неурогенезу и когнитивне функције код пренаталног стреса потомство, Ј. Нутр. Биоцхем. 26 (2015) 190–199.
[21] Х. Ли, Ј. Хе, В. Јиа, Утицај цревне микробиоте на метаболизам и токсичност лекова, Стручно мишљење. Друг Метаб. Токицол. 12 (2016) 31.
[22] КА Ел, Ф. Армугом, ЈИ Гордон, Д. Раоулт, Б. Хенриссат, Обиље и разноврсност ензима активних на угљеним хидратима у микробиоти људског црева, Нат. Рев. Мицробиол. 11 (2013) 497–504.