Ин витро инхибиција реналне секреције ОЦТ2 и МАТЕ1 антиеметичким лековима
Mar 18, 2022
Блажени Џорџ1, Ксиа Вен1, Едгар А. Јаимес2, Мелание С. Јои3,4,5,†и Лаурен М. Алексунес
Апстрактан:Транспортер органских катјона 2 (ОЦТ2) и протеин за екструзију више лекова и токсина 1 (МАТЕ1) посредују у бубрежној секрецији лекова. Недавне студије сугеришу да ондансетрон, 5-ХТ3 антагонист лек који се користи за спречавање мучнине и повраћања, може инхибиратиОЦТ2- и МАТЕ1-посредовани транспорт. Сврха ове студије је била да се тестира способност пет 5- ХТ3 антагониста да инхибирајуОЦТ2и транспортери МАТЕ1. Транспорт супстрата сонде ОЦТ2/МАТЕ1 АСП плус је процењен коришћењем два модела: (1) ХЕК293бубрегаћелије које прекомерно изражавају људскеОЦТ2или МАТЕ1, и (2) МДЦК ћелије трансфектоване хуманимОЦТ2and MATE1. In HEK293 cells, the inhibition ofASP+ uptake by OCT2 listed in order of potency was palonosetron (IC50: 2.6 µM) > ondansetron >granisetron > tropisetron > dolasetron (IC50: 85.4 µM) and the inhibition of ASP+ uptake by MATE1in order of potency was ondansetron (IC50: 0.1 µM) > palonosetron = tropisetron > granisetron >доласетрон (ИЦ50: 27,4 µМ). Ондансетрон (0.5–20 µМ) је инхибирао базолатерално-апикални трансћелијски транспорт АСП плус до 64 процента. Више концентрације (10 и 20 µМ) палоносетрона, трописетрона и доласетрона су на сличан начин смањиле трансћелијски транспорт АСП плус. У двоструко трансфектованим ОЦТ2-МАТЕ1 МДЦК ћелијама, ондансетрон у концентрацијама од 0,5 и 2,5 µМ изазвао је значајну интрацелуларну акумулацију АСП плус . Узети заједно, ови подаци сугеришу да лекови антагонисти 5-ХТ3 могу инхибирати лучење катјонских лекова путем бубрега ометајући функцију ОЦТ2 и/или МАТЕ1.
Кључне речи:ОЦТ2; МАТЕ1; катјонски; 5-ХТ3 антагонист;бубрега; секреција; транспорт
Контакт:joanna.jia@wecistanche.com
Цистанцхе тубулоса спречавабубрегаболест, кликните овде да бисте добили узорак
1. Представљање
Бубрежна секреција се постиже координисаним уносом и ефлуксом лекова кроз епител тубула. За лекове и токсиканте који су органски катјони, њихов трансепителни транспорт у филтрат се прво постиже транспортером органских катјона 2 (ОЦТ2) на базолатералној површини и, затим, транспортером за више лекова и екструзије токсина 1 (МАТЕ1) на ивици четкице. мембрана. Пре откривања гена ОЦТ2/СЛЦ22А1 и МАТЕ1/СЛЦ47А1, било је добро познато да се лучење органских катјона може фармаколошки инхибирати [1]. Користећи различите експерименталне приступе у различитим претклиничким врстама, показано је да се органски катјони подвргавају активном транспорту и бубрежној секрецији [2–4]. Од ових раних запажања, истраживање је напредовало у разумевању не само молекуларних механизама секреције органских катјона, већ и потенцијала за клинички релевантне интеракције лекова након прекида ОЦТ2 и МАТЕ1 (прегледано у [5]).
Антагонисти серотонинског 5-ХТ3 рецептора су се појавили као кључни лекови за лечење мучнине и повраћања. Серотонин ослобађају ентерохромафинске ћелије танког црева. 5-ХТ3 антагонисти инхибирају јонотропни лиганд-зависни јонски канал на аферентним нервима из вагуса и спречавају рефлекс повраћања [6]. Ондансетрон је био први 5-антагонист ХТ3 одобрен за спречавање мучнине и повраћања изазване хемотерапијом [7,8]. Од тада су развијени додатни лекови у овој класи (укључујући трописетрон, гранисетрон, доласетрон и палоносетрон) [9]. Док је примарна терапијска индикација за 5-ХТ3 антагонисте била превенција хемотерапије и повраћања изазваног зрачењем, они су такође одобрени за лечење постоперативне мучнине и повраћања и користе се офф-лабел за лечење јутарње мучнине, хиперемезе гравидарум , постоперативни делиријум и пруритус [10–14].
С обзиром на катјонску природу 5-ХТ3 антагониста (слика 1), они су се појавили као супстрати и инхибитори ОЦТ и МАТЕ транспортера. Ин витро студије су откриле да су ондансетрон и трописетрон супстрати и инхибитори ОЦТ1 и ОЦТ2 [15–20]. Штавише, показало се да су појединци са варијантама губитка функције у гену ОЦТ1/СЛЦ22А1 променили фармакокинетику трописетрона и побољшали клиничку ефикасност [16]. Слично, ондансетрон може инхибирати МАТЕ транспортере, што доводи до бубрежне акумулације антидијабетичког лека метформина, као и повећане нефротоксичности лека против рака цисплатина [19]. Код људи, ондансетрон смањује бубрежни клиренс метформина, вероватно тако што инхибира ефлукс МАТЕ1 [21]. Заједно, ови подаци указују на потенцијал 5-ХТ3 антагониста да инхибирају трансепителну секрецију лекова преко ОЦТ2 и МАТЕ1. Због тога смо покушали да систематски упоредимо пет 5-ХТ3 антагониста због њихове способности да инхибирају хумани ОЦТ2 и МАТЕ1- посредовани транспорт катјонског супстрата сонде помоћу једноструке и двоструке трансфектацијебубрегаћелије. Треба напоменути да се тренутна студија првенствено фокусирала на МАТЕ1, као нивое МАТЕ2-К протеина у људскомбубрегараније је показано да је кортекс испод доње границе квантификације коришћењем масене спектрометрије [22].
2. Резултати
2.1. Карактеризација АСП плус као флуоресцентног супстрата у ХЕК293 ћелијама које прекомерно експримирају ОЦТ2 и МАТЕ1
Почетне студије су карактерисале унос АСП плус у ћелије које прекомерно експримирају празан вектор (ЕВ), ОЦТ2 или МАТЕ1 (Слика 2). АСП плус је приказао време зависно (Слика 2А) и зависно од концентрације (Слика 2Б) унос у ћелије које експримирају ОЦТ2- и МАТЕ1- и показао кинетику засићења (ОЦТ2: Вмак 8,1 нмол/мг/мин , Км 2,9 уМ, Р2 0,95; МАТЕ1: Вмак 3,4 нмол/мг/мин, Км 8,2 уМ, Р2 0,96). ЕВ ћелије су показале минималну акумулацију АСП плус (Вмак 1,9 нмол/мг/мин, Км 37,3 уМ, Р2 0,92). На основу ових налаза, унос АСП плус је квантификован након 1 мин (линеарни опсег за транспорт ОЦТ2 и МАТЕ1) при концентрацији од 10 уМ, што је обезбедило довољну осетљивост за детекцију флуоресценције и скрининг 5-ХТ3 антагониста као инхибитора.
Да би се осигурало да ови услови одражавају активни транспорт сваког транспортера, одређене су ИЦ5{{10}} вредности циметидина, добро утврђеног инхибитора ОЦТ2 и МАТЕ1 (Слика 3 и Табела 1). ИЦ50 за циметидин је био 24,5 土 4,0 уМ у ћелијама које експримирају ОЦТ2-и 0,23 土 0,2 уМ у ћелијама које експримирају МАТЕ{16}}, у складу са објављеним подацима који показују инхибицију МАТЕ1 при нижим концентрацијама [18,20]. Циметидин није имао утицаја на апсорпцију АСП плус у ЕВ ћелијама.
2.2. Инхибиција транспорта посредованог ОЦТ2- и МАТЕ1- антиеметичким леком у ћелијама ХЕК293
Пет различитих 5-ХТ3 антагониста (ондансетрон, палоносетрон, гранисетрон, трописетрон и доласетрон) је процењено на њихову инхибицију транспорта ОЦТ2 и МАТЕ1 у ћелијама ХЕК293 коришћењем АСП плус као супстрата (слика 3). Смањење АСП плус апсорпције у зависности од концентрације примећено је у ћелијама које експримирају ОЦТ2- и МАТЕ1-у присуству свих пет 5-ХТ3 антагониста тестираних у низу концентрација. ИЦ50 вредности за инхибицију АСП плус акумулације од стране 5-ХТ3 антагониста користећи тестиране опсеге концентрација приказане су у табели 1. Са изузетком гранисетрона, други 5-ХТ3 антагонисти су инхибирали МАТЕ1 снажније него они. ОЦТ2. ОЦТ2-посредовани транспорт је био инхибиран до ~90 процената, док је транспорт посредован МАТЕ1- био инхибиран до ~70 процената у тестираним концентрацијама.
Уопштено говорећи, 5-ХТ3 антагонисти нису у великој мери променили унос АСП плус од стране ЕВ ћелија. Међутим, примећено је да су палоносетрон и трописетрон стимулисали додатни унос АСП плус у ЕВ ћелије, а највећа концентрација гранисетрона је изазвала мало смањење АСП плус акумулације.
2.3. Карактеризација трансћелијског транспорта и интрацелуларне акумулације АСП плус у ОЦТ2/МАТЕ1-експресирању МДЦК ћелија
Да би се истражио комбиновани допринос ОЦТ2 и МАТЕ1 у трансепителној секрецији, накнадни експерименти су изведени у МДЦК ћелијама које се поларизирају са базолатералним (ОЦТ2) и апикалним (МАТЕ1) површинама. Експресија ОЦТ2 и МАТЕ1 протеина је потврђена у двоструко трансфектованим МДЦК ћелијама коришћењем Вестерн блотинга (Слика 4А). Трансћелијски транспорт супстрата катјонске сонде АСП плус (25 уМ) је тестиран у овим ћелијама коришћењем Трансвелл уметака. Базолатерално-апикални (Б-то-А) транспорт АСП плус је био много већи (до 28-пута на 120 мин) од апикалног-базолатералног (А-то-Б) транспорта у ОЦТ2/МАТЕ1 двоструко трансфектованим ћелијама (слика 4Б). Однос Б-то-А/А-то-Б ефлукса на 120 минута је процењен на 2,7 за ћелије ОЦТ2/МАТЕ1 које подржавају активно лучење АСП плус. Насупрот томе, контролне ћелије су показале много нижи АСП плус транспорт у оба смера у поређењу са ОЦТ2/МАТЕ1 ћелијама. Б-то-А транспорт АСП плус био је само значајно већи у поређењу са А-то-Б транспортом у контролним ћелијама на 90 (1.3-пут) и 120 мин (17- пута ). Сви даљи тестови инхибиције су изведени у правцу Б-то-А.
Способност хемикалија да инхибирају АСП плус флукс и акумулирају се у ОЦТ2/МАТЕ1 двоструко трансфектованим ћелијама у специфицираним условима теста процењена је коришћењем три инхибитора позитивне контроле (циметидин 5 и 50 уМ, пириметамин 1 уМ и оланзапин 20 уМ) (Слика 4). Циметидин је познати инхибитор ОЦТ2 и МАТЕ1, са већом снагом за МАТЕ1 (Табела 1) [18]. Пириметамин је специфичан инхибитор МАТЕ1 [23], док је утврђено да оланзапин снажније инхибира ОЦТ2 (додатна слика С1) [18,20]. Све три хемикалије инхибирају трансцелуларни флукс АСП плус (18 процената циметидина 5 уМ, 40 процената циметидина 50 уМ, 36 процената пириметамина 1 уМ и 28 процената оланзапина 20 уМ на 120 мин).
Акумулација АСП плус интрацелуларно је такође квантификована у лизатима на 120 мин. Циметидин и пириметамин повећали су интрацелуларну акумулацију АСП плус за 1.8- пута и 1.3- пута (због првенствено инхибиције МАТЕ1), респективно, док је оланзапин смањио интрацелуларну акумулацију АСП плус за 51 проценат (због инхибиције ОЦТ2). У контролним ћелијама, није примећена значајна инхибиција Б-то-А транспорта АСП плус ни у једној временској тачки. У контролним ћелијама такође није било значајних промена у интрацелуларној акумулацији АСП плус у поређењу са контролним ћелијама носача, осим умереног смањења АСП плус акумулације у присуству оланзапина 20 уМ.
2.4. Инхибиција трансцелуларног транспорта АСП плус од 5-ХТ3 антагониста у ОЦТ2/МАТЕ1-који експримирају МДЦК ћелије
Пет 5-ХТ3 антагониста (ондансетрон, палоносетрон, гранисетрон, трописетрон и доласетрон) процењено је на њихову способност да утичу на трансћелијски транспорт и интрацелуларну акумулацију АСП плус у ОЦТ2/МАТЕ1 двоструко трансфектованим ћелијама (Слике 5 и 6). Циметидин (50 уМ) је укључен у сваки експеримент у паралелни сет Трансвеллс као позитивна контрола. Занимљиво је да је свих пет 5-ХТ3 антагониста испољило различите степене инхибиције на трансћелијски Б-то-А транспорт АСП плус (Слика 5). У поређењу са ћелијама третираним носачем, ондансетрон је инхибирао Б-то-А транспорт АСП плус на начин зависан од концентрације, са 36 процената инхибиције на 120 минута у највишој тестираној концентрацији (20 уМ). Палоносетрон и трописетрон су такође показали концентрацијско зависну инхибицију АСП плус секреције, што је било значајно при 10 и 20 уМ за све временске тачке. Инхибиција АСП плус секреције је примећена са палоносетроном и трописетроном на 20 уМ. Доласетрон при 10 и 20 уМ је инхибирао АСП плус транспорт само на 120 мин. На крају, гранисетрон није променио Б-то-А транспорт АСП плус ни у једној тестираној концентрацији. Контролне ћелије нису показале значајну инхибицију у Б-то-А транспорту АСП плус са било којим од 5-ХТ3 антагониста (подаци нису приказани).
2.5. АСП плус интрацелуларна акумулација у ОЦТ2/МАТЕ1-Изражавање МДЦК ћелија које следе
Лечење 5-ХТ3 антагонистима
Ниске концентрације (0.5 и 2.5 уМ) ондансетрона су довеле до 1.3-пута повећања интрацелуларног АСП плус акумулације у ћелијама које експримирају ОЦТ2/МАТЕ1-, док није било разлике у поређењу са носачима у вишим концентрацијама (10 и 20 уМ) (слика 6). Међутим, у контролним ћелијама, дошло је до смањења (40 процената) у акумулацији АСП плус при високим концентрацијама ондансетрона. У ћелијама ОЦТ2/МАТЕ1, трописетрон и гранисетрон су повећали АСП плус акумулацију (1,5 односно 13- пута, респективно) при највишој концентрацији (20 уМ). Нису примећене значајне промене у АСП плус акумулацији са палоносетроном или доласетроном.
3. Дискусија
ОЦТ2 и МАТЕ1 су кључни транспортери који координирају бубрежну секрецију органских катјона. Они деле велики број супстрата који се преклапају укључујући метформин, цисплатин, ламивудин и ентекавир, као и одабране 5-лекове антагонисте ХТ3 [15–20,24]. Претходне студије су сугерисале да антагонисти 5-ХТ3 такође могу да инхибирају транспорт путем ОЦТ2 и МАТЕ1. Најважније, показало се да ондансетрон смањује транспорт цисплатина и метформина помоћу МАТЕ1 [19]. Садашња студија је имала за циљ да прошири овај претходни рад како би упоредила пет 5-ХТ3 антагониста због њихове способности да појединачно инхибирају ОЦТ2 и МАТЕ1 када су прекомерно експримирани у ћелијама ХЕК293 и када су коекспримирани у МДЦК ћелијама и узгајани на Трансвелл уметцима. Ондансетрон и палоносетрон су били у стању да инхибирају узимање сонде катјонске хемикалије, АСП плус, у ћелије ХЕК293 које експримирају ОЦТ2 или МАТЕ1, пре свега, у концентрацијама од 0.1–0.5 уМ . Слично томе, гранисетрон, трописетрон и доласетрон су такође били у стању да инхибирају сваки транспортер (међутим, у вишим концентрацијама). Користећи ОЦТ2/МАТЕ1 двоструко трансфектоване МДЦК ћелије, ондансетрон је инхибирао базолатерално-апикалну АСП плус секрецију у свим тестираним концентрацијама (0,5–20 уМ), што је примећено само при вишим концентрацијама за палоносетрон, трописетрон и доласетрон. Ови подаци добијени коришћењем флуоресцентног супстрата сонде сугеришу потенцијал за интеракције лекова посредоване ОЦТ2- и МАТЕ1- са 5-ХТ3 антагонистима.
Подаци генерисани у ОЦТ2/МАТЕ1 двоструко трансфицираним ћелијама у великој мери се слажу са подацима ХЕК293, са изузетком гранисетрона. Ондансетрон, палоносетрон и трописетрон су показали инхибицију Б-то-А транспорта АСП плус у зависности од концентрације са редоследом потенција који одражава ону која је примећена код инхибиције МАТЕ1 у ХЕК293 ћелијама. Изненађујуће, гранисетрон није показао никакву значајну инхибицију у ОЦТ2/МАТЕ1 МДЦК ћелијама, чак и при концентрацијама које су пет пута веће од концентрације ИЦ50 уочене у ћелијама ХЕК293 које експримирају ОЦТ2 или МАТЕ1. Пошто МДЦК ћелије у већој мери подсећају на природне тубуларне ћелије него ћелије ХЕК293, постоји потенцијал да се диспозиција гранисетрона промени услед експресије ендогених транспортера ортолога ОЦТ2 или МАТЕ1, или потенцијално других транспортера. На пример, МДЦК ћелије високо експримирају псећи транспортер П-гликопротеина [25], што може довести до ефлукса гранисетрона. У прилог овој спекулацији иде чињеница да је полиморфизам једног нуклеотида у хуманом МДР1/АБЦБ1 транспортеру побољшао клиничку ефикасност гранисетрона за лечење повраћања [26]. Ови подаци сугеришу да гранисетрон може бити супстрат за пасји П-гликопротеин, изазивајући промену интрацелуларне концентрације изложене МАТЕ1 транспортеру.
Иако постоји много преклапања између супстрата и инхибитора ОЦТ и МАТЕ транспортера, разлике постоје. Интеракције лек-лек засноване на транспортеру често могу да зависе од идентитета супстрата жртве који се процењује, као што је показано за ОЦТ2 [27–29]. За ОЦТ2, избор катјонског супстрата има и квантитативни и квалитативни утицај на обим и тип инхибиције [27,28]. Насупрот томе, очигледна Мицхаелисова константа транспортованог супстрата и вредности ИЦ50 за инхибицију МАТЕ1 на четири различита супстрата биле су сличне [30]. Ови подаци сугеришу да постоји заједничко место везивања за интеракцију супстрата и инхибитора на спољној површини хМАТЕ1. Као резултат тога, интеракције 5-лекова антагониста ХТ3 са ОЦТ2 и МАТЕ1 могу се јавити кроз различите механизме, упркос њиховој заједничкој катјонској природи. Потребне су будуће студије да би се унапредила садашња студија коришћењем супстрата сонде и процене интеракција са специфичним супстратима лекова као што су циметидин, метформин и цисплатин.
Додатне класе лекова осим 5-ХТ3 антагониста се такође користе за спречавање мучнине и повраћања. У прелиминарним студијама, проценили смо способност других антиеметичких лекова да инхибирају ОЦТ2 и МАТЕ1-посредовани транспорт АСП плус у ћелијама ХЕК293. Занимљиво је да су оланзапин, прохлорперазин и метоклопрамид инхибирали активност ОЦТ2 у низу концентрација (додатна слика С1). Ниједан од ових лекова није инхибирао активност МАТЕ1 у концентрацији од 10 уМ (подаци нису приказани). Други антиеметици, укључујући апрепитант и дексаметазон, нису имали утицаја на апсорпцију АСП плус у ћелијама ОЦТ2- или МАТЕ1-које експримирају ХЕК293 (подаци нису приказани). Као резултат тога, може постојати потенцијал да други антиеметички лекови (оланзапин, прохлорперазин и метоклопрамид) који се примењују заједно са 5-ХТ3 антагонистима такође утичу на бубрежно лучење катјона, пре свега кроз њихову способност да инхибирају унос ОЦТ2.
Важно је размотрити колико добро ин витро модели рекапитулирају карактеристике ендогеног транспорта код људибубрези. Нивои хуманог ОЦТ2 и МАТЕ1 протеина су претходно квантификовани у двоструко трансфектованим МДЦК ћелијама помоћу ЛЦ-МС/МС (хОЦТ2 и хМАТЕ1 су били 28,6 и 6,9 фмол/уг мембранског протеина, респективно) [31]. Поређења ради, студије које одређују експресију протеина у људском кортексу бубрега и мембранама људског бубрега откривају скромнију разлику у експресији између два транспортера или чак већу експресију МАТЕ1 (ОЦТ2 7.4 пмол/мг, МАТЕ{{14) }}.1 пмол/мг) [22] и (ОЦТ2 5 фмол/уг, МАТЕ1 10 фмол/уг) [32]. Ове разлике између ин витро модела и ендогене људске експресије ОЦТ2 и МАТЕ1 треба узети у обзир и узети у обзир у развоју физиолошки заснованих фармакокинетичких модела за потенцијалне интеракције катјонских лекова у бубрезима.
Садашња студија се углавном фокусирала на бубрежну секрецију катјонских лекова. Међутим, важно је препознати да јетра такође експримира ОЦТ1 и МАТЕ1, који омогућавају жучни клиренс катјонских хемикалија. Ово је важно јер се 5-антагонисти ХТ3 разликују по својој структури, метаболизму, везивању за протеине и путевима уклањања. Структурно, 5-антагонисти рецептора ХТ3 садрже базни амин, ароматични или хетероароматични прстенасти систем и карбонил (или сличну структуру) који је компланаран ароматичном региону (Слика 1) [33]. Значајно је да се структура аминског дела разликује за ондансетрон и укључује имидазол, док су 6-члани прстенови уграђени у друге 5-ХТ3 антагонисте. Релевантност ових структурних разлика у интеракцији са ОЦТ2 и/или МАТЕ1 захтева даље истраживање, али би могла да објасни значајније ефекте ондансетрона при нижим концентрацијама. Поред тога, неки 5-ХТ3 антагонисти су у великој мери очишћени од странебубрезикао родитељи или метаболити (као што су палоносетрон и трописетрон). Многи од 5-ХТ3 антагониста (укључујући ондансетрон, трописетрон, палоносетрон и гранисетрон) се високо метаболишу (48–95 процената) ензимима цитокрома П450 у јетри. Недавно су студије показале да метаболити могу играти већу улогу у интеракцијама лека и лека него што се раније мислило [34]. Даље тестирање транспорта ОЦТ2 и МАТЕ1 са главним метаболитима 5-ХТ3 антагониста који прелазе 25 процената системске изложености родитеља је оправдано. Исто тако, унутар хемијске класе постоје лекови са кратким полуживотом (< 6="" h,="" ondansetron,="" and="" tropisetron),="" moderate="" half-lives="" (8–9="" h,="" granisetron,="" and="" dolasetron),="" and="" a="" long="" half-life="" (40="" h,="" palonosetron).="" these="" factors="" should="" be="" considered="" when="" evaluating="" potential="" drug-drug="" interactions="" using="" in="" vitro="" transporter="">
На основу 2020 ФДА смерница за ин витро метаболизам и студије интеракције лека и лека посредоване транспортером [35], лек има потенцијал да инхибира транспортер ин виво ако: Цмак (невезан)/ИЦ50 вредност је веће или једнако 0,1. На основу ових смерница, вредности МАТЕ1 Цмак/ИЦ50 за ондансетрон указују на потенцијалне интеракције лекова ин виво коришћењем АСП плус као супстрата за сонду. Поређење вредности ИЦ50 за друге 5-ХТ3 антагонисте са њиховим Цмак вредностима (опсег од високих наномоларних до ниских микромолара) не би указивало на ризик од интеракције лека, барем са АСП плус као супстратом жртве. Исто тако, тренутно не знамо интрареналне концентрације 5-ХТ3 антагониста, што би било важно за процену потенцијалних интеракција МАТЕ1 са лековима. Постоје ограничени клинички подаци који процењују интеракције лекова повезаних са ондансетроном са ОЦТ/МАТЕ супстратима. На пример, ондансетрон повећава ниво креатинина и метформина код здравих особа услед инхибиције бубрежног транспортера [21,36]. Занимљиво је да ондансетрон не само да је смањио бубрежни клиренс метформина већ је имао и побољшане мере толеранције глукозе [21]. У другим клиничким студијама, пријављено је да ондансетрон повећава нефротоксичност супстратног лека потенцијално мењајући секрецију посредовану транспортером унутарбубрега[37–39]. Заједно, ови подаци оправдавају даље истраживање интеракција ондансетрона са лековима кроз инхибицију ОЦТ и МАТЕ транспортера.
Укратко, ови ин витро подаци указују на то да многи од 5-ХТ3 антагониста имају већу потенцију према инхибицији МАТЕ1, повећавајући потенцијал за повећање тубуларне концентрације катјонских лекова. Даље, ондансетрон је био довољно моћан да повећа интрацелуларну концентрацију супстрата сонде, АСП плус у концентрацијама близу клинички релевантног Цмак. Ови подаци су у складу са претходним ин виво студијама на мишевима где је примећена повећана нефротоксичност посредована цисплатином уз истовремену примену ондансетрона [19]. На основу тренутних критеријума за процену клиничког потенцијала интеракције лек-лек, други 5-ХТ3 антагонисти, као и антиеметички лекови тестирани у нашој студији, вероватно представљају мањи ризик од клинички релевантне интеракције лекова због много нижег терапеутског концентрације у плазми и веће константе инхибиције.
4. Материјали и методе
4.1. хемикалије
4-(4-(Диметиламино)стирил)-Н-метил пиридинијум јодид (АСП плус) је купљен од Лифе Тецхнологиес (Гранд Ајленд, Њујорк, САД). Трописетрон је купљен од Абцам-а (Кембриџ, МА, САД). Све остале хемикалије су из Сигма-Алдрицх (Сент Луис, МО, САД).
4.2. Ћелијске линије и ћелијска култура
Др Катхи Гиацомини са Калифорнијског универзитета у Сану великодушно је обезбедила контролу празних вектора (ЕВ) (пцДНА5-трансфицирана) и ћелијске линије Флп-Ин људског ембрионалног бубрега (ХЕК)293 које стабилно експримирају хумане МАТЕ1 и ОЦТ2 транспортере. Францисцо. Ћелије ХЕК293 су култивисане у Дулбецо-овом модификованом орловом медијуму (ДМЕМ) са додатком 10 процената феталног говеђег серума, 2 мМ Л-глутамина, 100 У/мЛ пеницилина, 100 уг/мЛ стрептомицина и 200 уг/мЛ ББЦН3 (Вектор ХигромицинЛ3. 1 плус и пцДНА3.1/Хигро( плус )) и хумане ОЦТ2/МАТЕ1 двоструко трансфектоване ћелијске линије Мадин-Дарби псећег бубрега (МДЦК) великодушно је обезбедила др Џоан Ванг са Универзитета Вашингтон, Сијетл, Вашингтон. МДЦК ћелије су одржаване у минималном есенцијалном медијуму (МЕМ) са додатком 10% феталног говеђег серума, 500 уг/мЛ Г418 и 200 уг/мЛ хигромицина Б. Све ћелијске линије су култивисане у влажном инкубатору на 37оЦ са 5% ЦО2.
4.3. Тестови инхибиције апсорпције и ефлукса у ћелијама ХЕК293
ОЦТ2- и МАТЕ1-ћелије са прекомерном експресијом ХЕК293 су засејане у прозирне плоче са 24-бунарићима обложеним поли-Д-лизином (Фисхер Сциентиfi, Хановер Парк, ИЛ, САД) и узгајане 24 сата до приближно 90 посто конфлуента. Након прања једном претходно загрејаним Хенковим пуферованим сланим раствором (ХБСС), ћелије су претходно инкубиране 30 минута на 37оЦ са различитим 5-ХТ3 антагонистима за ОЦТ2 ћелије или у 30 мМ раствору НХ4Цл у ХБСС на пХ 6,5 за МАТЕ1 ћелије за интраћелијске ћелије закисељавање. Унос у ОЦТ2 ћелије је покренут кроз излагање 10 уМ флуоресцентног супстрата АСП плус директно у медијуму за инкубацију. Унос у МАТЕ1 ћелије је покренут применом ХБСС на пХ 7,4 који садржи 5-ХТ3 антагонисте и 10 уМ флуоресцентног супстрата АСП плус. Након инкубације од 1 мин на 37оЦ на шејкеру, узимање супстрата је заустављено додавањем ледено хладног ХБСС који садржи 500 уМ циметидина. Медијум је уклоњен и испран четири пута са ледено хладним ХБСС. Ћелије су лизиране са 1 процентом Тритон Кс-100. Флуоресценција је детектована коришћењем Спецтрамак читача микроплоче (Молецулар Девицес, Суннивале, ЦА, УСА) на следећим таласним дужинама (ексцитација 485 нм/емисија 495 нм). Интрацелуларна флуоресценција је нормализована на укупну концентрацију протеина ћелијских лизата из сваког лежишта коришћењем теста бицинхонинске киселине (БЦА) (Пиерце Биотецхнологи, Роцкфорд, ИЛ, УСА). Експерименти су поновљени три одвојена пута, са три до четири понављања у сваком експерименту.
4.4. Трансвелл студије у МДЦК-ОЦТ2/МАТЕ1 ћелијама
Control and OCT2/MATE1-expressing MDCK cells were evaluated for protein expression of OCT2 and MATE1 using SDS-PAGE and western blotting with specific primary antibodies (OCT2, sc292622 1:500 and MATE1, sc133390 1:250, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), followed by an antirabbit HRP-conjugated secondary antibody (1:1000, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) and Super Signal Western Dura Extended Duration Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Detection was performed with a FluorChem imager (ProteinSimple, Santa Clara, CA, USA). Both MDCK cell lines were seeded on 0.4 um transwell inserts (VWR, Radnor, PA, USA) at a density of 2 × 105 cells/cm2. Transport experiments were performed 3 to 5 days after seeding. The integrity of MDCK monolayers was verified by measuring transepithelial electrical resistance (TEER) >150 о*цм2 користећи епителни волт охмметар, ЕВОМ2 (Ворлд Прецисион Инструментс, Сарасота, ФЛ). Правилно формирање тесних спојева је такође верификовано мерењем пасивне пермеабилности луцифер жутог у базолатералном ка апикалном правцу (Б-то-А). Луцифер жути (20 уМ) је примењен на базолатералну комору током 1 х, а медији су сакупљени из апикалне коморе. Луцифер жута флуоресценција је очитана на таласној дужини ексцитације од 430 нм и таласној дужини емисије од 538 нм. Просечне вредности пасивне пермеабилности (Папп) биле су 7 × 10-7 цм/с, што је у складу са литературним вредностима [40].
Након што су ћелије једном испране Ханковим пуферованим сланим раствором (ХБСС) пХ 7,4, започете су студије транспорта након аспирације пуфера за испирање и из апикалне и из базалне коморе. Ћелије су инкубиране са 5-ХТ3 антагонистима у апикалној комори у ХБСС пХ 6.0 и 5-ХТ3 антагонистима са АСП плус (25 уМ) у базолатералној комори у ХБСС пХ 7,4 и инкубиране на 37 оЦ 120 мин. Да би се измерио трансћелијски транспорт који зависи од времена, аликвот инкубационог медијума (100 уЛ) из апикалне коморе (пријемне коморе) је сакупљен на 40, 60, 90 и 120 минута и замењен једнаком запремином свежег пуфера који садржи {{ 19}}ХТ3 антагонист или хемикалија позитивне контроле у оригиналној концентрацији. После 120 минута, медијум за третман је уклоњен и Трансвеллс су три пута испрани ледено хладним ХБСС. Ћелије су лизиране са 1 процентом Тритон Кс-100. Флуоресценција је детектована коришћењем Спецтрамак Мицроплате Реадер-а на следећим таласним дужинама (ексцитација 485 нм/емисија 495 нм). Интрацелуларна флуоресценција је нормализована на укупну концентрацију протеина ћелијских лизата из сваког трансбунара коришћењем БЦА теста. Експерименти су изведени у три појединачна Трансвелл уметака.
4.5. Статистичка анализа
За статистичку анализу коришћен је ГрапхПад Присм в6 (ГрапхПад Софтваре, Ла Јолла, ЦА, УСА). Км и Вмак су израчунати коришћењем нелинеарне регресије (Мицхаелис–Ментен кинетичка једначина ензима, (И=Вмак × Кс/(Км плус Кс), одговара за најмањи квадрат). Подаци са две варијабле су анализирани коришћењем две- начин АНОВА праћен једносмерним АНОВА и/или Дуннеттовим постхоц тестом за вишеструка поређења. ИЦ50 вредности су израчунате нелинеарном регресијом како би се уклопиле најмање квадрате. Разлике су сматране статистички значајним при п <>
Додатни материјали:Следеће је доступно на мрежи на хттпс://ввв.мдпи.цом/артицле/10 .3390/ијмс22126439/с1.
Доприноси аутора:Концептуализација, БГ, МСЈ, ЛМА; методологија, БГ, КСВ; формална анализа, БГ, ЛМА; ресурси, ЛМА; писање—припрема оригиналног нацрта, БГ, ЛМА; писање—преглед и уређивање, МСЈ, ЛМА; администрација пројекта, ЛМА; прибављање средстава, МСЈ, ЕАЈ, ЛМА Сви аутори су прочитали и пристали на објављену верзију рукописа.
Финансирање:Ово истраживање је финансиран од стране Националног института за опште медицинске науке (Грант ГМ123330) и Националног института за здравствене науке о животној средини (грантови ЕС005022, ЕС007148), Националног института за рак (Грантови ЦА072720, ЦА046934, ЦА0087, Диабе тхе Натионал Институте) Дисгестивне и бубрежне болести (Грант ДК093903), компоненте Националног института за здравље.
Изјава институционалног одбора за ревизију: Није применљиво.
Изјава о информисаној сагласности:Није применљиво.
Изјава о доступности података:Није применљиво.
Признања:Веома ценимо издашне ћелијске линије ХЕК293 транспортера од Катхи Гиацомини и трансфициране МДЦК ћелијске линије од Јоанне Ванг.
Сукоби интереса:Аутори изјављују да нема сукоба интереса.
Референце
1. Ацара, М.; Ренницк, Б. Двофазни ефекат органских катјона на излучивање других органских катјона. Ј. Пхармацол. Екп. Тхер. 1976, 199, 32–40. [ПубМед]
2. Холохан, ПД; Росс, ЦР Механизми транспорта органских катјона у везикулама плазма мембране бубрега: 1. Студије контратранспорта. Ј. Пхармацол. Екп. Тхер. 1980, 215, 191–197.
3. Кинселла, ЈЛ; Холохан, ПД; Пессах, НИ; Росс, ЦР Транспорт органских јона у бубрежним кортикалним луминалним и антилуминалним мембранским везикулама. Ј. Пхармацол. Екп. Тхер. 1979, 209, 443–450.
4. Волд, ЈС; Миллер, БЛ Инхибиција ефлукса органских јона из реналних кортикалних резова. Екпериентиа 1978, 34, 630–631. [ЦроссРеф] [ПубМед]
5. Гесснер, А.; Кониг, Ј.; Фромм, МФ Цлиницал Аспецтс оф Транспортер-Медиатед Друг-Друг Интерацтионс. Цлин. Пхармацол. Тхер. 2019, 105, 1386–1394. [ЦроссРеф]
6. Смитх, ХС; Цок, ЛР; Смитх, ЕЈ 5-антагонисти ХТ3 рецептора за лечење мучнине/повраћања. Анн. Паллиат. Мед. 2012, 1, 115–120. [ЦроссРеф] [ПубМед]
7. Цосталл, Б.; Гуннинг, СЈ; Наилор, РЈ; Тајерс, МБ Ефекат ГР38032Ф, новог антагониста 5-ХТ3-рецептора на пражњење желуца код заморца. Бр. Ј. Пхармацол. 1987, 91, 263–264. [ЦроссРеф]
8. Крис, МГ; Гралла, РЈ; Цларк, РА; Тисон, ЛБ Процена распона дозе антагониста серотонина ГР-Ц507/75 (ГР38032Ф) када се користи као антиеметик код пацијената који примају хемотерапију против рака. Ј. Цлин. Онцол. 1988, 6, 659–662. [ЦроссРеф]
9. Трико, АЦ; Блондал, Е.; Вероника, АА; Сообиах, Ц.; Вафаеи, А.; Ивори, Ј.; Стриflер, Л.; Цардосо, Р.; Реинен, Е.; Нинчић, В.; ет ал. Компаративна безбедност и ефикасност антагониста серотонинских рецептора код пацијената који су подвргнути хемотерапији: систематски преглед и мрежна мета-анализа. БМЦ Мед. 2016, 14, 216. [ЦроссРеф]
10. Боелиг, РЦ; Бартон, СЈ; Саццоне, Г.; Келли, АЈ; Едвардс, СЈ; Бергхелла, В. Интервенције за лечење хиперемезе гравидарум: Цоцхране систематски преглед и мета-анализа. Ј. Матерн. Фетал Неонатал Мед. 2018, 31, 2492–2505. [ЦроссРеф]
11. Хакуе, Н.; Накви, РМ; Дасгупта, М. Ефикасност ондансетрона у превенцији или лечењу постоперативног делиријума-систематски преглед. Моћи. Гериатр. Ј. 2019, 22, 1–6. [ЦроссРеф] [ПубМед]
12. МцПарлин, Ц.; О'Доннелл, А.; Робсон, СЦ; Беиер, Ф.; Молонеи, Е.; Бриант, А.; Брадлеи, Ј.; Муирхеад, ЦР; Нелсон-Пиерци, Ц.; Невбури-Бирцх, Д.; ет ал. Третмани за хиперемезу гравидарум и мучнину и повраћање у трудноћи: систематски преглед. ЈАМА 2016, 316, 1392–1401. [ЦроссРеф] [ПубМед]
13. Ванг, В.; Зхоу, Л.; Сун, Л. Ондансетрон за пруритус изазван неураксијалним морфијумом: мета-анализа рандомизованих контролисаних студија. Ј. Цлин. Пхарм. Тхер. 2017, 42, 383–393. [ЦроссРеф]
14. Иокои, А.; Михара, Т.; Ка, К.; Гото, Т. Компаративна ефикасност рамосетрона и ондансетрона у превенцији постоперативне мучнине и повраћања: ажурирани систематски преглед и мета-анализа са секвенцијалном анализом испитивања. ПЛоС ОНЕ 2017, 12, е0186006. [ЦроссРеф]
15. Морсе, БЛ; Колур, А.; Худсон, ЛР; Хоган, АТ; Цхен, ЛХ; Брацкман, РМ; Савада, ГА; Фаллон, ЈК; Смитх, ПЦ; Хиллгрен, КМ Фармакокинетика супстрата транспортера органског катјона 1 (ОЦТ1) у Оцт1/2 нокаутираним мишевима и разликама у врстама у хепатичком ОЦТ1-посредованом преузимању. Друг Метаб. Диспос. 2020, 48, 93–105. [ЦроссРеф] [ПубМед]
16. Цветков, МВ; Саадатманд, АР; Бокелманн, К.; Меинеке, И.; Каисер, Р.; Броцкмоллер, Ј. Ефекти полиморфизама ОЦТ1 на ћелијски унос, концентрације у плазми и ефикасност 5-ХТ(3) антагониста трописетрона и ондансетрона. Пхармацогеномицс. Ј. 2012, 12, 22–29. [ЦроссРеф] [ПубМед]
17. Зху, П.; Ие, З.; Гуо, Д.; Ксионг, З.; Хуанг, С.; Гуо, Ј.; Зханг, В.; Полли, ЈЕ; Зхоу, Х.; Ли, К.; ет ал. Иринотекан мења диспозицију морфијума преко инхибиције транспортера органских катјона 1 (ОЦТ1) и 2 (ОЦТ2). Пхарм. Рес. 2018, 35, 243. [ЦроссРеф]
18. Кидо, И.; Матссон, П.; Гиацомини, КМ Профилисање библиотеке лекова на рецепт за потенцијалне реналне интеракције лек-лек посредоване транспортером органских катјона 2. Ј. Мед. Цхем. 2011, 54, 4548–4558. [ЦроссРеф] [ПубМед]
19. Ли, К.; Гуо, Д.; Донг, З.; Зханг, В.; Зханг, Л.; Хуанг, СМ; Полли, ЈЕ; Сху, И. Ондансетрон може појачати нефротоксичност изазвану цисплатином путем инхибиције вишеструких токсина и екструзионих протеина (МАТЕ). Токицол. Аппл. Пхармацол. 2013, 273, 100–109. [ЦроссРеф]
20. Виттвер, МБ; Зур, АА; Кхури, Н.; Кидо, И.; Косака, А.; Зханг, Кс.; Морриссеи, КМ; Сали, А.; Хуанг, И.; Гиацомини, КМ Откриће моћних, селективних инхибитора транспортера за екструзију више лекова и токсина 1 (МАТЕ1, СЛЦ47А1) кроз профилисање лекова на рецепт и рачунарско моделирање. Ј. Мед. Цхем. 2013, 56, 781–795. [ЦроссРеф] [ПубМед]
