Повећани нивои ИКЛ-40, али не и Ц-реактивни протеини код пацијената са Алцхајмеровом болешћуⅡ

2. Материјал и методе

2.1. Хуман Донорс

Укупно 123 испитаника је укључено у ову студију: (1) старији недементни субјекти без икаквих доказа о било каквој неуродегенеративној болести (здраве контроле) класификоване као контроле (н=37); (2) МЦИ због АД (МЦИ) пацијената (н=22); (3) вероватни благи/умерени-тешки спорадични пацијенти са АД (н=34); (4) пацијенти са ПД (н=30). Учесници студије су били уписани из Клинике за памћење (контроле, МЦИ и АД субјекти) и Јединице за поремећаје кретања (учесници ПД) болнице Университарио 12 де Оцтубре (Мадрид, Шпанија). Демографске и клиничке карактеристике испитаника наведене су у табели 1.

Сви учесници су класификовани према утврђеним дијагностичким критеријумима у оне са МЦИ или вероватном АД деменцијом [43–45]. Дијагноза је заснована на детаљној клиничкој процени, неуропсихолошкој процени и неуроимагинг (МРИ). Функционално оштећење је мерено помоћу скора Цлиницал Дементиа Ратинг (ЦДР) [46].

Цлицк то цистанцхе тцм за лечење Паркинсонове и Алцхајмерове болести

Пацијенти са ПД дијагностиковани су према клиничким дијагностичким критеријумима Друштва за поремећај кретања (МДС) [47] и сви су испуњавали критеријуме за клинички утврђену ПД. Пацијенти са ПД нису се позивали на когнитивне тегобе и нису показивали симптоме деменције. Контролна група је била састављена од когнитивно нормалних појединаца старости 50 година или више, без клиничких знакова когнитивног оштећења и историје неуролошких или психијатријских болести.

Критеријуми за искључење за сваког учесника били су истовремена значајна цереброваскуларна болест и доказ о било каквом неуролошком, психијатријском, медицинском или не-неуролошком медицинском коморбидитету који би могао утицати на когницију или моторичку функцију. Одобрење студије је добијено од Одбора за етику истраживања при Хоспитал Университарио 12 де Оцтубре, а сви учесници су дали писмени информисани пристанак.

2.2. Флуид Сампле

Сакупљени узорци ликвора су сакупљени од свих испитаника (укључујући здраве пацијенте и особе са МЦИ, АД и ПД) и обрађени према стандардизованим процедурама лумбалном пункцијом у стерилним полипропиленским епруветама од 15 мЛ. Узорци су затим центрифугирани на 3000 рпм на 4 ◦Ц током 10 мин. Аликвоти супернатанта су чувани на -80 ◦Ц у 0,5 мЛ полипропиленских криогених епрувета са коктелом инхибитора протеазе (Роцхе, Базел, Швајцарска).

Узорци крви су добијени пункцијама антекубиталних вена од пацијената и здравих субјеката. Плазма је изолована из пуне крви сакупљене у епруветама од 7 мЛ ЕДТА{1}}На. Цела крв је центрифугирана на 2000 рпм током 10 минута на собној температури. Супернатанти су затим сакупљени и аликвоти у полипропиленским криогеним епруветама са коктелом инхибитора протеазе (Роцхе, Базел, Швајцарска) и чувани на -80 ◦Ц.

2.3. Узорци ткива

Постмортално ткиво церебралног орбитофронталног кортекса добијено је од донатора мозга са дијагнозом АД и контролних особа. Замрзнуте узорке је испоручио Институт за неуропатологију Браин Банк ИДИБЕЛЛ-Хоспитал Университари де Беллвитге (Хоспиталет де Ллобрегат, Шпанија). Сагласност субјекта је добијена у складу са Хелсиншком декларацијом, а одобрење је стигло од Одбора за етику истраживања надлежне институције.

За све случајеве био је доступан писмени информисани пристанак. Субјекти су одабрани на основу постмортем дијагнозе АД према патологији неурофибриларног сплета и А плаковима [48]. Случајеви АД су показали високу неуропатологију АД (Браак стадијум В/ВИ и умерен до чест резултат неуритичног плака). Контролни учесници су сматрани онима са/без неуролошких симптома или ниског степена неуропатолошке промене АД. Укупно 24 узорка су категорисана у АД и контроле, као што је приказано у табели 2.

2.4. Пречишћавање ДНК и генотипизација аполипопротеина Е (АПОЕ).

Геномска ДНК је екстрахована из периферне крви коришћењем КИАмп ДНА Блоод Мини Кит (Киаген, Хилден, Немачка), према упутствима произвођача. Људски АПОЕ Ц112Р и Р158Ц полиморфизми су откривени да би се идентификовали алели АПОЕ ε2, ε3 и ε4, коришћењем ЛигхтЦицлер 480 ИИ комплета инструмената (Роцхе Диагностицс, Базел, Швајцарска) према упутствима произвођача.

2.5. Анализа протеина

ЦСФ и концентрације неуроинфламаторних биомаркера у плазми (ИКЛ-40 и ЦРП) су анализиране коришћењем ЕЛИСА комплета (Хуман Цхитинасе 3-као 1 Куантикин ЕЛИСА комплет (ДЦ3Л10), Р&Д; Хуман ЦРП Куантикине ЕЛИСА комплет (ДЦРП{ {5}}), истраживање и развој) према упутствима произвођача. Нивои ИКЛ-40 и ГФАП протеина у мозгу су такође испитивани Вестерн блот-ом. Постмортално ткиво церебралног орбитофронталног кортекса добијено је од донатора мозга са дијагнозом АД и контролних особа.

Укратко, узорци орбитофронталног кортекса људског мозга су инкубирани и хомогенизовани у пуферу за лизу (50 мМ Трис/ХЦл пуфер, пХ 7,4 који садржи 2 мМ ЕДТА, 0,2 процента Нонидет П-40, 1 мМ ПМСФ, протеазу, и коктели инхибитори фосфатазе; Роцхе, Базел, Швајцарска) и центрифугирани 10 минута на 14,000 о/мин на 4 ◦Ц. Супернатанти су извучени и чувани на -80 ◦Ц. Садржај протеина је одређен БЦА методом (Тхермо Фисхер Сциентифиц, МА, САД). Једнаке количине протеина (20 µг за ИКЛ-40 и 5 µг за ГФАП) су помешане са Лаеммлијевим пуфером за узорке допуњеним -меркаптоетанолом, загрејане на 95 ◦Ц током 5 минута, раздвојене са 10% НуПАГЕ Бис-Трис гелова ( Тхермо Фисхер Сциентифиц, МА, САД) и пренети на мембране од поливинилиден дифлуорида (ПВДФ) (Миллипоре, МА, САД).

Након тога, мембране су блокиране и инкубиране преко ноћи на 4 ◦Ц са примарним антителима: рекомбинантним зечјим моноклонским анти-ИКЛ-40 антителом (аб255297, 1:500, Абцам) и мишјим моноклонским анти-ГФАП антителом (Г3893, :0000, Сигма Олдрицх). Мембране су затим инкубиране 1 х са одговарајућим секундарним антителима коњугованим с пероксидазом рена (ХРП) (Г-21234, 1:5000, Тхермо Фисхер Сциентифиц, МА, САД; аб97023, 1:40000, Абцам).

Учитавање протеина је праћено коришћењем мишјих моноклонских ХРП-коњугованих антитела против -тубулина (аб40742, 1:5000, Абцам) за ИКЛ-40 или против -актина (А1978, Сигма Алдрицх) за ГФАП детекцију. Имунокомплекси су откривени реагенсом побољшане хемилуминисценције (ЕЦЛ Цларити; Био-Рад, Калифорнија, САД). Дензитометријска квантификација је спроведена помоћу софтвера Имаге Студио Лите 5.0 (Ли-ЦОР Биосциенцес, НЕ, САД). Протеинске траке су нормализоване на контроле пуњења и изражене као проценат контролне групе

2.6. Статистичка анализа

Статистичка анализа и графикони су обављени коришћењем Стата/ИЦ софтвера (Стата 16.1, СтатаЦорп ЛЛЦ, Цоллеге Статион, ТКС, САД) и Присм (ГрапхПад Софтваре верзија 8.00, Ла Јолла, Калифорнија, САД). Након процене нормалности дистрибуције, анализиране су разлике у ЦСФ и нивоима ИКЛ-40 и ЦРП у плазми између група коришћењем непараметарског Крускал-Волисовог ранг теста. П-вредност за парна поређења је приказана са Бонферонијевом корекцијом. Урађен је дескриптивни модел вишеструке линеарне регресије да би се узеле у обзир збуњујуће варијабле (старост, пол и АПОЕ ε4) у анализи асоцијације ЦСФ ИКЛ-40.

Интеракције збуњујућих варијабли са клиничком дијагнозом су искључене из модела (значајност за цео скуп интеракција: п > 0.10). Коефицијент регресије је приказан као "б". Разлике у полној дистрибуцији, старости учесника, узрасту на почетку и годинама од почетка болести између група процењене су Пирсоновим хи-квадратом и АНОВА тестовима, где је то прикладно.

Повезаност између биомаркера и демографских карактеристика испитана је Пирсоновим корелационим тестовима, Студентовим т-тестовима и Манн-Вхитнеи У тестовима, где је то било потребно. Урађен је непараметарски тест тренда (Јонцкхеере тренд тест) да би се проценило постојање тренда када је експозиција показала редне категорије. РОЦ криве су конструисане након моделовања присуства или одсуства дате клиничке дијагнозе помоћу регресионе логистичке анализе.

Нивои експресије ИКЛ{{0}} и ГФАП Вестерн блот-а су нормализовани на њихове одговарајуће контроле пуњења (-тубулин и -актин) и упоређени са средњом вредности контролног односа са непараметарским Манн–Вхитнеи У тестом. На графиконима, нивои ЦСФ и ИКЛ-40 и ЦРП у плазми су приказани као медијана и интерквартилни опсег. Мождана експресија ИКЛ-40 је приказана као средња вредност ± стандардна грешка средње вредности (СЕМ). У свим случајевима, статистичка значајност је постављена на п < 0,05.

Механизам Цистанцхеа лечи Алцхајмерову болест и Паркинсонову болест

Цистанцхе је биљка која се традиционално користи у кинеској медицини за лечење разних здравствених стања, укључујући неуролошке поремећаје као што су Алцхајмерова болест (АД) и Паркинсонова болест (ПД). Цистанцхе садржи неколико биоактивних једињења, укључујући фенилетаноидне гликозиде и иридоидне гликозиде, који имају антиоксидативне, антиинфламаторне и неуропротективне ефекте. Ова једињења помажу у заштити неуронских ћелија од оштећења изазваних слободним радикалима и инфламаторним процесима, за које се верује да доприносе развоју и напредовању АД и ПД.

Поред тога, показало се да Цистанцхе повећава нивое одређених неуротрансмитера у мозгу, укључујући допамин и ацетилхолин, који су важни за нормалну функцију мозга. Повећањем ових нивоа неуротрансмитера, Цистанцхе може помоћи у побољшању когнитивне функције и смањењу симптома АД и ПД.

Све у свему, механизми Цистанцхеа у лечењу АД и ПД укључују његове антиоксидативне, антиинфламаторне и неуропротективне ефекте, као и његову способност да повећа нивое неуротрансмитера у мозгу.

наставиће се...

Виктор Антонио Бланко-Палмеро 1,2,3,†, Маркос Рубио-Фернандез 1,2,†, Десирее Антекера 1,2, Алберто Виљарехо-Галенде 1,2,3, Хосе Антонио Молина 1,2,3, Исидро Ферер 1,4,5,6 , Фернандо Бартоломе 1,2,* и Ева Каро 1,2,*

1 Мрежни центар за биомедицинска истраживања неуродегенеративних болести (ЦИБЕРНЕД), 28031 Мадрид, Шпанија; вицторб1989@гмаил.цом (ВАБ-П.); марцосрубио.имас12@х12о.ес (МР-Ф.); eeara@yahoo.es (ДА); avgalende@yahoo.es (АВ-Г.); cvillaiza@telefonica.net (ЈАМ); 8082ifa@gmail.com (ИФ)

2 Група неуродегенеративних болести, Институт за истраживање болнице 12 де Оцтубре (имас12), 28041 Мадрид, Шпанија

3 Неурологи Сервице Хоспитал Университарио 12 де Оцтубре, 28041 Мадрид, Шпанија

4 Институт за биомедицинска истраживања Беллвитге (ИДИБЕЛЛ), Хоспиталет де Ллобрегат, Е08907 Барселона, Шпанија

5 Одељење за патологију и експерименталну терапију, Универзитет у Барселони, Е08900 Барселона, Шпанија 6 Институт за неуронауке, Универзитет у Барселони, Е08000 Барселона, Шпанија * Преписка: фбартоломе.имас12@х12о.ес (ФБ); царроева@х12о.ес (ЕЦ); Тел.: плус 34-913908765 (ФБ & ЕЦ); Факс: плус 34-913908544 (ФБ & ЕЦ)