Нанозими који опонашају упалу каталазу ублажавају акутну повреду бубрега путем преокретања локалног оксидативног стреса

Абстрацт

Позадина: Тхереактивне врсте кисеоника (РОС)а запаљење, критичан фактор који доприноси оштећењу ткива, добро је познато да је повезано са различитим болестима. Бубрег је подложан хипоксији и рањив на РОС. Дакле, зачарани круг измеђуоксидативни стреси бубрежнихипоксија критички доприносидо прогресијехронична болест бубрегаи коначно,крајња фаза бубрежне болести. Према томе, испорука терапеутских средстава на место упале богатог РОС-ом и ослобађање терапијских средстава је изводљиво решење.

Нове биљке за бубрежне болести

Резултати: Развили смо свестрану нано платформу са дужим циркулацијом, осетљивом на упале и уклањањем РОС-а стабилним учитавањем Мн3О4 (дМн) који опонаша каталазу 1-додекантиол стабилизован3O4) наночестице унутар РОС-осетљиве наноми‑ћелије (ПТЦ), што резултира нанозимом осетљивим на РОС (ПТЦ-М). Хидрофобни дМн3O4наночестице су убачене унутраПТЦ мицеле за спречавање прераног ослобађања током циркулације и делују као терапеутско средство помоћу РОС-реаговањаослобађање напуњеног дМн3O4када је стигла до места упале.

Кључне речи:наночестице Мн3О4, нанозими, упале,Исхемија-реперфузија, бубрег

Позадина

Acute kidney injury (AKI) is the term that covers a broad spectrum of renal function deterioration ranging from small changes in serum creatinine level to conditions requiring renal replacement therapy [1]. The KDIGO (Kidney disease: improving global outcomes) guidelines define AKI as an increase in serum creatinine of either>0.3  mg/dL within 48  h,>1,5 пута од почетне вредности у року од седам дана или смањење запремине урина од<0.5 ml/kg/hour for six hours [1]. AKI is one of the rising global health problems that cause high morbidity and mortality and economic burden [2]. The incidence of AKI defined by the KDIGO guidelines was 21.6% in adults in in-hospital settings [3]. AKI may lead to several complications, including metabolic acidosis, hyperkalemia, uremia, volume overload, and damage to other organ systems, including death. Despite advances in medicine, mortality from AKI is still high. According to a meta-analysis of studies in in-hospital settings, AKI-associated mortality was reported to be 23.9% in adults [3]. The mortality rate of dialysis-requiring AKI patients exceeds 50% [4]. AKI increases the long-term risk of subsequent AKI, progressive chronic kidney disease (CKD), and end-stage renal disease (ESRD) [5]. Eventually, AKI increases socioeconomic and healthcare burdens. Nevertheless, there is no clear treatment for AKI to date. When AKI occurs, conservative treatments such as removing the causative factors, controlling water and electrolyte imbalances, performing renal replacement therapy, if necessary, and waiting for renal function to recover are applied.

Исхемијско-реперфузиона повреда (ИРИ)је повреда органа узрокована пролазним смањењем или престанком крвотока, праћеном реперфузијом, и може се сусрести у различитим клиничким ситуацијама, као што су шок, инфаркт миокарда, исхемијски мождани удар, велика операција и трансплантација органа. ИРИ бубрега је један од водећих узрока АКИ, што доводи до брзог опадања бубрежне функције. Бубрег је орган који је посебно подложан исхемијским увредама и оштећене тубуларне епителне ћелије које последично узрокују поремећено излучивање отпадних продуката и контролу равнотеже воде, електролита и ацидобазне равнотеже [6]. Познато је да механизам оштећења бубрежних тубуларних ћелија код ИРИ укључује запаљење изазвано реактивним врстама кисеоника (РОС) које настају током реперфузије [6–8]. Због тога је било покушаја да се примени уклањање РОС-а на лечење ИРИ. Међутим, његова стварна клиничка употреба је ограничена због забринутости око системских нежељених ефеката, који укључују реакције преосетљивости [9]. Примена антиоксиданата као што је едаравон је већ коришћена за уклањање РОС-а у ИРИ. Међутим, то је праћено са неколико нежељених ефеката, па су стога постављени захтеви за новим и ефикасним антиоксидансима као што су нанозими (наноматеријали који показују активност налик природним ензимима) [9–13]. Иао ет ал. открили су да Мн3О4 нан честице поседују вишеструке активности опонашања ензима, тј. активности опонашања супероксид дисмутазе и каталазе, као и активност уклањања хидроксилних радикала [11]. Показало се да Мн3О4 поседује јачу способност уклањања РОС од других ензима као што су В2О5, ЦеО2, Цо3О4, МнФе2О4 и Фе3О4 и да је бољи од других типова манган оксида (МнОк (МнО2, МнО и Мн2О3).

Слика 1 Шематска илустрација која приказује припрему и начин деловања ПТЦ-М А Синтеза ПТЦ-М, Б Механизам деловања ПТЦ-М (1) интравенска ињекција ПТЦ-М (2) убризгани ПТЦ-М циркулише у крви и акумулира се на месту упале (3) дестабилизација ПТЦ-М услед унутрашњег РОС присутног на месту упале (4) ослобађање напуњеног дМн 3О4 на месту упале (5) ослобођени дМн3О4 катализује уклањање РОС-а што доводи до (6) смањење упале, апоптозе и фиброзе (7) ублажавање оштећења бубрега и (8) побољшане функције бубрега

Резултати

Синтеза и карактеризација дМн3О4 наночестица и полимерних коњугата

Те дМн3О4 НП су синтетизовани методом копреципитације и стабилизовани коришћењем тиолних група 1-додеканетиола (слика 2А). Анализа трансмисијске електронске микроскопије (ФЕ-ТЕМ) показала је да дМн3О4 НП имају просечну величину мању од 2{{10}} нм (18.0±0,6 нм) (слика 2Б ). Додатна датотека 1: Слике С1А и С1Б приказују слике и шематски приказ припремљеног дМн3О4. Подаци енергетске дисперзивне рендгенске спектроскопије (ЕДС) показали су присуство Мн из Мн3О4 и сумпора и угљеника из СХ-Ц12 (Слика 2Ц и Додатни фајл 1: Слика С1Ц). Резултати анализе рендгенске фотонске спектроскопије (КСПС) су приказали КСПС спектар Мн 2п, који се састојао од два пика лоцирана на 641,42 еВ и 653,23 еВ и ови пикови су приписани Мн 2п3/2 и Мн 2п1/2, респективно (Сл. 2Д и Додатни фајл 1: Слика С2). Енергетски јаз између ова два врха био је 11,81 еВ, што је било у добром складу са објављеном литературом за Мн3О4. У узорку дифракције рендгенских зрака на праху (КСРД) дМн3О4 НП, као што је приказано на слици 2Е, сви измерени дифракциони врхови су се добро поклапали са стандардним узорком хаусманита Мн3О4 [ИЦДД: #001–1127], потврђујући њихову високу кристалност природа. ПТЦ коњугат који реагује на РОС је припремљен путем постепених хемијских реакција где је тиокетални (ТК) линкер са терминалном карбоксилатном групом прво одређен. Карбоксилна група ТК линкера је затим коњугована са амино групом метокси-ПЕГ амина (ПЕГ-АМ) коришћењем ЕДЦ/НХС реакције да би се формирао ПЕГ-ТК. Коначно, друга карбоксилна група ПЕГ-ТК је поново коњугована са амино групом стеарамина путем ЕДЦ/НХС реакције [15]. РОС коњугат ПЦ који не реагује је припремљен коњугацијом стеаринске киселине са ПЕГ-АМ. Састав ПТЦ и ПЦ је анализиран спектроскопијом 1Х нуклеарне магнетне резонанце (НМР) (Додатна датотека 1: Слика С3). НМР спектри су показали карактеристичне пикове на δ 0,83 и 1,23 ппм који одговарају метил и метиленским протонима Ц18. Пик на δ 3,6 одговара О–ЦХ2–ЦХ2- ПЕГ-а. Степен супституције (ДС %) Ц18 у ПТЦ и ПЦ је израчунат као 78% и 46%, респективно

Припрема и карактеризација ПТЦ-М ензима

Нано мицеле осетљиве на РОС (ПТЦ) су напуњене дМн3О4, што је резултирало ПТЦ-М. Однос напајања дМн3О4 (20%) ПТЦ-а је коришћен за припрему ПТЦ-М. Хидродинамички пречник, зета потенцијал и ФЕ-ТЕМ слике припремљених ПТЦ и ПТЦ-М приказани су на Слици 3А и Додатном фајлу 1: Слика С4А. ФЕ-ТЕМ слике ПТЦ-а су показале сферичне нано мицеле са уједначеним величинама честица. Хидродинамички пречник ПТЦ-М је благо повећан након пуњења дМн3О4 због паковања дМн3О4 у хидрофобном простору, док је зета потенцијал остао негативан у обе нано мицеле због ПЕГ заштите. ФЕ-ТЕМ слике ПТЦ и ПТЦ-М показале су равномерно распоређене честице. Садржај пуњења и ефикасност енкапсулације су израчунати применом масене спектрометријске анализе и израчунати су на 10±3% и 17±6%, респективно. Присуство дМн3О4 било је видљиво на ФЕ-ТЕМ сликама ПТЦ-М (слика 3А), што је даље потврђено ЕДС анализом ПТЦ-М, показујући Мн из Мн3О4, сумпор и угљеник из СХ-Ц12 и угљеник , азот и кисеоник из ПЕГ (Додатна датотека 1: Слика С5). Извршена је термогравиметријска (ТГА) анализа и израчунато је да је оптерећење дМн3О4 12% (Додатна датотека 1: Слика С6Б). РОС-неосетљиве мицеле напуњене дМн3О4 (ПЦ-М) су такође припремљене као контроле истом методом.

Да би се потврдила улога ТК везе у дестабилизацији ПТЦ-М која реагује на РОС и ослобађању дМн3О4, ПТЦ-М је био изложен РОС условима додавањем Х2О2. Као контроле, користили смо РОС-неосетљиви ПЦ-М. И ПТЦ-М и ПЦ-М су показали сферичну морфологију са чврсто упакованим дМн3О4 у нано мицелама, али након третмана са Х2О2, супра-склоп ПТЦ-М је изобличен, након чега је уследило ослобађање дМн3О4, који је затим агрегирани као што је приказано на ФЕ-ТЕМ сликама, док је ПЦ-М показао стабилне структуре чак и након излагања Х2О2 (Слика 3Б и Додатни фајл 1: Слика С4Б). РОС осетљивост ПТЦ-М даље је потврђена поређењем промена хидродинамичког пречника и зета потенцијала са ПЦ-М, као што је приказано у Додатној датотеци 1: Слика С7. Хидродинамички пречник и зета потенцијал РОС-неосетљивог ПЦ-М нису показали видљиву разлику након додавања Х2О2. Међутим, ПТЦ-М осетљив на РОС показао је смањене хидродинамичке величине, вероватно због уклањања ПЕГ заштите преко ТК лома, што је резултирало дестабилизацијом структуре. Након додавања Х2О2, зета потенцијал се вратио из негативног у позитивно наелектрисање, што би могло бити због уклањања ПЕГ-а и излагања пари. Даље смо проучавали варијацију величине проверавајући стабилност током времена праћењем хидродинамичких пречника у присуству или одсуству Х2О2 (слика 3Ц). Након додавања Х2О2, хидродинамички пречници су се значајно смањили у року од 10 с без даљих промена током времена до шест дана, док је сам ПТЦ-М показао стабилне величине током експеримента, што указује на добру колоидну стабилност ПТЦ-М. Такође смо проверили стабилност у 10% ФБС и приметили да је ПТЦ-М показао добру стабилност до 4 дана (Додатна датотека 1: Слика С9). Хидрокси динамички пречници и варијација зета потенцијала такође су потврђени са РОС-осетљивим и неосетљивим празним нано мицелама (ПТЦ и ПЦ) (Додатна датотека 1: Слика С8). Све ове компаративне студије у присуству или одсуству РОС су показале стабилност и осетљивост на РОС припремљених наномола или коначног дМн3О4 ПТЦ-М ензима.

Слика 2 Синтеза и карактеризација дМн3О4 Шематска илустрација синтезе дМн 3О4, Б ФЕ-ТЕМ слике, Ц ЕДС анализа, Д КСПС спектар и Е КСРД узорци дМн3О4 НП

Даље смо проверили својство елиминације Х2О2 коначног ПТЦ-М ензима због дМн3О4 НП-учитавања. Ово је тестирано коришћењем терефталне киселине (ТА) као сонде за будуће центе. ТА је реаговао са Х2О2 да би формирао 2-хидрокситер фталну киселину са флуоресцентним пиком на 425 нм. дМн3О4 ће претворити Х2О2 у воду и кисеоник и стога се интензитет флуоресцента смањује, потврђујући активност каталазе, као што је приказано на слици 3Д. Те ПТЦ-М је показао снажно смањење интензитета флуоресценције у поређењу са ПТЦ празним мицелом у присуству Х2О2 током времена. Активност ПТЦ-М слична каталази је такође зависила од концентрације, као што је приказано у Додатном фајлу 1: Слика С10. Капацитет производње кисеоника ПТЦ-М је даље потврђен коришћењем О2-специфичне флуоресцентне сонде Ру(ДДП) у присуству Х2О2. Флуоресценција у десет градова Ру(ДДП) се смањује у присуству О2, што указује на ефикасну производњу О2. Као што је приказано на слици 3Е, интензитет флуоресценције Ру(ДДП) се смањио у присуству Х2О2 у ПТЦ-М групи, док је присуство Х2О2 у само ПТЦ групи показало мали пад флуоресценције (слика 3Ф), потврђујући активност каталазе која резултира производњом кисеоника у ПТЦ-М. Коначно, потврдили смо својство елиминације Х2О2 ПТЦ-М помоћу мерача за детекцију кисеоника. Као што је приказано на слици 3Г, производња кисеоника од стране ПТЦ-М је повећана у почетном времену, праћено спорим повећањем, док празне мицеле ПТЦ нису показале производњу кисеоника. Диспропорционалност Х2О2 је примећена формирањем мехурића кисеоника у ПТЦ-М групи као што је приказано у Додатној датотеци 1: Слика С11А. Такође је примећено да је ПТЦ-М показао већу производњу кисеоника у поређењу са самим дМн3О4, вероватно због блиског паковања дМн3О4 у ПТЦ-М, што га чини доступнијим за реакцију у поређењу са слободним дМн3О4 (Додатна датотека 1: Слика С11Б). Иако су се нано мицеле олабавиле због третмана Х2О2, као што је приказано у ФЕ-ТЕМ, дМн3О4 је можда и даље био присутан унутар ПТЦ-М, што је резултирало високом активношћу каталазе у поређењу са слободним дМн3О4. Сви ови резултати заједно потврђују супериорну активност ПТЦ-М опонашања каталазе.

Ин витро виталност ћелија и ћелијска апсорпција

Да бисмо потврдили ћелијски унос и град осетљив на РОС интрацелуларно дистрибуираног ПТЦ-а осетљивог на РОС и образац ослобађања корисног оптерећења, упоредили смо ПТЦ са ПЦ ин витро условима. Прво смо проверили виталност ћелија припремљених ПТЦ, ПЦ, ПТЦ-М и ПЦ-М у ХК-2 ћелијама помоћу ВСТ-1 теста (Додатна датотека 1: Слика С12). Празне мицеле су претрпеле малу ћелијску смрт, али након пуњења дМн3О4-, виталност ћелија се смањила, али промена није била статистички значајна. Пошто празне мицеле нису биле цитотоксичне, мала варијација у виталности ћелије могла би бити последица површински адсорбованог дМн3О4. Утврђено је да ИЦ50 вредност ПТЦ-М и ПЦ-М износи 130,41 и 247,17 уг/мл (слика 4А). За даље испитивање интрацелуларног преузимања и дистрибуције нано мицела, ИР780 је коришћен као модел лека и припремљен је ПТЦ наномелије са ИР780, ПТЦ-ИР780 за визуелизацију интензитета флуоресценције ИР780 користећи забавну микроскопију присутности (Евос ФЛ Ауто 2, С Тхермо Фисхер , САД) (слика 4Б). Као контролна група, такође смо анализирали унос РОС-неосетљивог ПЦ-ИР780. У поређењу са ПЦ-ИР780, ПТЦ-ИР780 је показао веће усвајање у ХК-2 ћелијама (Додатна датотека 1: Слика С13). Тачан разлог за појачано усвајање ПТЦ-ИР780 у не-РОС условима није јасан, међутим, то би могло бити зато што би ПТЦ могао показати благу осетљивост на нормалан ниво РОС у условима ћелијске културе што доводи до уклањања ПЕГ-а са површине. наелектрисање благо позитивно. ПЦ-ИР780 је показао сличан образац узимања без обзира на РОС изазван третманом Х2О2 или стањем РОС изазваним хипоксијом због неосетљиве природе, док је ПТЦ-ИР780 показао другачији образац дистрибуције унутар ћелија, што би могло бити последица појачаног ослобађања ИР780 унутар ћелија. Претходни подаци о виталности ћелија (Додатна датотека 1: Слика С11) који показују повећану ћелијску смрт у ПТЦ-М такође би били због повећаног уноса ПТЦ ћелија у поређењу са ПЦ-ом. ИР780 јодид је високо хидрофобна боја која може показати висок афинитет према ћелијској мембрани и показује веома светао сигнал без обзира на излагање РОС-у. Ћелијски унос је даље анализиран провером средњег интензитета флуоресценције (МФИ) анализом сортирања ћелија активираном флуоресценцијом (ФАЦС) (слика 4Ц), која је подржала податке добијене флуоресцентном микроскопијом. Као што је приказано, МФИ је био највећи у групи ПТЦ ИР780 осетљивој на РОС у поређењу са другим групама, потврђујући појачано ослобађање ИР780 у ћелијама. Даље смо квантификовали МФИ из различитих група (слика 4Д) који су подржали микроскопске податке који сугеришу да ПЦ-ИР780 није показао никакву значајну разлику у ћелијском уносу чак ни под условима изазваним РОС, док је ПТЦ ИР780 показао значајно повећање ћелијског унос када се лечи у условима изазваним РОС. Ћелијски унос ПТЦ-а је такође одређен провером резидуалног Мн у ћелијама након третмана са ПТЦ-М. Као што је приказано на слици 4Е, ПТЦ-М је показао концентрацију зависну од узимања у ХК-2 ћелијама. Ови резултати тако сумирају побољшану интернализацију нано мицела и убрзано ослобађање унутар ћелија вероватно због РОС-посредованог растављања наномицела.

Спровели смо ин витро студије у ћелијама ХК-2 да бисмо даље истражили ефекте ПТЦ-М на услове оксидативног стреса на ћелијском нивоу. ХК-2 ћелије су стимулисане са Х2О2, репрезентативним РОС (слика 5А). Х2О2 је појачала експресију хем оксигеназе (ХО)-1, која је побољшана ПТЦ-М заједничким третманом (слика 5А). Тест Те 2′,7′-дихлородихидрофуоресцеин диацетата (ДЦФ ДА) је изведен да би се проверио образац интрацелуларне промене РОС. Те ХК-2 ћелије стимулисане Х2О2 показале су висок интензитет флуоресценције, али након заједничког третмана са ПТЦ-М, интензитет флуоресценције је смањен (слика 5Б). Однос БАКС/БЦЛ-2 је повећан третманом Х2О2, који је такође обновљен ПТЦ-М третманом, што указује на заштиту од апоптозе (Слика 5Ц). ХК-2 ћелије третиране Х2О2 показале су значајно прогресивно повећање бојења анексином В+/ПИ−, што је спречило ПТЦ-М (слика 5Д). Фосфорилација ЕРК, ЈНК и п38 изазвана Х2О2- је такође потиснута заједничким третманом са ПТЦ-М, иако није примећено значајно смањење фосфорилисаног П38 (слика 5Ц). Ови подаци сугеришу да је ПТЦ-М потиснуо апоптотичке процесе изазване РОС-ом у бубрежним тубуларним епителним ћелијама.