Истраживање токсичности ифосфамида изазива уобичајени узводни регулатор у јетри и бубрезима

Контакт: emily.li@wecistanche.com

Хиоунг-Иун Хан, ет ал

Апстрактан:

Ифосфамид је средство за алкиловање, синтетички аналог циклофосфамида, који се користи за лечење различитих чврстих карцинома. У овој студији, токсичност ифосфамида је процењена применом једне и више доза интраперитонеалне примене код пацова у складу са смерницама добре лабораторијске праксе, а праћен је додатним микромрежним експериментом да би се подржали токсиколошки налази. Једна доза ифосфамида (50 мг/кг) није изазвала никакве патолошке промене. У међувремену, опажена је тешка ренална токсичност у групама које су примењиване 7 и 28 дана узастопно, са значајним повећањем нивоа азота урее и креатинина у крви. У анализи токс-листе, гени повезани са синтезом холестерола су највише погођени у јетри, а гени повезани са бубрежном инсуфицијенцијом су погођени убубреганакон примене ифосфамида. Штавише, регулаторни фактор 7 интерферона је изабран као главни узводни регулатор који се променио у обајетраибубрега, и откривено је да ступа у интеракцију са другим циљним генима, као што је убиквитин специфична пептидаза 18, радикални С-аденозил метионин домен који садржи 2 и ген 15 стимулисан интерфероном, што је даље потврђено РТ-ПЦР анализом у реалном времену. У закључку, поново је потврђена токсичност ифосфамида на органе у зависности од бубрега и идентификовани идентично измењени гени у обајетраибубрега. Потребне су даље свеобухватне токсикогеномске студије да би се открио тачан однос између гена изазваних ифосфамидом и токсичности органа.

Кључне речи:ифосфамид; хепатотоксичност; нефротоксичност; интраперитонеална токсичност

Цистанцхе је добар за јетру и бубреге

1. Представљање

Ифосфамид је алкилирајући агенс, синтетички аналог циклофосфамида, који се користи за лечење различитих чврстих карцинома, укључујући саркоме и лимфоме. Ифосфамид је неспецифичан лек против рака ћелијског циклуса који омета репликацију ДНК и производњу РНК [1]. Иако се ифосфамид релативно добро толерише у поређењу са другим токсичним алкилујућим агенсима, познато је да је повезан са бројним нежељеним ефектима опасним по живот који ограничавају његову клиничку употребу [2]. Главни нежељени ефекти ифосфамида укључују тешку повреду бубрега која је резултат реактивних токсичних врста из ифосфамида, укључујући акутнебубрега повреда, интерстицијски нефритис, хеморагични циститис и Фанконијев синдром [3]. У клиникама је пријављена тешка вишеорганска токсичност код пацијената који су искусили рану реналну токсичност и поновљену инсуфицијенцију једног органа изазвану високим дозама ифосфамида што је довело до накнадног затајења органа [4,5].

Токсични метаболит ифосфамида, акролеина и хлороацеталдехида је главни одговорни фактор за токсичност ифосфамида на органе. Претходне студије су се углавном фокусирале на факторе који утичу на конверзију ифосфамида у токсичне метаболите, посебно цитохром П450 (ЦИП) [6]. Релативно обиље ЦИП3А4 и ЦИП3А5 у бубрезима доводи до токсичних промена у ифосфамиду и индукује нефротоксичност [7]. Акролеин је високо реактиван алдехид који може активирати интрацелуларни реактивни оксидативни пут гена и оштетити ћелијске органеле. Хлороацеталдехид је известио о супресији активације комплекса И у митохондријском респираторном ланцу што може довести до исцрпљивања интрацелуларног глутатиона (ГСХ) и смрти ћелије [8].

Токсиколошка студија више органа је од веће помоћи у разумевању системских ефеката лекова него циљање специфичних органа за студије токсичности. Јетра и бубрези су главни органи који учествују у метаболизму и излучивању лекова, и ови главни органи су предиспонирани на нежељене реакције на лекове; често следи токсичност органа. Штавише, интегративна токсиколошка евалуација може представити различите патолошке налазе који могу помоћи у разумевању и предвиђању токсичности изазване лековима у систему.

Многе студије су користиле профиле експресије гена за предвиђање потенцијалних негативних ефеката хемикалија. Међутим, већина ранијих студија била је фокусирана на процену токсичности једног циљаног органа, са само ограниченим патолошким симптомима [9]. Штавише, у комбинацији са профилисањем гена заснованим на микромрежу, то ће произвести свеобухватно разумевање токсичности на нивоу система које може спречити потенцијалну токсичност у вези са лековима [10]. У том смислу, интегративни вишеоргански токсиколошки приступи са профилисањем генске експресије коришћени су у студијама модела предвиђања токсичности да би се превазишли подаци о токсичности добијени проценом токсичности једног органа, што је недовољно за разумевање токсичних механизама лекова у систему [11].

У овој студији описујемо токсичност ифосфамида убубрегаијетранакон акутног и поновљеног излагања код Спрагуе-Давлеи (СД) пацова. Урађени су тестови профилисања експресије подржавајућих гена да би се открио заједнички циљни ген који је измењен ифосфамидом у јетри ибубрега, што сугерише увид у интегративну токсичност ифосфамида.

2. Резултати

2.1. Студија токсичности појединачне дозе

Није примећена токсичност у групама ифосфамида од 12,5, 25 и 50 мг/кг—не смрт, симптоми токсичности, промене телесне тежине или хистопатолошки налази.

У међувремену, у хематолошкој студији, релативни број ретикулоцита (РЕТ) и апсолутни број неутрофила (НЕУА) и лимфоцита (ЛИМА) смањио се на начин који зависи од дозе.

2.2. Једнонедељна студија токсичности поновљених доза

Укупна телесна тежина се смањила након 1 недеље примене ифосфамида, а средње вредности губитка телесне тежине у групи од 100 мг/кг биле су веће од оних у групи са 75 мг/кг (Табела 1). У међувремену, релативна тежина органа се постепено повећавала у групама које су третиране ифосфамидом (Табела 2).

Једна недеља узастопне ИП администрације ифосфамида потиснула је хематолошки индекс, укључујући РБЦ, ХГБ, ХЦТ, МЦВ и ПЛТ, на начин који зависи од дозе (Табела 3). Штавише, БУН и ЦРЕА су порасли 1,2 пута у контролној групи у поређењу са групом која је примала ифосфамид (Табела 4).Бубрегповредаје додатно подржано хистопатолошком студијом.

Нису примећени хистопатолошки знаци у јетри мишева у групама ифосфамида од 75 и 100 мг/кг (Слика 1А). У међувремену, тхебубрезииз група од 75 и 100 мг/кг ифосфамида утврђено је да имају минималан до благи степен патолошких промена, укључујући тубулну дегенерацију/дилатацију (1 умерена у групи од 100 мг/кг), некрозу једне ћелије, хиперплазију уротела и фокално крварење /загушења (табела 5). Поред тога, примећено је евидентно повећање експресије КИМ-1 у пределу бубрежних тубула убубрегагрупе од 100 мг/кг (Слика 1Б).

2.3. Четворонедељна студија токсичности поновљених доза

Смртност је примећена у групама које су примале 50 (5/10) и 70 (10/10) мг/кг након 21 и 10 дана узастопне примене, респективно. Штавише, смањена телесна тежина са повећаном релативном тежином органа,јетра, ибубрега, у свим групама које су третиране ифосфамидом, подржава токсичност поновљених доза током 4-недеље.

Преживелим испитаницима урађене су хематолошке и биохемијске анализе серума. Неколико параметара крви, укључујући РЕТ, РБЦ, МОНА, ЕОСА и ЛУЦА, значајно су смањени након 4 недеље примене ифосфамида.

У поређењу са контролном групом, биохемијске анализе су показале статистичке разлике након 4 недеље примене ифосфамида. На пример, нивои АСТ и ЦК су значајно повећани, а однос А/Г, ГЛУ и ГГТ су смањени (п < 0.01)="" у="" групи="" третираној="" 50="" мг/кг,="" у="" поређењу="" са="" контролном.="">

2.4. Анализа експресије гена изазвана ифосфамидом

ДЕГ-ови изазвани ифосфамидом су идентификовани у јетри ибубрегаткива (табела 6). За јетру, различито експримирани гени укључивали су 2672 гена при дози од 100 мг/кг ТМ/дан, 1283 гена су појачано регулисани, а 1389 гена су смањени. У бубрезима, 401 ген је био различито експримиран при 100 мг/кг ТМ/дан - 149 гена је повећано, а 252 гена је било смањено. И у јетри и у бубрезима, број гена смањене регулације био је већи од броја гена који су регулисани навише. Ово би могло сугерисати да третман ифосфамидом инхибира експресију гена.

Резултати анализе биолошке функције су наведени у табели 7. Утврђено је да 1-недељна примена ифосфамида мења гене повезане са развојем органа, углавном у јетри. Убубрега, потврђено је да су највише погођени гени који се односе на локализацију имуних ћелија.

У канонској анализи пута ДЕГ-а, промене у синтези холестерола и генима везаним за пут презентације антигена су евидентне ујетраибубрегаткива, респективно (слика 2). Штавише, ЛКСЕ/РКСР и сигнализација одговора на акутну фазу били су уобичајени канонски пут регулисаног врха ујетраибубрега, који су били укључени у хомеостазу липида и сигнализацију инфламаторних цитокина, респективно.

У анализи токсиколошке листе јетре, највише су погођени гени повезани са синтезом холестерола, праћени позитивним протеинима одговора акутне фазе и панелом за акутну бубрежну инсуфицијенцију (Табела 8). Штавише, резултати листе бубрега открили су да су гени повезани са бубрежном инсуфицијенцијом генерално погођени ифосфамидом, укључујући реверзибилне биомаркере гломерулонефритиса и панел за акутну бубрежну инсуфицијенцију.

На основу ИПА базе знања, уобичајени узводни регулатор регулише експресију гена у јетри и бубрезима након третмана ифосфамидом (Слика 3). ИРФ7 је био главни регулатор који се мењао и у јетри и у бубрезима и откривено је да је у интеракцији са другим циљним генима као што су УСП18, РСАД2 и ИСГ15. Штавише, РТ-ПЦР анализа у реалном времену потврдила је експресију ИРФ7, УСП18, РСАД2 и ИСГ15. Иако је обим промена у сваком гену био различит између јетре и бубрега, експресија је била потиснута у ткивима јетре и бубрега након 1 недеље примене ифосфамида. РСАД2 и УСП18 су углавном изменили гене третманом ифосфамидом у јетри, односно у бубрезима.

3. Дискусија

У овој студији, истражена је свеобухватна токсичност ифосфамида на више органа са различитим дозама и терминима изложености ИП путем код пацова према ГЛП стандарду. У клиникама, ифосфамид може да испољава бимодално антитуморско дејство са цитотоксичним и имуномодулаторним ефектима у комбинацији са адоптивном имунотерапијом [12]. Познато је да се ифосфамид углавном елиминише путем бубрега и да је око 80 процената дозе у непромењеном облику, нефротоксичност је опште позната нуспојава ифосфамида, а метаболити као што су хлороацеталдехид и акролеин су одговорни за његову клиничку употребу [13, 14].

У овој студији, 1-недељна поновљена студија токсичности била је погодна за истраживање токсичности органа изведене из ифосфамида. Једнонедељна примена ифосфамида потиснула је крвни индекс на начин који зависи од дозе, што може одражавати типичну мијелосупресију изведену из ифосфамида. Поред нефротоксичности, неколико извештаја је показало да је мијелосупресија једна од главних токсичности ифосфамида која ограничава дозу, а леукопенија је генерално тежа од тромбоцитопеније [15,16]. Нефротоксичност ифосфамида може довести до Фанконијевог синдрома, у коме долази до оштећења функције проксималних тубула што доводи до иреверзибилног оштећења, а токсични метаболит акролеин изазива уротоксичност код хеморагичног циститиса [17]. Ово је у складу са резултатима ове студије. У хистопатолошкој студији, бубрези и јетра су прегледани да би се истражиле патолошке промене које су изведене из ифосфамида. И у групама које су примале ифосфамид од 75 и 100 мг/кг, откривена су велика подручја тубуларне дегенерације и дилатације са хиперплазијом уротела у пределу бубрежне карлице. Штавише, експресија КИМ-1, молекула повреде проксималног тубула бубрега, подржава присуство нефротоксичности повезане са ифосфамидом. У међувремену, у јетри је примећена само минимална перипортална вакуолација. Штавише, иако су се вредности АСТ и АЛТ смањиле у зависности од дозе, промене су биле унутар референтног опсега [18]. Дубље разлоге за смањење нивоа јетрених ензима треба даље проучавати. Опште је прихваћено да је ифосфамид алкилирајући агенс који се ретко повезује са хепатотоксичношћу, а само неколико случајева је пријављено да изазива оштећење јетре, посебно када се комбинује са другим хемотерапијским лековима као што је доксорубицин [19].

Недавно је приметан напредак у подацима о експресији гена у токсикологији са технологијама високе пропусности довео до стварања довољно великих скупова података у студијама токсичности, а учињено је много покушаја да се профил гена примени на предвиђање хемијске токсичности [10,20]. У овој студији, анализа микромрежа је спроведена да би се анализирао одговор транскриптома изазван применом ифосфамида, а ДЕГ са променом пута већом или једнаком 1,5 изабрани су као циљни ген и коришћени су биолошка функција, канонски пут и анализа Ток листе. да разумеју функцију гена изазваних ифосфамидом. Урађена је додатна анализа узводног регулатора да би се проценила могућност токсичности за више органа у јетри и бубрезима.

У овој студији, ДЕГ су се променили 15-пут, а смањени гени су били нешто доминантнији од гена са повећаном регулацијом и у јетри (52 процента) и у бубрезима (62 процента). Резултати анализе биолошке функције су показали да ифосфамид мења гене, са биолошким функцијама које се односе на развој ткива које се обично примећују и у јетри и у бубрезима.

Претходна студија Сноубера ет ал. [21] је откривено да третман ифосфамидом наниже регулише Нрф-2 путеве оксидативног одговора на стрес у микрофлуидној култури [21]. У складу са претходним студијама, НРФ2-посредовани пут одговора на оксидативни стрес био је значајно модулисан од стране врхунских мрежа, што је потврђено и садашњим канонским путем и анализом токс листе. Садашњи измењени Нрф-2 путеви оксидативног одговора на стрес могу бити блиско повезани са токсичним метаболитом ифосфамида. Вишеструки токсични метаболити ифосфамида могу да реагују са ГСХ, снажним антиоксидантом, да формирају коњугате на различитим местима дуж пута, а смањење нивоа ГСХ доводи до повећане токсичности, што указује на импликацију оксидативног стреса у токсичности органа ифосфамида [8,22 ]. У том смислу, месна и Н-ацетилцистеин су коришћени за ублажавање токсичности ифосфамида на органе. Месна служи као регионални детоксификатор тако што се везује за токсични метаболит ифосфамида, углавном против акролеина, преко Мицхаеловог додатка да би се формирала мање штетна супстанца [23]. Поред тога, наводи се да Н-ацетилцистеин има антиоксидативну активност и побољшава смањење ГСХ у условима оксидативног стреса [24]. Потребне су даље студије да би се разјаснио тачан однос између антидота ифосфамида и пута регулисаног у нефротоксичним условима. Можемо спекулисати да би побољшање токсичности ифосфамида помоћу месна или Н-ацетилцистеина могло бити праћено побољшаним путевима оксидативног одговора на стрес посредовани Нрф-2-.

У овој студији, сигнали повезани са упалом су обично били појачани и у јетри и у бубрезима, што се може препознати сигнализацијом акутне фазе у анализи канонског пута. Овај резултат је указао на импликацију инфламаторне реакције у патофизиологији токсичности органа ифосфамида у оба ткива, што је додатно подржано анализом узводног регулатора. У анализи узводног регулатора, гени повезани са сигналом ИРФ7 и интерфероном (ИФН), укључујући УСП18, РСАД2 и ИСГ15, одабрани су као уобичајени узводни регулатори у јетри и бубрезима. ИРФ7 је лимфоидно-специфичан фактор, који је конститутивно експримиран у цитоплазми имуне ћелије, а може бити индукован интерфероном типа И, вирусном инфекцијом и спољашњим стимулансима у различитим ћелијама [25]. Претходна студија је известила о контроверзним про- или антионкогеним особинама ИРФ7 у различитим туморским ћелијама, а промене у експресији ИРФ7 биле су повезане са оштећењем ДНК [26–28].

Поред његове важне регулаторне улоге у ИФН-у типа И за антивирусне функције, за ИРФ7 је пријављено да потискује инфламаторне одговоре преко ТЛР4 сигналног пута [29]. Штавише, Стоут-Делгадо ет ал. [30] су известили да старење изазвано оксидативним повећањем смањује активност ИРФ7, док смањење стреса антиоксидативним агенсима побољшава активност ИРФ7. У овој студији, примена ифосфамида је потиснула експресију узводних регулатора, а обрасци експресије су били идентични и у јетри и у бубрезима. Садашње промене у експресији ИРФ7 могу се односити на инфламаторну реакцију и својство ифосфамида цитотоксичног алкилационог агенса, што би могло да сугерише ИРФ7 као обећавајућу мету за токсичност органа ифосфамида.

У овој студији смо пронашли ген који је био идентично инхибиран и у јетри и у бубрезима након примене ифосфамида, али је тумачење његовог токсиколошког значаја било фокусирано само на бубрег, што ограничава тренутно откриће. Штавише, даље потврдне студије у вези са ефектом комерцијално доступног антидота ифосфамида на тренутно измењени ген могу подржати садашње налазе.

У закључку, утврђено је да поновљена студија токсичности (1 недеља) примене ифосфамида има пристрасну нефротоксичност, а не хепатотоксичност. Поред тога, садашњи резултати пружају доказе о хепатотоксичности и механизму нефротоксичности изазване ифосфамидом који укључује инхибицију ИРФ-7. Потребне су даље токсикогеномске студије органа повезаних са имунитетом да би се разјаснио системски токсиколошки механизам ифосфамида и да би се подржала веза између токсичности гена и органа.

4. Материјали и методе

4.1. Студија о животињама

Осмонедељни пацови Спрагуе-Давлеи (СД) без патогена специфичних за мушкарце (н=140) су добијени од Ориент Био Инц. (Сеонгнам, Кореја). Животиње су прегледане и аклиматизоване на лабораторијске услове животне средине недељу дана пре експеримента. Све животиње су смештене у пластичне кавезе у контролисаним лабораторијским условима (температура, 23 ± 3 ◦Ц; влажност, 55 ± 10 процената; и 12/{10}} х циклус светлости/мрака) са лабораторијском храном и водом ад либитум. Студију на животињама одобрио је Институционални комитет за негу и употребу животиња Корејског института за токсикологију (Даејеон, Кореја), а све процедуре су спроведене у складу са Смерницама за тестирање за процену безбедности лекова Корејске управе за храну и лекове. Студија на животињама је подељена у три одељка: студија токсичности узастопне примене појединачне дозе (акутна) и поновљене дозе (1 недеља и 4 недеље). Четрдесет пацова је насумично распоређено у четири групе (контролна, т1,т2 и т3) коришћењем система Патх/Ток (верзија. 4.2.2, Ксибион Медицал Системс Цорпоратион, Лавренцевилле, Њ, САД) у свакој студији токсичности.

4.2. Експеримент са токсичношћу

Студија токсичности је подељена у три дела: студије токсичности појединачне дозе (акутне) и две поновљене дозе (узастопна доза од 1 недеље или 4 недеље). За сваку студију токсичности, пацови су насумично распоређени у адекватне групе (контрола, доза 1, доза 2 и доза 3 за једноседмичне и 4-недељне студије токсичности; контролна, доза 1 и доза 2 за 1- седмична студија токсичности) коришћењем система Патх/Ток (верзија 4.2.2, Ксибион Медицал Системс Цорпоратион, Лавренцевилле, Њ, САД). У студији токсичности, ифосфамид је даван интраперитонеалним (ИП) путем, а контролна група је примала дестиловану воду (ДВ). Доза ифосфамида коришћена у студији токсичности била је следећа: студија акутне токсичности (12,5, 25 и 50 мг/кг), 1-недељна студија токсичности (75 и 100 мг/кг ТМ/дан) и {{19 }}недељна студија токсичности (25, 50 и 70 мг/кг ТМ/дан). Општи клинички симптоми, телесна тежина и морталитет животиња бележени су свакодневно током примене, а све животиње су жртвоване 24 х након последње примене ифосфамида. Узорци крви су сакупљени и стављени у микроцентрифужне епрувете и ЕДТА-К2 епрувете за биохемију серума и хематолошку анализу. Ткива јетре и бубрега су фиксирана у формалдехиду и подвргнута хистопатолошкој анализи. Додатна имунохистохемија, анализа микромрежа и РТ-ПЦР у реалном времену су обављени на ткивима јетре и бубрега из студије субакутне токсичности (100 мг/кг ТМ/дан).

4.3. Хематолошка и биохемијска анализа серума

Стандардни хематолошки тестови су обављени коришћењем АДВИА 120 хематолошког система (Баиер, Фернвалд, Немачка). Коришћени су следећи индикатори: број белих крвних зрнаца (ВБЦ), број црвених крвних зрнаца (РБЦ), хематокрит (ХЦТ), концентрација хемоглобина, средњи корпускуларни волумен (МЦВ), средњи корпускуларни хемоглобин (МЦХ), број тромбоцита (ПЛТ), број лимфоцита (ЛИМ), моноцита (МОН), неутрофила (НЕУ), базофила (БАС), еозинофила (ЕОС) и великих необојених ћелија (ЛУЦ) и ретикулоцита (РЕТ).

Биохемијски тест је изведен коришћењем аутоматског анализатора (ТБА 120ФРНЕО; Тосхиба Цорп., Токио, Јапан) са центрифугираним серумом. Главни биохемијски индикатори су били аланин аминотрансфераза (АЛТ), аспартат аминотрансфераза (АСТ), алкална фосфатаза (АЛП), азот у урину (БУН), креатинин (ЦРЕА), глукоза (ГЛУ), укупни холестерол (ТЦХО), однос албумин/глобулин (А/Г), триглицериди (ТГ), укупан билирубин (ТБ), гама-глутамил трансфераза (ГГТ), фосфолипиди (ПЛ), калцијум, хлорид, неоргански натријум, фосфор и калијум.

4.4. Хистопатолошко и имунохистохемијско испитивање

Ткива уграђена у парафин су исечена на 5- µм дебљине, обојена хематоксилином и еозином (Х&Е) и прегледана микроскопски.

Ткиво бубрега је подвргнуто имунохистохемији. Депарафинизовани и испрани делови су претходно инкубирани са 10 процената козјег серума да би се блокирало неспецифично бојење. Стакалца су затим инкубирана преко ноћи са примарним анти-КИМ1 антителом (1:750; Санта Цруз, Калифорнија, САД). Након уклањања примарних антитела, пресеци су обрађени ВЕЦТАСТАИН Елите АБЦ ХРП комплетом (Вецтор Лабораториес, Петербороугх, УК), а КИМ1експресија је испитана под светлосним микроскопом.

4.5. Анализа микромрежа и анализа интеракције протеина и протеина (ППИ).

Јетра и бубрези из групе 1-недеља (100 мг/кг) су хомогенизовани, а укупна РНК је екстрахована помоћу РНасе мини кита (Киаген). Синтеза цДНК је постигнута коришћењем комплета за синтезу цДНК (Аффиметрик, Аффиметрик, Санта Цлара, ЦА, УСА) и подвргнута микромрежним и ППИ анализама.

Анализа микромрежа је обављена коришћењем Аффиметрик ГенеЦхип Рат {{0}}.0 са ГенеЦхип скенером 3000 (Аффиметрик Санта Цлара, ЦА, УСА) и резултати су обрађени коришћењем софтвера за анализу ГенеСпринг ГКС в13.0 (Агилент Тецхнологиес, ​​Санта Цлара, Калифорнија, САД). Диференцијално изражени гени (ДЕГ), који су се променили више од 15-пута након примене ифосфамида, одабрани су коришћењем једносмерне анализе варијансе (АНОВА) са Тукеијевим пост хоц тестом. Биолошке функције и канонски путеви одабраних ДЕГ-ова су анализирани коришћењем софтвера Ингенуити Патхваи Аналисис (ИПА, верзија 9.0; Ингенуити Системс, Редвоод Цити, Калифорнија, САД), а извршена је анализа узводног регулатора да би се идентификовали узводни регулатори који би могли бити одговоран за ДЕГ добијене од токсичности ифосфамида. Мрежна анализа ДЕГ-ова додатне протеин-протеин интеракције (ППИ) изведена је коришћењем СТРИНГ софтвера (верзија 10), а интеракција је потврђена када је средњи скор поузданости био већи од 0,4. Интеракција протеина је приближна вероватноћа да постоји предвиђена веза између два протеина у Кјото енциклопедији гена и генома.

4.6. Квантитативна РТ-ПЦР студија у реалном времену

Експресија уобичајених регулаторних гена у студији микромрежа је потврђена коришћењем квантитативне РТ-ПЦР у реалном времену. Гене-специфични прајмери ​​су добијени од Бионеер-а (Даејеон, Кореја). Секвенце прајмера су биле следеће: регулаторни фактор интерферона 7 (ИРФ7): напред, 5-ТГЦТТГТЦТАГЦАЦЦААТАГ-3 и обрнуто, 5-ЦАЦААГГТЦЦАЦТАГАГАТГ-3; убиквитин специфична пептидаза 18 (УСП18): напред, 5-ЦТГТАГТТТГТЦТЦЦЦААЦА-3 и обрнуто 5-ГААЦТГАТТАЦЦТЦЦЦАЦТГ-3; радикални домен С-аденозил метионина који садржи 2(РСАД2): напред, 5-АЦЦААТЦАТЦАГАГГТТГАЦ-3 и обрнуто, 5-ЦТГЦАТГАТТГТТЦТТГГАЦ-3; интерфероном стимулисан ген 15 (ИСГ15): напред, 5-ААГТЦТЦЦЦААГАЦЦААТТЦ-3и обрнуто, 5-ЦТАЦАТТГГЦТЦТГГАТАГГ-30.

Укупна РНК је реверзно транскрибована на цДНК коришћењем СуперСцрипт ИИ (Инвитроген, Царлс бад, ЦА, УСА) и олиго-дТ прајмера, према упутствима произвођача. Нивои експресије мРНА узводних регулаторно повезаних гена су анализирани коришћењем система ПЦР у реалном времену СтепОнеПлус (Апплиед Биосистемс, Царлсбад, Калифорнија, САД) са анСИБР Греен мастер мешавином (Апплиед Биосистемс), у складу са протоколом произвођача. Прајмер 18С рибосомалне РНК је коришћен као интерна контрола, а резултати су изражени као промена у прегибу у односу на нормалну контролну групу.

4.7. Статистичка анализа

Подаци су статистички анализирани коришћењем вишеструких метода поређења. Када Бартлетов тест није показао значајна одступања од хомогености варијансе, коришћена је анализа варијансе (АНОВА) да се утврди да ли се било која од средњих вредности групе разликује на нивоу значајности п < {{0}}.05.="" поред="" тога,="" дуннеттов="" тест="" је="" коришћен="" за="" утврђивање="" разлика="" у="" подацима="" између="" контролне="" и="" третиране="" групе="" када="" је="" утврђено="" да="" су="" подаци="" значајни="" из="" анова="" теста.="" штавише,="" када="" су="" уочена="" значајна="" одступања="" од="" хомогености="" варијансе="" из="" бартлетовог="" теста,="" спроведен="" је="" непараметарски="" тест="" поређења,="" крускал–волис="" (х)="" тест,="" да="" би="" се="" утврдило="" да="" ли="" се="" било="" која="" од="" средњих="" вредности="" групе="" разликује="" на="" п="">< 0,05.="" када="" је="" примећена="" значајна="" разлика="" у="" крускал-волисовом="" (х)="" тесту,="" спроведен="" је="" даннов="" подтест="" ранга="" да="" би="" се="" квантификовали="" специфични="" парови="" групних="" података="" који="" су="" се="" значајно="" разликовали="" од="" средње="" вредности.="" фишеров="" тачан="" тест="" је="" спроведен="" да="" би="" се="" упоредили="" парови="" података="" (укључујући="" преваленцију="" и="" проценат).="" ниво="" вероватноће="" је="" постављен="" на="" 1="" или="" 5="" процената.="" статистичке="" анализе="" су="" обављене="" упоређивањем="" података="" из="" различитих="" група="" третмана="" са="" онима="" из="" контролне="" групе="" користећи="" патх/ток="" (верзија.="" 4.2.2,="" ксибион="" медицал="" системс="" цорпоратион,="" лавренцевилле,="" њ,="">

Изјава о доступности података:

Подаци су садржани у чланку или додатним материјалима.

Сукоби интереса:

Аутори изјављују да немају супротстављене интересе.

Референце

1. Палмерини, Е.; Сетола, Е.; Григнани, Г.; Д'Амбросио, Л.; Командоне, А.; Ригхи, А.; Лонгхи, А.; Цесари, М.; Паиоли, А.; Хаким, Р.; ет ал. Висока доза ифосфамида код пацијената са релапсом и нересектабилним остеосаркомом високог степена: ретроспективна серија. Ћелије 2020, 9, 2389. [ЦроссРеф]
2. Кластерски, Ј. Нежељени ефекти ифосфамида. Онкологија 2003, 65, 7–10. [ЦроссРеф]
3. Спрангерс, Б.; Лапман, С. Болови раста ифосфамида. Цлин. Киднеи Ј. 2020, 13, 500–503. [ЦроссРеф]
4. Елиас, АД; Аиасх, Љ; Вхеелер, Ц.; Сцхвартз, Г.; Теплер, И.; МцЦаулеи, М.; Мазанет, Р.; Сцхниппер, Л.; Фреи, Е., 3.; Антман, КХ Висока доза ифосфамида/карбоплатина/етопозида са подршком аутологним хематопоетским матичним ћелијама: безбедност и будући правци. Семин. Онцол. 1994, 21, 83–85. [ПубМед]
5. Моленкопф, А.; Ду Боис, А.; Меерпохл, ХГ Секвенцијални ток и проспективно управљање токсичности више органа изазване ифосфамидом. Гебуртсхилфе Фрауенхеилкд. 1996, 56, 525–528. [ЦроссРеф]
6. Алекса, К.; Матселл, Д.; Краусз, К.; Гелбоин, Х.; Ито, С.; Корен, Г. Цитокром П450 3А и 2Б6 у бубрегу у развоју: Импликације за нефротоксичност ифосфамида. Педиатр. Непхрол. 2005, 20, 872–885. [ЦроссРеф] [ПубМед]
7. Ловенберг, Д.; Тхорн, ЦФ; Деста, З.; Флоцкхарт, ДА; Алтман, РБ; Клеин, ТЕ ПхармГКБ резиме: Ифосфамидни путеви, фармакокинетика и фармакодинамика. Пхармацогенет. Геном. 2014, 24, 133. [ЦроссРеф] [ПубМед]
8. МацАллистер, СЛ; Мартин-Брисац, Н.; Лау, В.; Ианг, К.; О'Бриен, ПЈ Акролеин и хлороацеталдехид: Испитивање ћелијских и безћелијских биомаркера токсичности. Цхем. Биол. Интеракција. 2013, 202, 259–266. [ЦроссРеф]
9. Ким, Ј.; Схин, М. Интегративни модел предвиђања токсичности изазване више органа лековима користећи податке о експресији гена. БМЦ Биоинформ. 2014, 15, С2. [ЦроссРеф]
10. Алекандер-Данн, Б.; Прутеану, ЛЛ; Оертон, Е.; Схарма, Н.; Бериндан-Неагое, И.; Модос, Д.; Бендер, А. Развој токсикогеномике: Разумевање и предвиђање токсичности изазване једињењем из података о експресији гена. Мол. Омикс 2018, 14, 218–236. [ЦроссРеф]
11. Ан, ИР; Ким, ЈИ; Ким, ИС Изградња предиктивног модела за процену токсичности више органа. Мол. Целл Токицол. 2016, 12, 1–6. [ЦроссРеф]
12. Биното, Г.; Трентин, Л.; Семензато, Г. Ифосфамид и циклофосфамид: Ефекти на имунонадзор. Онкологија 2003, 65, 17–20. [ЦроссРеф]
13. Сцхвердт, Г.; Горђани, Н.; Бенешић, А.; Фреудингер, Р.; Воллни, Б.; Кирцххофф, А.; Гекле, М. Хлороацеталдехид- и акролеининдукована смрт ћелија људских проксималних тубула. Педиатр. Непхрол. 2006, 21, 60–67. [ЦроссРеф]
14. Енсергуеик, Г.; Палет, Н.; Јоли, Д.; Леви, Ц.; Цхаувет, С.; Тривин, Ц.; Аугусто, ЈФ; Боудет, Р.; Абоудагга, Х.; Тоуцхард, Г.; ет ал. Нефротоксичност ифосфамида код одраслих пацијената. Цлин. Киднеи Ј. 2020, 13, 660–665. [ЦроссРеф]
15. Децхант, КЛ; Брогден, РН; Пилкингтон, Т.; Фаулдс, Д. Ифосфамиде/месна. Преглед његове антинеопластичне активности, фармакокинетичких својстава и терапеутске ефикасности код рака. Другс 1991, 42, 428–467. [ЦроссРеф]
16. Пронк, ЛЦ; Сцхријверс, Д.; Шеленс, ЈХМ; Де Бруијн, ЕА; Плантинг, А.; Лоцци-Тонелли, Д.; Гроулт, В.; Вервеиј, Ј.; Ван Оостером, АТ Фаза И студија о доцетакселу и ифосфамиду код пацијената са узнапредовалим солидним туморима. Бр. Ј. Цанцер. 1998, 77, 153–158. [ЦроссРеф] [ПубМед]
17. Скиннер, Р. Хронична нефротоксичност ифосфамида код деце. Мед. Педиатр Онцол. 2003, 41, 190–197. [ЦроссРеф]
18. Схарп, П.; Вилано, ЈС Лабораторијски пацов; ЦРЦ Пресс: Боца Ратон, ФЛ, САД, 2012.
19. Цхеунг, МЦ; Јонес, РЛ; Јудсон, И. Акутна токсичност јетре са ифосфамидом у лечењу саркома: приказ случаја. Ј. Мед. Цасе Реп. 2011, 5, 180. [ЦроссРеф]
20. Цуи, И.; Паулес, РС Употреба транскриптомике у разумевању механизама токсичности изазване лековима. Фармакогеномика 2010, 11, 573–585. [ЦроссРеф]
21. Сноубер, ЛЦ; Јацкуес, С.; Монге, М.; Легаллаис, Ц.; Лецлерц, Е. Транскриптомска анализа ефекта ифосфамида на МДЦК ћелије култивисане у микрофлуидним биочиповима. Геномика 2012, 100, 27–34. [ЦроссРеф] [ПубМед]
22. Дирвен, ХА; Мегенс, Л.; Оудсхоорн, МЈ; Дингемансе, МА; ван Омен, Б.; Ван Бладерен, ПЈ Коњугација глутатиона цитостатског лека ифосфамида и улога људских глутатион С-трансфераза. Цхем. Рес. Токицол. 1995, 8, 979–986. [ЦроссРеф]
23. Јеелани, Р.; Јаханбакхсх, С.; Кохан-Гхадр, ХР; Тхакур, М.; Кхан, С.; Алдхахери, СР; Ианг, З.; Андреана, П.; Моррис, Р.; Абу-Соуд, ХМ Месна (2-меркаптоетан натријум сулфонат) функционише као регулатор мијелопероксидазе. Слободни Радиц. Биол. Мед. 2017, 110, 54–62. [ЦроссРеф]

24. Алнахди, А.; Јохн, А.; Раза, Х. Н-ацетил цистеин ублажава оксидативни стрес и редокс неравнотежу зависну од глутатиона узроковану третманом са високим садржајем глукозе/палмитинске киселине у Рин-5Ф ћелијама панкреаса. ПЛоС ОНЕ 2019, 14, е0226696. [ЦроссРеф]

25. Зханг, Л.; Пагано, ЈС ИРФ-7, нови регулаторни фактор интерферона повезан са латенцијом Епстеин-Барр вируса. Мол. Целл Биол. 1997, 17, 5748–5757. [ЦроссРеф]
26. Пагано, ЈС Вируси и лимфоми. Н. Енгл. Ј. Мед. 2002, 347, 78–79. [ЦроссРеф]
27. Ромиеу-Моурез, Р.; Солис, М.; Нардин, А.; Гоубау, Д.; Барон-Бодо, В.; Лин, Р.; Массие, Б.; Салцедо, М.; Хисцотт, Ј. Различите улоге регулаторног фактора ИФН (ИРФ)-3 и ИРФ-7 у активацији антитуморских својстава хуманих макрофага. Цанцер Рес. 2006, 66, 10576–10585. [ЦроссРеф]
28. Нинг, С.; Пагано, ЈС; Барбер, ГН ИРФ7: Активација, регулација, модификација и функција. Генес Иммун. 2011, 12, 399–414. [ЦроссРеф]
29. Цхен, ПГ; Гуан, ИЈ; Зха, ГМ; Јиао, КСК; Зху, ХС; Зханг, ЦИ; Ванг, ИИ; Ли, ХП Свине ИРФ3/ИРФ7 ублажава инфламаторне одговоре преко ТЛР4 сигналног пута. Онцотаргет 2017, 8, 61958. [ЦроссРеф]
30. Стоут-Делгадо, ХВ; Ианг, Кс.; Валкер, ВЕ; Тесар, БМ; Голдстеин, ДР Старење нарушава регулацију ИФН регулаторног фактора 7 у плазмацитоидним дендритским ћелијама током активације ТЛР9. Ј. Иммунол. Рес. 2008, 181, 6747–6756. [ЦроссРеф]