ЈАК инхибитор блокира ЦОВИД-19-цитокином индуковану ЈАК-СТАТ-АПОЛ1 сигнализацију у гломеруларним ћелијама и подоцитопатију у органоидима људског бубрега Ⅱ

Наши резултати померају тренутну парадигму индукованог интерферономАПОЛ{0}}нефропатија. Неколико примера укоја су висока интерферонска стања изазвала колапсирајућу гломерулопатију код носилаца високог ризикаАПОЛ1генотипдовео је до парадигме која даје предност интерферонима као главним другим окидачима АПОЛ1-посредованоггломерулопатија (31, 36, 37). Ова парадигма је додатно ојачана чињеницом да интерферон алфа, бета,и гама индукованаАПОЛ1експресија у култивисаним линијама подоцита и ендотелних ћелија (22). Међутим,овај архетип је оспорен запажањем да интерферони нису увек повишени у серумупацијенти саЦОВИД-19 инфекцијаи ЦОВАН, док други цитокини укључујући ИЛ-6, ИЛ-1 и ИЛ-18су повећане (4, 17, 18). У тренутној студији, показали смо да чак и у одсуству интерферона,ови не-интерферонски цитокини појединачно и колективно индуковани робусниАПОЛ1израз у људскомподоцита и ГЕЦ-а, истовремено истичући раније нецењени синергизам. Демонстрацијомда је ЈАК-СТАТ сигнализација централни медијатор ових комбинованих цитокинских ефеката, дају наши резултатиуверљиво објашњење за то како покреће олуја цитокина ЦОВИД{0}}АПОЛ1израза и високогинциденца колапсирајуће гломерулопатије уочена код пацијената са варијантом ризикаАПОЛ1иЦОВИД-19инфекција. Ови налази могу имати импликације на другеАПОЛ{0}}посредоване нефропатије. 

За више информација контактирајте нас на:

Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com

Тел/Вхатсапп: +86 15292862950

Док наши резултати то показујуцитокини изазвани вирусом ЦОВИД{0}довољни су да изазовуАПОЛ1изрази изазвати губитакмикроорганоидни подоцити бубрега, не искључују могућност да САР-ЦоВ-2 такође може директно да инфицира ћелије бубрега, као што је недавно објављено (38, 39). Међутим, САРс-ЦоВ-2у људском бубрежном ткиву је доказано само у обдукцијским узорцима у којима је збуњујућедопринос аутолизе ткива није могао бити искључен (3, 4, 15, 16). Већина извештаја са биопсија бубрегапацијената са ЦОВАН-ом нису успели да открију вирус САРс-ЦоВ-2 упркос употреби осетљивих метода (3, 4),укључујући два од девет случајева у тренутној студији који су тестирани имунохистохемијом и уситу хибридизација.

Демонстрирајући подоцитопатију изазвану цитокином, наш микроорганоидни модел бубрега одступио је однедавно објављеноорганоид бубрегамодел АПОЛ{0}}посредоване болести бубрега од стране Лиуа ет алгенерисани органоиди бубрега из иПСЦ-а неафричког донатора у којима је Г0 уредио ЦРИСПРАПОЛ1алели су уређени у Г1 алеле али на Г0 генетској позадини. Док интерферон гама индукујеАПОЛ1експресија у њиховим органоидима, није изазвала цитотоксичност (40). Недостатак цитотоксичности у њиховоморганоид бубрегамодел би могао да објасни мање токсичну генетску позадину на којој Г1 мутацијебили су наложени. Познато је да је цитотоксичностАПОЛ1хаплотип је под утицајем његовог генетскогпозадина (41). Тхемикроорганоид бубрегау овој студији је генерисан из неуређених иПСЦ-аафроамеричког носиоца генотипа Г1Г2. Очување природног генетског хаплотипа можедопринели су цитотоксичности повезане са АПОЛ{0}}у уоченој у нашојмикроорганоиди бубрега. 

Штавише, за разлику од повећане експресије АПОЛ1 протеина коју овде извештавамо, недавна студијаније нашао никакву разлику уАПОЛ1ниво мРНА у биопсији бубрега једног пацијента са ЦОВАН у поређењу саздраве контроле (26). Ово неслагање у нашим резултатима може се објаснити пролазном природомАПОЛ1мРНА у односу на протеин, посебно када су биопсије добијене неколико недеља након иницијалногдијагноза ЦОВИД-19 инфекције када су акутни ефекти ЦОВИД-19-индуковане цитокинске олује иодговарајући профил експресије мРНК је можда нестао. Замисливо је да је даљиод цитокинске олује изазване ЦОВИД{0}}, слабији су реактанти акутне фазе низводно одцитокински рецептори постају, укључујући фосфорилисане СТАТ протеине иАПОЛ1мРНА. Наши резултатисугеришу да индуковани АПОЛ1 протеин опстаје и даљеАПОЛ1мРНА и фосфорилисани СТАТ.

Ова студија има три главне клиничке импликације. Прво, наглашавају потребу за генотипизацијом црног илиХиспаноамериканци за које је утврђено да имају колапсирајућу гломерулопатију у контексту активног или недавног ЦОВИД-а-19инфекција. Међутим, акобиопсија бубреганије изводљиво или могуће,АПОЛ1генотипизација Црног илиПојединци инфицирани Хиспано{0}}и са новом или погоршаном протеинуријом и АКИ такође ће вероватно битиВисок принос. Друго, зато што више цитокина индукованих ЦОВИД{0}}и сувишно активира ЈАК-СТАТпут индукцијеАПОЛ1експресија, терапијска стратегија заснована на селективном уклањању илиМало је вероватно да ће инхибиција било ког цитокина бити ефикасна у превенцији или лечењу ЦОВАН-а. Тренутно,барицитиниб је дозвољен за употребу само на основу одобрења за хитну употребу за лечење ЦОВИД-а-19који захтевају додатни кисеоник. Стога, његов потенцијал као третман за ЦОВАН захтева озбиљанразматрање, посебно за црне и латиноамеричке носиоце високог ризикаАПОЛ1генотипови који имајуЦОВИД-19 инфекција. На крају, на основу доказа да је недостатак интерферона повезан са тешкимЦОВИД-19 инфекције, предложено је да се интерферон примењује као терапија за ЦОВИД-19. Ат тхевреме писања овог текста, према ЦлиницалТриалс.гов, тридесет шест клиничких испитивања интерферона као терапије уЦОВИД-19 су у току или су завршени. За разлику од образложења ових клиничких испитивања, нашдоводи до опреза против давања интерферона као лечења ЦОВИД-19 инфекције код носилацаВисок ризикАПОЛ1генотип јер интерферони могу да појачају експресију патогенаАПОЛ1интхебубрега и преципитата ЦОВАН. 

Наша студија има нека ограничења. Наша серија ЦОВАН случајева од девет колапса доказаних биопсијомСлучајеви гломерулопатије су релативно мали узорак и можда су потценили повезаностизмеђу генотипа високог ризика и ЦОВАН-а или су били предмет пристрасности узорковања. Логистички изазов задобијање биопсије бубрега од пацијената са активном ЦОВИД{0}} инфекцијом у окружењу акутне неге ограничавафреквенција одбиопсије бубрегау овој популацији. Исти фактор је вероватно одговоран за товећина биопсија у овој студији обављена је неколико недеља до месеци након иницијалне дијагнозеЦОВИД-19 инфекција. Анализа биопсија бубрега добијених ближе инфективном покретачу може да пружидодатни увид у ране ћелијске фенотипове. Поред тога, тренутна студија не идентификује кои када ЦОВАН лечити ЈАК инхибиторима. Одговори на ова питања и опредељење заЕфикасност инхибиције ЈАК-а као третмана за ЦОВАН биће у фокусу будућих истраживања.Овај рад наглашава повезаност високог ризикаАПОЛ1генотип и улога ЈАК-СТАТ-АПОЛ1сигнализација у развоју ЦОВАН-а. Како се наше разумевање пандемије ЦОВИД{0}} развија,постоји хитна потреба да се повећа свест клиничара и јавног здравља о бубрежним компликацијамаболести ЦОВИД-19. Такође постоји хитна потреба за ЦОВАН терапијом. Наша студија нуди нове податке о ЈАК-уинхибитори као јаки терапијски кандидати за ЦОВАН повезан са АПОЛ{0}}.

Методе

Антитела и реагенси.

Коришћена су примарна антитела против следећих протеина: АПОЛ1 зецанти-хумано [Генентецх, 3.1Ц1&3.7Д6; Вестерн блот [ВБ] 1:5000 (коначна концентрација 0,05 уг/мЛ);Генентецх, 5.17Д12 [ИХЦ] 1:4000 (коначна концентрација 0,95 уг/мЛ) према недавном извештају (42)];АПОЛ1 миш анти-хуман [Генентецх, 4.17А5; Имунофлуоресценција [ИФ] 1:2000 (коначна концентрација2,13 уг/мЛ)]; ГАПДХ миш анти-хуман (Санта Цруз Биотецхнологи, сц47724; ВБ 1:200); Винцулинмиш анти-хуман (Сигма-Алдрицх, В9131; ВБ 1:200); НЕПХ1 миш против човека (Санта КрузБиотецхнологи, сц373787; ВБ 1:300); ВТ1 зец анти-хуман (Абцам, аб89901; ВБ 1:1000); СТАТ1миш против човека (Технологија ћелијске сигнализације [ЦСТ], 9176с; ВБ 1:1000); СТАТ2 зец анти-хуман(ЦСТ, 72604: ВБ 1:1000); СТАТ3 миш анти-хуман (ЦСТ, 9139; ВБ 1:1000); ПхоспхорилатедСТАТ1 (И701) зец против човека (ЦСТ, 9167; ВБ 1:1000); Пхоспхорилатед-СТАТ2 (И690) антиљудски (ЦСТ, 88410; ВБ 1:1000); Фосфориловани-СТАТ3 (И705) кунић против човека (ЦСТ, 9145; ВБ1:2000); ПОДКСЛ коза против човека (Р&Д, АФ1658; ИФ 1:500), Е-Цадхерин зец против човека (ћелијаСигнализација, 3195С; ИФ 1:200), НЕПХ1 миш анти-хуман (Санта Цруз, сц-373787; ИФ 1:100). Секундарниантитела су укључивала козји анти-зечји ИгГ, антитело везано за ХРП (ЦСТ, 7074с; ВБ 1:1000); коњ антимишји ИгГ, антитело везано за ХРП (ЦСТ, 7076с; ВБ 1:1000); Алека Флуор 488 коњуговани магарац антимиш (Јацксон ИммуноРесеарцх, 715-546-150; ИФ 1:1000), Алека Флуор 594 ​​коњуговани магарац антикоза (Јацксон ИммуноРесеарцх, 705-585-147; ИФ 1:1000) и Алека Флуор 405 коњуговани магарацпротив зечева (Тхермо Сциентифиц, А48258; 1:000). За кРТ-ПЦР, ТакМан тестове експресије генаукључује АПОЛ1 (Хс01066280_м1), ГАПДХ (Хс03929097_г1) и ПЕЦАМ-1 (Хс00169777_м1).Имунохистохемијско бојење бубрега за АПОЛ1, синаптоподин и ЦД31. Почевши од фиксираног формалинаплочица за биопсију бубрега уграђена у парафин, узимање антигена је обављено са (ЕДТА раствор на пХ 8.0)56 минута на 100 степени. Примарна антитела на АПОЛ1 (5.17Д12, Генентецх), синаптоподин (ПрогенБиотецхник, 61094) и ЦД31 (Целл Сигналинг, 3528с) примењени су на 1:4000 (коначна концентрација 0,95уг/мЛ), 1:100 и 1:1600, респективно током 60 минута на 36 степени. ХК-коњугован спреман за употребусекундарни мултимери против зечева (760-4815) су инкубирани 12 минута на 36 степени. Ово је праћенододавањем анти-ХК ХРП током 12 мин. ДАБ (760-159) је инкубиран 5 минута у просторијитемпература. Секција ткива је обојена хематоксилином (760-2021) 4 минута на собној температури.Реагенс за модрење (760-2037) је додат 4 минута на собној температури.

Третман култивисаних ћелија цитокином.

Примарне људске гломеруларне ендотелне ћелије, примарни подоцитисубкултурисани из бубрега хуманог донора, а подоцити добијени из органоида третирани су са 50 нг/мЛ,20нг/мЛ или 10нг/мЛ концентрација следећих цитокина: Рекомбинантни људски ЦКСЦЛ9(Биолегенд, 578102); Рекомбинантни људски ЦКСЦЛ10 (Биолегенд, 573502); Рекомбинантни човекЦКСЦЛ13 (Биолегенд, 573502); ИЛ-1 (ПепроТецх, 200-01Б); ИЛ-15 (ПепроТецх, 200-15); ИЛ-18(Биолегенд, 592102); ИЛ-8 (Биолегенд, 574202); Интерферон (ИФН) алфа 1 (Сигма-Алдрицх, СРП4596); ИФНбета (Пепротецх, 300-02БЦ); ИФН гама (Сигма-Алдрицх, И17001); ИЛ-6 (Пепротецх, 200-06); ТНФ-алфа(Пепротецх, 300-01А); МЦП-1 (ЦЦЛ2) (Пепротецх, 300-04); МИП-1алфа (ЦЦЛ3) (Пепротецх, 300-08);ИЛ-10 (Пепротецх, 200-10); ИЛ-7 (Пепротецх, 200-07); ИЛ-2 (Пепротецх, 200-02); Г-ЦСФ (Пепротецх, 300-23). Стандардизована концентрација цитокина од 50 нг/мЛ је унапред одређена на основу преседана изтретмани људским ћелијама који процењују синдроме цитокинског шока код ЦОВИД-19 инфекције (17). Пратитиексперименти су користили концентрације од 20нг/мЛ и 10нг/мЛ. Накнадни третмани, укључујући органоиди експерименти са подоцитима добијеним из органоида, изведени су коришћењем 10 нг/мЛ. ЈАК 1/2 инхибитор,барицитиниб (ИНЦБ028050) (Селлецкцхем, С2851), коришћен је у коначној концентрацији од 10 уМ у свимексперименти.

Култура примарних људских гломеруларних ендотелних ћелија. Замрзнутозалиха нискоризичних (Г0Г0) примарних људигломеруларне ендотелне ћелије су купљене од Целпрогена (36066-05), одмрзнуте и култивисане на људимаПримарна ћелијска култура гломеруларног ендотела комплетан медиј са серумом, без антибиотика (Целпроген,М36066-05СА) на плочама обложеним заштићеним екстрацелуларним матриксом (Целпроген, Е36066-05-ПД10 иЕ36066-05-12Па) у влажном окружењу на 37 степени и 5% ЦО2. Ћелије су пасиране коришћењем 1КсТрипсин ЕДТА (Целпроген, Т1509-014). Ћелије су коришћене за експерименте између пасуса 2 до 4.Ћелије су потврђене кРТ-ПЦР-ом који показује обогаћивање експресије гена ПЕЦАМ1 (ендотелна ћелијамаркер, такође познат као ЦД31).

Гломеруларна изолација из хуманог бубрега донора и субкултуре подоцита.Људски донор бубрег је бионабављено преко Националне размене за истраживање болести (НДРИ). Генотип донора АПОЛ1 је биоГ0Г1. Изолација гломерула је изведена коришћењем методе сита прилагођене претходној публикацији (43,44). Укратко, радећи на леду у стерилној хауби, бубрег је прво декапсулиран и преполовљен средином сагиталног. Медула је одсечена, а кортекс је остао. Кортекс је затим млевени пропуштена узастопно кроз мрежаста сита од нерђајућег челика (величине 425µм, 250µм) и сакупљена наврх трећег сита (150 µм) уз често прање претходно охлађеним физиолошким раствором са фосфатним пуфером (ПБС)са 1% БСА (без калцијума и магнезијума) (Ендецоттс, Сита 100СИВ.150, 100СИВ.250,100СИВ.425). Гломерули су сакупљени, центрифугирани и ресуспендовани у 5 мЛ ПБС. 10 µЛ узоркаобојени су реагенсом НуцБлуе Ливе РеадиПробес (Хоецхст 33342) (Тхермо Фисхер Сциентифиц,Р37605) и визуелизовано светлосном микроскопијом. Гломерули су затим инкубирани у пуферу за варење[ДМЕМ/Ф12, 1мг/мЛ сваки од (колагеназа И, ИВ и В), ДНКаза И (50 У/мЛ или 50 µг/мЛ)] на 37 степени за1 сат да се добије суспензија једне ћелије (Тхермо Фисхер Сциентифиц, 10565018; СтемЦелл Тецхнологиес,07415м 07426, 07430; Сигма-Алдрицх, 11284932001). ДМЕМ/Ф12 са 10% ФБС (Р&Д системи,С10350Х) је додат да се заустави варење и узорак је центрифугиран на 450 г минута на 4 степена.Изоловани подоцити су субкултурисани у Адванцед РПМИ (Фисцхер Сциентифиц, МТ10040ЦВ) са 10% ФБСи 1% пеницилин-стрептомицина (Тхермо Фисхер Сциентифиц, 15070063) на плочама обложеним витронектином(СтемЦелл Тецхнологиес, ​​07004) на 37 степени и 5% ЦО2. Субкултивисане ћелије су биле видљиве на ~ 5 дана итретирани су након 2 недеље у култури.

Екстракција протеина и Вестерн блоттинг.Све плоче за културу и узорци су одржавани на 4 степена. Једнослојћелија је лизирано и сакупљено пуфером за лизу ћелија (Целл Сигналинг, 9803) са комплетниммини инхибитор протеазе и инхибитор фосфатазе (Сигма-Алдрицх, 04693159001, 04906837001).

Узорци су ултразвучни на нивоу 4 у трајању од 10 секунди сваки, центрифугирани на 12000 о/мин к5 мин, супернатантје сакупљен у нову Епендорфову епрувету, а концентрација протеина је одређена тестом БЦА протеина(Пиерце, 23225). Протеински лизати су разблажени са 4к ЛаеммЛи пуфера за узорке 2-меркаптоетанола(БиоРад, 1610747; Тхермо Фисхер, 21985023) и загреван на 95-100 степени 5 минута. Протеински лизатису затим раздвојени коришћењем гелова без мрља Цритерион ТГКС (4-20%) и пребачени помоћу Био-Рад ТрансБлот Турбо систем преноса. Пренете мембране су блокиране 1 сат у 3% немасном млеку у Трис пуферуфизиолошки раствор и инкубиран са специфичним примарним антителима преко ноћи на 4 степена. Следећег дана послестандардним испирањем, мембране су инкубиране са секундарном коњугацијом с пероксидазом ренаантитело најмање 1 сат на собној температури пре снимања помоћу Био-Рад ЦхемиДоц МП Имагинг системапрема упутствима произвођача.

Екстракција РНК и кРТ-ПЦР.РНК је изолована из монослоја ћелије коришћењем РЛТ пуфера за лизу иКиаген РНЕаси Мини Кит (74106) према упутствима произвођача. РНК је транскрибована у цДНК коришћењемИнвитроген СуперСцрипт ИВ реагенси и протокол реверзне транскриптазе (Тхермо Фисхер, 18091050).кРТ-ПЦР реакције су изведене са Апплиед Биосистемс ТакМан Фаст Адванцед Мастер Мик-ом(Фисцхер Сциентифиц, 44-445-57) и тестови експресије гена користећи КуантСтудио 6 Флек систем(Тхермо Фисхер Сциентифиц) користећи ∆∆Цt метода са ГАПДХ као референтним геном.

Генотипизација.ДНК је екстрахована из блокова ФФПЕ ткива коришћењем КИАамп ДНА ФФПЕ Тиссуе Кит-а(Киаген, 56404) према протоколу произвођача. Генотипизација је извршена коришћењем Апплиед БиосистемсТакман алелни дискриминацијски тестови за Г1 СНП (п.Сер342Гли) и Г2 полиморфизам(п.Асн388_Тир389дел) користећи КуантСтудио 6 Флек систем. Овај тест има 100% аналитичку специфичност ианалитичка осетљивост (граница детекције) од 1.0нг ДНК за детекцијуАПОЛ1варијанте ризика у ДНКекстрахован из моноцита периферне крви. Тестови су претходно потврђени упоређивањем резултата садиректно секвенцирање (Сангер секвенцирање). Мере контроле квалитета генотипизације укључивале су употребутехничке реплике, 100% подударање позитивних контрола сваког генотипа и негативне контроле.

Деривација микроорганоида бубрега иПСЦ пацијента Г1Г2.Микроорганоиди бубрега су изведени пообјављен протокол (27), уз извесне измене. Укратко, индуковане људске плурипотентне матичне ћелије (иПСЦ)су раздвојени у појединачне ћелије користећи ТрипЛЕ Селецт и засејане на плоче обложене витронектином уСтемФлек медијум (Тхермо Фисхер Сциентифиц, А3349401) са 10уМ инхибитором Рхо киназе (ТоцрисБиосциенце, 1254) при густини од 11,000-14,000 ћелија/цм2 и култивисан у влажној средини на37 степени и 5% ЦО2. Ћелије су затим пребачене у медијум ТеСР-Е6 (Стемцелл Тецхнологиес, ​​05946) са8 µМ ЦХИР99021 (Тоцрис Биосциенце, 4423) током 4 дана. Од 5. до 7. дана, ћелије су третиране са200 нг/мЛ ФГФ9, 1 µг/мЛ хепарина и 1 µМ ЦХИР99021. Дана 7, ћелије су испране са ПБС ираздвојен са ТрипЛЕ. Дисоциране ћелије су затим испране обичним ДМЕМ и центрифугиране на300кг 5 минута. Ћелијска пелета је ресуспендована у медијуму Стаге1 [ТеСР-Е6 који садржи 200 нг/мЛФГФ9, 1 µг/мЛ хепарин, 1 µМ ЦХИР990 21, 0,1% ПВА, 10 µМ инхибитор Рхо киназе (Тоцрис Биосциенце)]и пребачен у 24-бунар АггреВелл 400 плочу (Стемцелл, 34411) на приближно 1,2 милионаћелије / бунар. Плоча је затим центрифугирана на 100кг 3 минута и инкубирана 48 сати на 37 степени и5% ЦО2 у стандардном инкубатору ћелијске културе. Након 48 сати (дан7+2), органоиди из АггреВелл-а су билипребачен на 6-бунасту ниску причврсну плочу са Стаге2 медијумом [ТеСР-Е6 који садржи 200 нг/мЛ ФГФ9, 1µг/мЛ хепарина, 1 µМ ЦХИР99021, 0,1% ПВА] на орбиталном шејкеру унутар ћелијског инкубатора за још 72сати. Од дана 7+5 па надаље, сви органоиди су освежени медијумом 3. фазе [ТеСР-Е6 који садржи0.1% ПВА] у алтернативним данима док се не користе за експерименте.

Изолација подоцита из микроорганизама.Изолација гломерула из органоида бубрега прилагођена је из апретходно описани протокол (45). Укратко, групе бубрежних органоида добијених из иПСЦ-а са иницијаломпочетни број ћелије 1,2к106 иПСЦ-ови су раздвојени инкубацијом са ТрипЛЕ селецт (ТхермоФисхер) 5 минута на 37 степени. Нежно мешање помоћу пипете од 1 мЛ примењивано је сваких 2-3 мин да би се помоглодисоцијација. По групи, једно цедило за ћелије од 70 µм (ПлуриСелецт) стављено је на епрувету од 50 мЛ (Фалцон)а мрежа је хидратизована са ПБС. Раствор ћелија је додат у пипету од 1 мЛ, омогућавајући протокраствора гравитацијом. Користећи клип из стерилног шприца од 1 мЛ, преостала ћелијараствор заробљен на цедиљци је нежно гурнут кроз мрежицу. Цедиљка је опрана саПБС и одбачен, задржавајући проток ћелије. Проток ћелије је затим пипетиран на претходно хидратисаниЦедило за ћелије од 40 µм (Плуриселецт) и стављено на свежу епрувету од 50 мЛ (Фалцон) омогућавајући појединачне ћелиједа протиче кроз гравитацију и опсежно испира сито са ПБС-ом да би се уклонио било који преостали појединачнићелије. Највећи гломерули су затим сакупљени из сита од 40 µм окретањем сита насвежу епрувету од 50 мЛ и испрати ПБС-ом да би се испрали ухваћени гломерули. Овај процес је биопоновљено коришћењем проточног процеса од 40 µм користећи завршну ћелијску цедиљку од 30 µм (ПлуриСелецт) доприкупити мање гломеруле. Изоловани гломерули из органоида бубрега добијених из ИПСЦ-а су култивисаниплоче обложене витронектином са напредним РПМИ 1640 које садрже 10% ФБС у стандардној ћелијској културиинкубатор на 37 степени плус 5% ЦО2. Медији су се освежавали сваки други дан док се ћелије нису користилеексперименти.

Имунофлуоресцентно бојење, микроорганоид.Микроорганоиди бубрега су испрани са ПБС ификсиран у 4% ПФА у ПБС током 30-45 мин на леду. Фиксирани органоиди су затим испрани три пута са ПБС,и инкубирано у 30% сахарозе у ПБС преко ноћи на 4 степена. Органоиди су уграђени у ОЦТ иподвргнути криосекцији од 10 µм са Лаица криостатом. Органоидни криорезци су опрани три путапута са ПБС, а затим блокиран пуфером за блокирање 1 (1% рибљи желатин, 2% магарећи серум, 0.3% ТритонКс-100 у ПБС) један сат на собној температури. Затим су криосекције инкубиране са примарнимантитела у пуферу за блокирање 1 преко ноћи на 4 степена. Криосекције су испране три пута са ПБС. Послепрањем, криосекције су инкубиране са секундарним антителима у пуферу за блокирање 1 током 2 сата у просторијитемпература. После пет прања са ПБС-ом, криосекције су монтиране са Пролонг Гласс антифадерешење за монтажу (Тхермо Сциентифиц, П36980). Флуоресцентне слике су генерисане коришћењем ЕЦХОмикроскоп.

Имунофлуоресцентно бојење, подоцит.Културе подоцита су испране са ПБС и фиксиране у 4%ПФА у ПБС током 10-15 мин на собној температури. После фиксације, ћелије су испране три пута са ПБСи блокиран у пуферу за блокирање 2 (1% фишер желатин, 2% магарећи серум, 0.1% сапонин у ПБС) за 30-60мин. Ћелије су инкубиране са примарним антителима у пуферу за блокирање 2 током 2 сата на собној температури(или преко ноћи на 4 степена). Ћелије су испране три пута са пуфером за блокирање 2 и инкубиране сасекундарна антитела у пуферу за блокирање 2 током 1 сата на собној температури. После три прања сапуфер за блокирање 2 и једно последње прање са ПБС-ом, ћелије су монтиране са Дроп-н-Стаин ЕверБритемедијум за монтажу (Биотиум, 23008). Флуоресцентне слике су снимљене помоћу ЕЦХО микроскопа.

Тестирање одрживости. За мерење виталности ћелија и АТП-а, подоцити изведени из органоида су постављени на плочицена витронектином обложену 96-плочу у медијуму од 100 уЛ (СтемЦелл Тецхнологиес, ​​07004; Цорнинг,ЦЛС3603) и култивисан у напредном РПМИ+10%ФБС+1%ПС (Фисцхер Сциентифиц, МТ10040ЦВ; ТхермоФисхер Сциентифиц, 15070063) у влажном окружењу на 37 степени и 5% ЦО2. Органоид-изведенподоцити су истовремено постављени на плочу са 6-бунарићима да би се користили за екстракцију РНК за кПЦР ина плочу 24-бунарића која ће се користити за имунохистохемију (ИХЦ). Ћелије су третиране на ~80% конфлуентностиса шест услова [контрола, ИФНГ (10нг/мЛ), ИФНГ (10нг/мЛ) + барицитиниб (коначна концентрација 10уМ),Сви цитокини (10 нг/мЛ) и сви цитокини (10 нг/мЛ) + барицитиниб (коначна концентрација 10 уМ)]. Медијије промењен у К48 сати, а ћелије су процењене на 96 сати. 96-плоча са бунарима је обрађена помоћу Промегатестови виталности ћелија и АТП као што је даље наведено у наставку; 6-плоча бунара је обрађена за РНКекстракција, синтеза цДНК и кРТ-ПЦР; а 24-плоча са бунарима је фиксирана у 4% ПФА за ИХЦ. ЦеллТитерФлуорТМТест виталности ћелија (Промега, Г6080) и ЦеллТитер-Гло® 2.0 Тест (Промега, Г9241) су билиизвршено коришћењем стандардних протоколарних упутстава које је обезбедио произвођач. Тестови су мултиплексиранипо протоколу. Флуоресценција (тест нелитичке протеазе) и луминисценција (литички АТП тест) сумерено коришћењем СпецтрамакМ3 флуорометра. Разлику у мерама утврдио је Студентнеупарени т-тест.

Статистика.Сви подаци су представљени као средња вредност ± СД. За податке је коришћен софтвер ГрапхПад Присм 8.3.1analysis. Cytokine conditions inducing >1,5 путаАПОЛ1транскрипт у поређењу са контролом третираном медијимасу анализирани на значај коришћењем неупареног т-теста са Холм-Сидаковом корекцијом за вишепоређења. Пријављене П-вредности су прилагођене п-вредности. Значај је постављен на стр<0.05.

Одобрење студије. Ову студију је одобрио Одбор за институционални преглед (ИРБ) Универзитета Дуке,Северна Каролина. ИРБ није захтевао информисани пристанак пацијената јер је део овог случајастудија је била само ретроспективни преглед клиничког и архивираног патолошког материјала. Људски бубрег загломеруларна изолација и субкултура подоцита је набављена кроз Национално истраживање болестиИнтерцханге (НДРИ); ово истраживање људског ткива је такође претходно одобрено од стране Дукеовог ИРБ-а. НДРИзахтева да сва места извора ткива добију информисани пристанак од донатора ткива или сурогата.

Прилози аутораСЕН, ГЛ, СД, КС и ДС су извели експерименте и уређивали рукописе. АВ и ДТ су извели иинтерпретирао хистопатологију и ИХЦ и уредио рукопис. ГХ је допринео есенцијалним реагенсима и уредиорукопис. СЕН и ОАО су дизајнирали студију, анализирали и интерпретирали податке, дизајнирали бројке инаписао и уредио рукопис.

ПризнањаОвај рад су подржали 1ДП2ДК124891-01, 1Р01МД016401-01 и Вхитехеад Сцхолар Авард(ОАО); СЕН је подржао Дуке Непхрологи Т32 Грант за обуку (5Т32ДК007731-24). Захваљујемо сеСузие Сцалес (Генентецх) за великодушан поклон АПОЛ{0}}специфичних антитела. Захваљујемо се истраживањуХистолошка лабораторија у Дуке БРПЦ и Стевен Р. Цолон у ПхотоПатх, Дуке Департмент оф Патхологи.

Референце

1. Цхан Л, Цхаудхари К, Саха А, Цхаухан К, Ваид А, Зхао С, ет ал. АКИ код хоспитализованих пацијената са ЦОВИД-19. Ј Ам Соц Непхрол.2021;32(1):151-60.

2. Хирсцх ЈС, Нг ЈХ, Росс ДВ, Схарма П, Схах ХХ, Барнетт РЛ, ет ал. Акутна повреда бубрега код пацијенатахоспитализован са ЦОВИД-19.Киднеи Инт.2020;98(1):209-18. 

3. Маи РМ, Цассол Ц, Ханноуди А, Ларсен ЦП, Лерма ЕВ, Хаун РС, ет ал. Ретроспективна кохорта са више центарастудија дефинише спектар патологије бубрега у болести Цоронавирус 2019 (ЦОВИД-19).Киднеи Инт.2021.

4. Ву Х, Ларсен ЦП, Хернандез-Арроио ЦФ, Мохамед ММБ, Цаза Т, Схарсхир М, ет ал. АКИ и колапсГломерулопатија повезана са ЦОВИД-19 и високоризичним генотипом АПОЛ 1.Ј Ам Соц Непхрол.2020;31(8):1688-95. 

5. Геновесе Г, Фриедман ДЈ, Росс МД, Лецордиер Л, Узуреау П, Фреедман БИ, ет ал. Удружење затрипанолитичке варијанте АпоЛ1 са болешћу бубрега код Афроамериканаца.Наука.2010;329(5993):841-5.

6. Фридман ДЈ и Поллак МР. АПОЛ1 нефропатија: од генетике до клиничке примене.Цлин Ј Ам СоцНепхрол.2020. 

7. Фридман ДЈ и Поллак МР. АПОЛ1 и болест бубрега: од генетике до биологије.Анну Рев Пхисиол.2020;82:323-42. 8. Тзур С, Россет С, Схемер Р, Јудковски Г, Селиг С, Тарекегн А, ет ал. Миссенсе мутације у АПОЛ1ген су високо повезани са ризиком од болести бубрега у завршној фази који се раније приписивао гену МИХ9.Хум Генет.2010;128(3):345-50. 

Услуга подршке Вецистанцхе-а - највећи извозник цистанцхеа у Кини:

Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com

Вхатсапп/тел:+86 15292862950

Купите за више детаља о спецификацијама:

хттпс://ввв.кјцистанцхе.цом/цистанцхе-схоп

НАБАВИТЕ ПРИРОДНИ ОРГАНСКИ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНЦХЕ СА 25% ЕХИНАКОЗИДА И 9% АКТЕОЗИДА ЗА ИНФЕКЦИЈУ БУБРЕГА