Губитак БЦАА катаболизма посредован фактором 6 налик Крупелу, доприноси повреди бубрега код мишева и људи
Feb 25, 2022
Промењен ћелијски метаболизам убубрегаћелије проксималних тубула (ПТ) играју кључну улогу у акутнимповреда бубрега (АКИ). Фактор транскрипције Крупел сличан фактор 6 (КЛФ6) се брзо и снажно индукује рано у ПТ после АКИ. Открили смо да ПТ-специфичан Клф6 кноцкдовн (Клф6ПТКД) штити од АКИ ибубрегафиброза код мишева. Комбинована анализа секвенцирања имунопреципитације РНК и хроматина показала је да је експресија гена који кодирају катаболичке ензиме разгранатог ланца амино киселина (БЦАА) очувана код Клф6ПТКД мишева, при чему КЛФ6 заузима промоторски регион ових гена. Супротно томе, индуцибилна прекомерна експресија КЛФ6 потиснула је експресију БЦАА гена и погоршалаповреда бубрегаи фиброза код мишева. Ин витро, повређене ћелије које прекомерно експримирају КЛФ6 имале су слична смањења експресије БЦАА катаболичког гена и биле су мање способне да искористе БЦАА. Штавише, нокдаун БЦКДХБ, који кодира једну подјединицу ензима који ограничава брзину у катаболизму БЦАА, резултирао је смањеном производњом АТП-а, док је третман са појачивачем БЦАА катаболизма БТ2 повећао метаболизам. Анализафункцију бубрега, КЛФ6 и експресија гена БЦАА код хроничних људиобољење бубрегапацијенти су показали значајну инверзну корелацију између КЛФ6 и обафункцију бубрега и БЦАА експресија. Стога, сузбијање БЦАА катаболизма посредовано КЛФ6- може послужити као кључни терапеутски циљ код АКИ ибубрегафиброза.
ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ БУБРЕЗУ/БУБРЕЗУ
Хроничниобољење бубрега(ЦКД) узрокује значајан морбидитет и морталитет и има преваленцију у одраслој популацији САД од ~15 процената. ЦКД може бити резултат поновљених акутних нападаповреда бубрега(АКИ) који се могу приписати еколошким или токсичним увредама или су секундарни у односу на друге болести или њихове третмане. У већини случајева, проксимални тубул (ПТ) је примарно место оштећења код АКИ, пошто их висока метаболичка активност ПТ ћелија чини подложним исхемијским повредама, а њихова улога у излучивању лекова и токсина захтева проток потенцијално штетних агенси преко ПТ ћелија (1). Једна таква класа агенаса су хемотерапеутици који оштећују ДНК, који се акумулирају у ПТ ћелијама, изазивајући АКИ и губитак нефрона. Након повреде, ПТ ћелије дедиференцирају и луче растворљиве факторе као што су чланови породице Внт и Хедгехог и цитокини (1–4). Преживеле дедиференциране ПТ ћелије могу поново да уђу у ћелијски циклус и пролиферирају да би поправиле повређени ПТ, након чега следи редиференцијација до потпуно функционалних ПТ ћелија (2). Међутим, ћелије које се уместо тога подвргавају заустављању ћелијског циклуса на Г2/М контролној тачки можда се неће опоравити, што доводи до атрофије и регулације профибротске сигнализације (5), покрећући фиброзу стимулисањем диференцијације резидентних фибробласта до миофибробласта који луче протеине екстрацелуларног матрикса, и регрутовање имуних ћелија као што су макрофаги и Т ћелије (1).
Кључне речи:бубрег; акутна повреда бубрега; проксимални тубул; фактор транскрипције; аминокиселине разгранатог ланца
Поред индуковања патогених сигналних путева, повређене ПТ ћелије такође показују драстично измењен ћелијски метаболизам. Неповређене ПТ ћелије се у великој мери ослањају на оксидацију митохондријалних масних киселина, циклус трикарбоксилне киселине (ТЦА) и оксидативну фосфорилацију за производњу АТП-а. Међутим, у окружењу повреде, оксидација масних киселина је потиснута, уз само умерену компензаторну регулацију гликолизе, тако да се укупни нивои АТП-а смањују код повређеног ПТ (6). Штавише, инхибиција оксидације масних киселина ин витро изазвала је дедиференцијацију и апоптозу тубуларних епителних ћелија и ин виво погоршалаповреда бубреганакон третмана фолном киселином (6). Занимљиво је да појачана регулација или оксидације митохондријалних масних киселина или оксидације пероксизомалних масних киселина (ФАО) може заштитити одповреда бубрега(6, 7), што сугерише да очување ћелијског метаболизма може бити терапеутска мета у АКИ. Транскриптомске студије у биопсијама бубрега са хуманом ЦКД, као и након исхемијске реперфузијске повреде (ИРИ) код мишева, показују нерегулисан метаболизам масних киселина као и метаболизам амино киселина (6, 8). Иако је улога ПТ оксидације масних киселина претходно описана у АКИ, улога метаболизма ПТ аминокиселина у АКИ остаје да се истражи. Штавише, механизми повреде ПТ који су до сада описани у великој мери су истражени коришћењем мишјих модела са нокаутом и прекомерном експресијом појединачних сигналних молекула, али механизама помоћу којих глобални путеви, како фибротични/инфламаторни и метаболички, прелазе између нормалног опоравка и атрофије. су регулисани у АКИ нису добро окарактерисани.
Фактори транскрипције делују као главни регулатори фундаменталних биолошких процеса, због своје способности да регулишу експресију вишеструких циљева низводно и формирају повратне петље. У АКИ, добро проучени фактори транскрипције као што су чланови породице ФОС и ЈУН су високо регулисани. Недавне студије молекуларних одговора на ИРИ у људским узорцима и ПТ транслационог профилисања након једностране опструкције уретера (УУО) код мишева такође су идентификовале фактор 6 транскрипције цинковог прста Крупелов фактор 6 (КЛФ6) као сличан ген за рани одговор на повреду (9, 10). ). КЛФ-ови обухватају фамилију фактора транскрипције цинк-прста са високо конзервираним доменима за везивање ДНК Ц-терминала и варијабилним Н терминусима који су широко експримирани, укључујући убубрега(11). КЛФ6 има улогу у вишеструким процесима као што су пролиферација и диференцијација ћелија, апоптоза, одговори на оштећење ДНК и митохондријална функција (12) и идентификовано је да игра улогу у јетри, срцу ибубрегафиброза, са ефектима зависним од контекста (13, 14). УнутарбубрегаКЛФ6 је експримиран у гломеруларним подоцитима и суштински је регулатор митохондријалне функције у окружењу фокалне сегментне гломерулосклерозе (ФСГС) (15). Поред експресије у гломеруларним подоцитима, КЛФ6 је такође променљиво експримиран у ПТ, али његова улога у ПТ ћелијама, било у нормалној функцији или након повреде, није схваћена. Прекомерна експресија КЛФ6 у ћелијама ХК-2 резултирала је дедиференцираним фенотипом са смањеним Е-кадхерином и повећаном експресијом виментина, а такође је довела до повећане експресије инфламаторног протеина макрофага-3 (16). Поред тога, експресија КЛФ6 се повећала као одговор на високу глукозу, а овај ефекат је блокиран обарањем ТГФБ1 или третманом са ТГФ- 1 неутрализирајућим антителом. Директан третман са ТГФ- 1 је такође индуковао експресију КЛФ6, што указује на могућу позитивну повратну петљу у ХК-2 ћелијама (16). Такође се показало да се КЛФ6 ин витро индукује у ћелијама рака субапоптотским дозама хемотерапеутског лека цисплатина који оштећује ДНК (17). Да бисмо одредили улогу ПТ КЛФ6 у одговору на оштећење ДНК, користили смо природни токсин аристолохичне киселине И (ААИ). Нефропатија повезана са ААИ је клинички релевантна (18), а токсичност ААИ је високо специфична за ПТ, што омогућава проучавање улоге ПТ КЛФ6 специфично као одговор на повреду ПТ. Штавише, ААИ поуздано изазива и АКИ и прелазак на фиброзу код мишева, за разлику од већине режима цисплатина (19). ААИ улази у ПТ ћелије преко базолатералних органских анионских транспортера (ОАТ) 1 до 3 и има и генотоксичне ефекте, преко формирања адукта аристолактам (АЛ)-ДНК, и цитотоксичне ефекте, изазивајући оштећење митохондрија, које генерише реактивне врсте кисеоника, и специфично инхибирајући нормалне ПТ функције као што је ендоцитоза посредована рецепторима (18–20). Овде смо демонстрирали кроз модулацију експресије КЛФ6 посебно у ПТ кроз студије повећања функције и губитка функције код мишева да КЛФ6-посредована супресија катаболизма разгранатог ланца амино киселина (БЦАА) доприноси АКИ и уследилабубрегафиброза.
Резултати
Третман ААИ повећава експресију бубрежног ПТ Клф6. Пошто је неколико чланова породице КЛФ експримирано у епителним ћелијама убубрега(21), првобитно смо предузели кРТ-ПЦР за ове епителне Клфс инбубрегакортекс је сакупљен 24 х након једне дозе ПТ-специфичног токсина, ААИ, у односу на вехикулум (диметил сулфоксид [ДМСО]) код Ц57БЛ/6 мишева. Клф4, Клф5 и Клф6 су били значајно повећани, док је Клф15 био значајно ниже регулисан (слика 1А), а ове промене у експресији гена су се десиле пре значајног пораста серумског креатинина (слика 1Б). Да бисмо утврдили да ли је регулација нагоре Клф6 пролазна или продужена, дали смо ААИ у више ињекција 3 дапарт за две ињекције или 3 недеље (активна фаза) или за 3 недеље након чега следе 3 недеље без ААИ (фаза ремоделирања) (слика 1Ц) . ПТ је остао нетакнут 24 х након једне ињекције, али након две ињекције, ПТ ћелије су биле подвргнуте ћелијској смрти, а мишеви третирани вишеструким дозама ААИ показали су губитак ПТ, инфламаторне инфилтрате, протеине
гипси, и фиброза на крају фазе ремоделирања (слика 1Д). Експресија Клф6 је остала значајно повишена у активним фазама повреде и фазама ремоделирања (Слика 1Е), што указује на улогу КЛФ6 током акутне и фиброзне фазе повреде. КЛФ6 се експримира у гломеруларним, тубуларним и инфламаторним ћелијама, а да бисмо одредили допринос ПТ-специфичне Клф6 експресије уоченом повећању експресије Клф6 бубрежног кортикса, предузели смо секвенцирање РНК (РНА-сек) у микродисекованим С2/С3 ПТ сегментима 24 х након једне ињекције ААИ, пре губитка ПТ ћелија. Клф6 је био високо регулисан на нивоу који је упоредив са добро познатим факторима транскрипције раног одговора Фос и Јун, што указује да је рана индукција експресије Клф6 гласничке РНК (мРНА) убубрегаје вођен његовом експресијом у ПТ ћелијама (слика 1Ф). Ови налази су у складу са недавно објављеним једноћелијским/нуклеарним РНА-сек подацима који показују повећану регулацију Клф6 у ПТ ћелијама код повређених мишева и људибубрези(22, 23). Коначно, прикупљање података експресионих низова из претходно пријављених ИРИ временских студија (8) потврдило је рану индукцију експресије КЛФ6, у року од 2 х од АКИ, слично као код Фоса и Јуна (слика 1Г). Ови подаци сугеришу да је Клф6 рани индуцибилни ген одговора на повреду након третмана са ПТ-специфичним токсином ААИ и након ИРИ и остаје повишен упркос престанку ААИ.
ПТ-специфичан губитак КЛФ6 ублажава повреду бубрега у активним фазама и фазама ремоделирања након третмана ААИ.Да бисмо одредили допринос ПТ-специфичног КЛФ6 повреди изазваној ААИ, генерисали смо мишеве са ПТ-специфичним оборењем Клф6 (Клф6ПТКД) укрштањем Клф6фл/фл мишева (24) са Пепцк-Цре мишевима (25). Клф6ПТКД мишеви су били одрживи и плодни, са значајним срушењем експресије КЛФ6 протеина специфичне за ПТ, али без промене у експресији Клф6 мРНА у јетри, у поређењу са Клф6фл/фл мишевима (СИ додатак, слика С1 А-Ц). Није било отворених разлика убубрегахистологија или функција између Клф6фл/фл и Клф6ПТКД мишева у доби од 24 недеље (СИ додатак, сл. С1 Д и Е), и нивои експресије ОАТс 1 до 3 (Слц22а6, Слц22а7 и Слц22а8), пут уласка у ААИ ПТ, нису се значајно разликовале (СИ Додатак, сл. С1Ф).
Контролни (Клф6фл/фл) и Клф6ПТКД мишеви су третирани носачем (ДМСО) или 3 мг/кг ААИ интраперитонеално свака 3 дана током 3 недеље и еутаназирани 3 дана након последње ињекције ААИ да би се проценила активна фаза повреде или 3 недеље након последња ААИ ињекција за процену фазе ремоделирања повреде (слика 1Ц). Клф6фл/фл и Клф6ПТКД мишеви су имали сличне количине АЛ-ДНК адуката и након једне ињекције и на крају активне фазе и фазе ремоделирања (СИ додатак, сл. С1 Г и Х), што сугерише слично ПТ усвајање ААИ и поправку АЛ -ДНК адукти код Клф6фл/фл и Клф6ПТКД мишева. Док су били подвргнути ињекцијама, мишеви који су примали ААИ изгубили су на тежини у односу на оне који су примали ДМСО, са сличним смањењем од ~18 процената у односу на почетну вредност и код Клф6фл/фл и Клф6ПТКД мишева на последњој ињекцији ААИ, након чега је уследило враћање сличних количина телесне тежине ( Додатак СИ, слика С2А).Бубрегтежине у односу на почетну (дан 0) телесну тежину биле су сличне између Клф6фл/фл и Клф6ПТКД мишева третираних ДМСО и ААИ на крају активне фазе (СИ додатак, слика С2Б). У фази преуређења,бубрезиод мишева Клф6фл/фл третираних ААИ је тежио знатно мање од оних од мишева третираних ДМСО, али код мишева Клф6ПТКД третираних ААИ,бубрегатежине су сачуване (СИ додатак, сл. С2Б).Функција бубрегаје процењена мерењем серумског креатинина (слика 2А) и азота урее (слика 2Б). Концентрације серумског креатинина и азота уреје биле су значајно повишене код мишева који су примали ААИ у односу на ДМСО; међутим, повишења су била значајно мања код Клф6ПТКД мишева у поређењу са Клф6фл/фл мишевима (сл. 2 А и Б). Хистолошка анализа коришћењем хематоксилина и еозина и бојења периодичном киселином по Шифу је показала да су и мишеви Клф6фл/фл и Клф6ПТКД третирани ААИ имали тубуле са остатком базалних мембрана, инфламаторне инфилтрате који су били претежно локализовани у
спољашњи кортекс, и вишеструки протеински слојеви у кортексу и медули (сл. 2 Ц и Д). Међутим, ове карактеристике су биле мање озбиљне код Клф6ПТКД мишева у поређењу са Клф6фл/фл мишевима, са очувањем тубула и мањим инфламаторним инфилтратима. Анализа ПТ области је урађена коришћењем флуоресцентног бојења Лотус лектином да би се идентификовале нетакнуте границе ПТ четкице у потпуно диференцираним ПТ ћелијама и имунофлуоресценцијом за цитокератин-20 (КРТ-20) да би се идентификовали повређени ПТ (8). У поређењу са мишевима третираним ДМСО, и Клф6фл/фл и Клф6ПТКД мишеви третирани ААИ су имали значајан губитак зрелог ПТ, што је показано губитком бојења Лотус лектина и индукцијом КРТ-20 експресије, што указује на оштећење ПТ у оба активне фазе и фазе ремоделирања (слика 2Е и СИ додатак, слика С2Ц). Клф6ПТКД мишеви третирани ААИ имали су значајно очување зрелог ПТ у поређењу са Клф6фл/фл мишевима, праћено сличним нивоима индукције КРТ- 20 у активној и фази ремоделирања. Трихромско бојење фазе ремоделирањабубрезипоказало је екстензивно таложење фиброзног материјала код Клф6фл/фл мишева, са значајно мање фиброзе код Клф6ПТКД мишева (слика 2Ф, плаво бојење; СИ додатак, табела С1). Депозиција компоненте фибротичног матрикса колагена И, откривена коришћењем имунофлуоресценције (слика 2Г и СИ додатак, слика С2Д), показала је да је колаген И значајно повећан код Клф6фл/фл мишева са ААИ, али не и код Клф6ПТКД мишева са ААИ у поређењу са ДМСО у активна фаза. У фази ремоделирања, колаген И је значајно повећан код Клф6фл/фл и Клф6ПТКД мишева са ААИ, са значајно нижим процентом површине код Клф6ПТКД мишева са ААИ у поређењу са Клф6фл/фл мишевима са ААИ. Интерстицијалне инфламаторне ћелије које се састоје од ЦД68 плус макрофага и ГР-1 плус мијелоидних моноцита биле су присутне у Клф6фл/фл
и Клф6ПТКД мишеви третирани са ААИ, али су били значајно мање заступљени код Клф6ПТКД мишева иу активној иу фази ремоделирања (слика 2Х). Дакле, губитак ПТ-специфичног КЛФ6 штити од ААИ-индуковане ПТ повреде, фиброзе и упале, упркос присуству сличних количина АЛ-ДНК адуката у поређењу са контролним мишевима третираним ААИ. ПТ-специфичан губитак КЛФ6 смањује инфламаторну сигнализацију и чува ћелијски метаболизам након третмана ААИ. Покушали смо да разумемо механизме помоћу којих губитак ПТ КЛФ6 штити од повреда, и стога смо предузели РНА-секвенцијубубрегаcortex in Klf6fl/fl and Klf6PTKD mice treated with DMSO or AAI in the active phase or remodeling phase. Significantly differentially expressed genes were defined as having a >1.5- или<0.67-fold change="" and="" false="" discovery="" rate="" of=""><0.05 in="" any="" given="" pairwise="" genotype="" or="" treatment="" comparison.="" a="" combined="" total="" of="" 7,673="" genes="" were="" found="" to="" be="" differentially="" expressed="" as="" a="" result="" of="" all="" the="" pairwise="" comparisons,="" and="" hierarchical="" clustering="" showed="" these="" to="" group="" into="" two="" main="" clusters:="" genes="" that="" were="" induced="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" and="" genes="" that="" were="" suppressed="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3a="" and="" dataset="" s1).="" unbiased="" analysis="" of="" transcriptional="" effects="" of="" aai="" treatment="" in="" klf6fl/fl="" mice="" by="" undertaking="" pathway="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" the="" most="" significantly="" upregulated="" pathways="" were="" predominantly="" inflammatory="" and="" ecm/="" cell="" adhesion="" pathways="" (e.g.,="" cytokine/chemokine="" signaling)="" and="" integrin/focal="" adhesion="" pathways,="" respectively="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b="" and="" c).="" markers="" of="" cellular="" senescence,="" including="" components="" of="" the="" senescence-associated="" secretory="" phenotype,="" were="" also="" upregulated="" after="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3d),="" but="" the="" overall="" pathway="" was="" not="" differentially="" expressed="" between="" klf6fl/fl="" and="" klf6ptkd="" mice.="" in="" general,="" these="" pathways="" were="" less="" significantly="" up-regulated="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase.="" the="" most="" significantly="" down-regulated="" pathways="" after="" aai="" were="" metabolic="" pathways,="" including="" fatty="" acid–="" and="" amino="" acid–related="" pathways;="" these="" pathways="" were="" similarly="" or="" slightly="" less="" significantly="" decreased="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b,="" e,="" and="" f).="" similar="" to="" other="" studies,="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" anerobic="" glycolysis="" were="" up-regulated="" after="" aai="" (26,="" 27)="" (si="" appendix,="" fig.="">
Да бисмо одредили путеве потенцијално директно и индиректно регулисане КЛФ6, даље смо анализирали различито експримиране гене тако што смо их класификовали на основу присуства и локације КЛФ6 везивних места, користећи податке секвенцирања имунопреципитације хроматина КЛФ6 (ЦхИП-Сек) из пројекта Енциклопедије ДНК елемената. . Гени класе 2 су дефинисани тако да имају најмање 1 место везивања КЛФ6 унутар ±1 кб од места почетка транскрипције (ТСС), а гени класе 1 имају најмање 1 место везивања КЛФ6 између ±1 и 10 кб од ТСС и гени класе 0 као да немају место везивања за КЛФ6 унутар ±10 кб од ТСС-а. Постојало је 538 гена који су били и горе регулисани код Клф6фл/фл мишева и значајно ниже регулисани код Клф6ПТКД у односу на Клф6фл/фл мишеве у активној фази. Анализа обогаћивања путева ових 538 гена је показала да су урођени имуни (нпр. ТИРОБП, фагозом и макрофаги) и ћелијска адхезија (нпр. интегрин, фокална адхезија) значајно обогаћени (слика 3А). Класификација гена према КЛФ6 везивним местима је показала да већина ДЕГ-ова (428/538) није имала КЛФ6 везујућа места (класа 0), а анализа обогаћивања гена класе 2 (72) и гена класе 0 одвојено показала је да је значај ових путева снажно вођен генима класе 0, што указује да је нижа експресија ових гена код Клф6ПТКД мишева вероватно индиректан ефекат мање ПТ повреде као резултат ПТ специфичног Клф6 нокауна (слика 3А).
ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ ФУНКЦИЈУ БУБРЕГА/БУБРЕГА
Било је 388 гена који су били ниже регулисани код Клф6фл/фл мишева и значајно очувани (навише регулисани) код Клф6ПТКД у односу на Клф6фл/фл мишеве. Анализа обогаћивања путева је показала да ови гени представљају метаболичке путеве, при чему су метаболизам аминокиселина и метаболизам масних киселина истакнути (слика 3Б и СИ додатак, слика С4). Анализа обогаћивања гена класе 2 (1{{10}}3) и гена класе 0 (246) је показала да упркос томе што само ∼25 процената гена имају места везивања КЛФ6 унутар ±1 кб од ТСС ( класа 2), овај подскуп гена је био покретач за високо значајне П вредности ових путева. Запањујуће, метаболички путеви специфичних амино киселина (Вал, Леу и Иле [БЦАА] и Гли, Сер и Тхр) били су подједнако значајни када су анализирани само гени класе 2, што сугерише потенцијалну директну регулацију ових путева помоћу КЛФ6 (слика 3Б) . Насупрот томе, висок значај метаболичких путева масних киселина и ППАР сигналног пута у великој мери су вођени генима класе 0, што сугерише индиректно очување ових путева као резултат ПТ-специфичног Клф6 кноцкдовна. Анализа обогаћивања скупа гена за специфичне метаболичке путеве из Кјото енциклопедије гена и генома (КЕГГ) (деградација масних киселина, метаболизам аминокиселина, ТЦА циклус и гликолиза) коришћењем свих диференцијално регулисаних гена потврдила је да су они значајно повећани (очувани) у Клф6ПТКД наспрам Клф6фл/фл мишева (слика 3Ц).
Индукција КЛФ6 погоршаваПовреда бубрегаи потискује БЦАА катаболичке гене након третмана ААИ. Да бисмо утврдили да ли би прекомерна експресија КЛФ6 имала супротне ефекте, користили смо систем "тет-он" да генеришемо модел миша са експресијом хуманог КЛФ6 индукованог доксициклином (ДОКС) (хКЛФ6ОЕ; двоструки трансгени ЦАГ-ртТА,ТРЕ-хКЛФ6 мишеви) (СИ додатак, слика С5А). хКЛФ6ОЕ мишеви су имали снажну индукцију експресије хКЛФ6 након суплементације исхраном са ДОКС током 7 дана без значајних разлика у експресији Клф6 миша (СИ додатак, слика С5Б), ибубрезиније показао очигледну хистолошку повреду или губитакфункцију бубреганакон континуираног третмана са ДОКС током 15 недеља (СИ додатак, сл. С5 Ц и Д) у поређењу са контролним мишевима (ТРЕ-хКЛФ6 са ДОКС третманом). Међутим, да би се открило да ли је индукција хКЛФ6 у ПТ погоршала АКИ ибубрегафиброза, хКЛФ6ОЕ и контролни мишеви су третирани нижом дозом од 1 мг/кг ААИ или ДМСО свака 3 дана током 2 недеље, након чега је уследила еутаназија након 3 наредна дана (активна фаза) или још 2 недеље (фаза ремоделирања) (СИ додатак, сл. С6А). Контролни и хКЛФ6ОЕ мишеви који су примали ААИ изгубили су сличне количине телесне тежине (СИ додатак, слика С6Б) ибубрегатежине су биле сличне између свих група (СИ додатак, сл. С6Ц). хКЛФ6ОЕ мишеви су имали значајно повишен серумски креатинин и азот урее у поређењу са контролним мишевима након третмана ААИ у активној фази (Слике 4 А и Б). Ово је било праћено губитком зрелог ПТ са већим уделом КРТ-20-позитивног ПТ, који је био погоршан код хКЛФ6ОЕ мишева у обе временске тачке (Слика 4 Ц–Е и СИ Додатак, Слика С6Д) и повећан фиброза у обе фазе (слика 4Ф и СИ додатак, слика С6Е). кРТ-ПЦР анализа гена који кодирају ензиме у БЦАА метаболичком путу показала је супресију БЦАА гена након третмана ААИ код контролних и хКЛФ6ОЕ мишева, уз даљу супресију код хКЛФ6ОЕ мишева у поређењу са контролним мишевима (Слика 4Г). Штавише, експресија неколико БЦАА гена је такође или значајно смањена (Хибцх) или је показала тренд ниже експресије код хКЛФ6ОЕ у односу на контролних мишева чак и без ААИ третмана (третирани ДМСО) (слика 4Г). Ови подаци сугеришу да индукција хКЛФ6 код одраслих мишева доводи добубрегаподложнији АКИ и евентуалној фибрози са значајном дисрегулацијом гена који кодирају БЦАА катаболизам.
Индукција КЛФ6 потискује катаболизам БЦАА, који је важан супстрат за производњу АТП ин витро.Митохондријски БЦАА ца таболизам може допринети оксидативној фосфорилацији производњом ацетил-ЦоА и сукцинил-ЦоА (СИ додатак, слика С4Б). Да бисмо истражили да ли КЛФ6 регулише БЦАА и ћелијски метаболизам ин витро, прво смо проценили експресију БЦАА метаболичких гена у ХК-2 ћелијама са прекомерном експресијом КЛФ6 (КЛФ6-ОЕ), са или без ААИ третмана. Као и код хКЛФ6ОЕ мишева, само прекомерна експресија КЛФ6 у ХК-2 ћелијама довела је до тренда супресије неколико гена који кодирају БЦАА ензиме, посебно БЦКДХБ. Третман контролних КЛФ6-Цон ћелија са 25 μМ ААИ током 6 х значајно је потиснуо експресију неколико ензима, а они су даље потиснути у КЛФ6-ОЕ ћелијама третираним ААИ (слика 5А). До
Слика 3. Губитак КЛФ6 потискује профибротичке путеве и чува метаболичке путеве након третмана ААИ. (А) Класификација и анализа обогаћивања пута гена који су навише регулисани код Клф6фл/фл мишева након ААИ, али значајно мање регулисани код Клф6ПТКД мишева након ААИ према класи везивног места: класа 2 са већим или једнаким 1 КЛФ6 везивним местом унутар ±1 кб ТСС; класа 1 са већим или једнаким 1 КЛФ6 везивном месту на ±1 до 10 кб од ТСС-а; и класа 0 без места везивања КЛФ6 унутар ± 10 кб од ТСС-а. (Б) Класификација и анализа обогаћивања пута гена који су наниже регулисани код Клф6фл/фл мишева након ААИ, али значајно мање регулисани (тј. очувани) код Клф6ПТКД мишева после ААИ према класи места везивања: класа 2 са већим или једнаким 1 место везивања КЛФ6 унутар ±1 кб од ТСС; класа 1 са већим или једнаким 1 месту везивања КЛФ6 на ±1 до 10 кб од ТСС; и класа 0 без места везивања КЛФ6 унутар ±10 кб од ТСС. (Ц) Графичке анализе обогаћивања скупа гена користећи све диференцијално експримиране гене, за КЕГГ разградњу масних киселина (ФА ДЕГРАД), метаболизам амино киселина (АА МЕТАБ) и ТЦА циклус (КЕГГ_ТЦА).
утврдили да ли је ова супресија експресије БЦАА гена у присуству ААИ довела до промена у катаболизму БЦАА, мерили смо интрацелуларне концентрације БЦАА. После третмана са ААИ, КЛФ6- Цон ћелије су показале смањење БЦАА, у складу са повећаним катаболизмом БЦАА, потенцијално као компензација за губитак оксидације ФА (слика 5Б). Међутим, овај ефекат је изгубљен у КЛФ6-ОЕ ћелијама, које нису имале смањење интрацелуларног БЦАА након третмана ААИ, што је у складу са смањеном способношћу катаболизације БЦАА (слика 5Б), а то је било у корелацији са смањеном производњом митохондријалног АТП-а у поређењу са ААИ-третираним КЛФ6-Цон ћелијама (слика 5Ц).
Стандардни медији који се користе за мерење производње АТП садрже високе концентрације глукозе (10 мМ глукозе, 1 мМ глутамина и 2 мМ пирувата), а да бисмо утврдили да ли прекомерна експресија КЛФ6 сама по себи може да промени употребу различитих извора енергије, уместо тога смо предузели анализе брзина потрошње кисеоника (ОЦР) у медијима са ограниченом енергијом (медији без серума са 1 мМ глукозе, без глутамина и без пирувата). КЛФ6-ОЕ ћелије су имале смањен митохондријски ОЦР (дефинисан као почетни ОЦР минус немитохондријски ОЦР одређен након примене ротенона/антимицина А), али су имале сличну компензацију након блокирања гликолизе са 2-деоксиглукозом (2- ДГ) и слични ФАО (смањење ОЦР након блокирања ФАО са етомоксиром) (Слика 5 Д и Е). Пошто одговор митохондрија на губитак гликолизе и ОЦР који је резултат оксидације ФА нису промењени у КЛФ6-ОЕ ћелијама, ово сугерише да укупна митохондријална функција није погођена, већ немогућност употребе БЦАА као извора може узети у обзир основно смањење митохондријалног ОЦР-а у овим енергетски ограниченим условима. Да бисмо утврдили да ли би губитак БЦАА катаболизма довео до смањене производње митохондријалног АТП-а, генерисали смо ХК-2 ћелије са обарањем БЦКДХБ (СИ додатак, слика С7). БЦКДХА и БЦКДХБ кодирају две подјединице великог протеинског комплекса кетокиселине дехидрогеназе разгранатог ланца (БЦКДХ), која катализује први иреверзибилни корак који ограничава брзину катаболизма БЦАА и инхибира се фосфорилацијом БЦКДХ киназом (БЦКДК) (28). Да би се променила контрола БЦКДХБ-СЦР и срушиле БЦКДХБ-сх ћелије ка производњи митохондријалног АТП-а, оне су претходно инкубиране у 2-ДГ да блокирају гликолизу 1 х пре предузимања теста брзине производње АТП-а. Обарање БЦКДХБ је довело до значајног смањења производње АТП-а, показујући да се БЦАА користе за стварање АТП-а код људибубрегаћелије (слика 5Ф). Насупрот томе, да
Слика 4. Мишеви хКЛФ6ОЕ су се погоршалиповреда бубрегаса супресијом БЦАА гена. (А и Б) Концентрације серумског креатинина (А) и азота урее (Б) код контролних и хКЛФ6ОЕ мишева третираних ДМСО или ААИ у активној фази. н=4 до 9 по групи; $П < 0.05,="" $$п="">< 0.01,="" $$$п="">< 0.0{="" {26}}1="" у="" односу="" на="" исти="" генотип="" са="" дмсо;="" **п="">< 0.01="" у="" односу="" на="" контролу="" са="" ааи;="" једносмерна="" анова="" са="" сидак="" корекцијом="" за="" вишеструко="" тестирање.="" (ц="" и="" д)="" репрезентативне="" хистолошке="" слике="" обојене="" хематоксилином="" и="" еозином="" (ц)="" и="" периодичном="" киселином="" по="" шифу="" (д).="" жуте="" стрелице:="" проливене="" тубуле;="" црне="" стрелице:="" остаци="" базалних="" мембрана;="" жути="" врхови="" стрела:="" протеински="" одливци;="" и="" црни="" врхови="" стрела:="" инфламаторни="" инфилтрати.="" (сцале="" бар,="" 100="" μм.)="" (е)="" имунофлуоресцентно="" бојење="" за="" цитокератин-20="" (крт-20)="" као="" маркер="" повређеног="" пт="" (црвено)="" са="" бојењем="" лотосовим="" лектином="" (лл="" )="" као="" маркер="" неповређеног="" пт="" (зелено).="" (сцале="" барс,="" 250="" μм.)="" (ф)="" имунофлуоресцентно="" бојење="" за="" -сма="" (зелено)="" са="" обојењем="" за="" еду="" (магента).="" (сцале="" барс,="" 100="" μм.)="" (г)="" експресија="" мрна="" бцаа="" гена="" код="" контролних="" и="" хклф6ое="" мишева="" третираних="" дмсо="" или="" ааи="" у="" активној="" фази.="" н="5" до="" 9="" по="" групи;="" $п="">< 0,01,="" $$п="">< 0,001="" у="" односу="" на="" контролу="" са="" дмсо;="" сви="" хклф6ое="" са="" ааи="" су="" п="">< 0,001="" у="" односу="" на="" хклф6ое="" са="" дмсо;="" *п="">< 0,05,="" **п="">< 0,01,="" ***п="">< 0,001="" у="" односу="" на="" контролу="" са="" истим="" третманом;="" вишеструки="" т="" тестови="" са="" корекцијом="" стопе="" лажног="" открића="" користећи="" двостепени="" модел="" за="" повећање="" од="" бењаминија,="" креигера="" и="" иекутиелиа.="" подаци="" су="" средњи="" ±="" сем="" са="" н="" који="" означава="" број="" биолошких="">
побољшали БЦАА катаболизам, третирали смо ХК-2 ћелије са БТ2, који инхибира БЦКДК, блокирајући тако инхибиторну фосфорилацију БЦКДХ. У условима ограничене енергије, третман са БТ2 је повећао ОЦР у ћелијама третираним ДМСО, који је био одржан након инхибиције гликолизе, а не због промене ФАО или немитохондријалног ОЦР (Слика 5 Г и Х). Ови налази указују на то да КЛФ6-посредована супресија БЦАА катаболизма смањује производњу митохондријалног АТП-а, што би вероватно погоршало ПТ повреду у окружењу ћелијског стреса, у коме постоје слични услови са ограниченим енергијом због угрожавања ФАО.
Експресија БЦАА гена је смањена код различитих мишева и људиПовреде бубрега. Да бисмо утврдили да ли се губитак експресије БЦАА гена јавља пре губитка ПТ и повећаног нивоа креатинина код повреде изазване ААИ, предузели смо кРТ-ПЦР код Ц57БЛ/6 мишева третираних једном дозом ААИ и еутаназираних након 24 х. Бцкдхб, Хибцх и Мццц2 су већ били значајно смањени у овој временској тачки, док су други гени (нпр. Ацадм) показали снажан тренд ка смањеној регулацији (слика 6А). За проучавање експресије БЦАА гена код другог мишаповреда бубрегамодела, предузели смо кРТ-ПЦР код мишева третираних цисплатином (слика 6Б) или подложних УУО (слика 6Ц). У оба модела, експресија Клф6 је била високо регулисана у односу на возило/контроле. Код мишева третираних цисплатином, неколико тестираних БЦАА гена је било значајно смањено, са трендовима ка смањењу регулације осталих гена (слика 6Б). Код мишева који су подвргнути УУО, сви тестирани гени су значајно смањени на 3 и 7 дана након УУО (слика 6Ц), што сугерише да се регулација БЦАА гена јавља рано након повреде.
Слика 5. Прекомерна експресија КЛФ6 потискује експресију БЦАА гена, производњу АТП-а и коришћење БЦАА ин витро. (А) Експресија метаболичких гена КЛФ6 и БЦАА у ХК-2 ћелијама које стабилно експримирају контролне (Цон) или КЛФ6 прекомерне експресије (ОЕ) плазмиде, третиране ДМСО или ААИ. н=4 по групи; *П < 0.05,="" **п="">< {{10}}.01,="" ***п="">< 0.{101}="" {21}}01="" против="" цон="" ааи;="" $п="">< 0.{{3{{40}}}}5,="" $$п="">< 0.01,="" $$$п="">< 0,001="" у="" односу="" на="" исту="" ћелијску="" линију="" са="" дмсо;="" двосмерна="" анова="" са="" тукијевом="" корекцијом="" за="" вишеструко="" тестирање.="" (б)="" квантификација="" укупних="" бцаа="" у="" цон="" и="" ое="" ћелијама="" третираним="" дмсо="" или="" ааи.="" н="6" по="" групи;="" $п="">< 0,05="" у="" односу="" на="" цон="" дмсо;="" једносмерна="" анова="" са="" сидаковом="" корекцијом="" за="" вишеструко="" тестирање.="" (ц)="" процентуална="" промена="" у="" стопи="" производње="" митохондријалног="" атп-а="" у="" цон="" и="" ое="" ћелијама="" третираним="" ааи="" у="" односу="" на="" дмсо.="" н="27" до="" 30="" по="" групи;="" *п="">< 0,05,="" ***п="">< 0,001="" у="" односу="" на="" дмсо,="" $п="">< 0,05="" у="" односу="" на="" цон="" ааи;="" једносмерна="" анова="" са="" сидаковом="" корекцијом="" за="" вишеструко="" тестирање.="" (д)="" оцр="" мерења="" за="" цон="" и="" ое="" ћелије="" у="" ограниченим="" медијима.="" где="" је="" назначено,="" додати="" су="" 2-дг,="" етомоксир="" (ето)="" и="" комбинација="" ротенона/антимицина="" а="" (рот).="" н="16" по="" групи.="" (е)="" квантификације="" базалног="" митохондријалног="" оцр-а="" (почетни="" оцр="" минус="" пост-рот="" оцр),="" немитохондријалног="" оцр-а="" (пост-рот="" оцр)="" и="" промена="" у="" оцр-у="" након="" додавања="" 2-дг="" (компензација="" митохондрија="" после="" 2-дг)="" и="" етомоксир="" (фао).="" н="16" по="" групи;="" **п="">< 0,01="" у="" односу="" на="" цон;="" двосмерна="" анова="" са="" тукијевом="" корекцијом="" за="" вишеструко="" тестирање.="" (ф)="" стопа="" производње="" митохондријалног="" атп-а="" у="" бцкдхб-сцр="" и="" бцкдхб-сх="" ћелијама.="" н="14" по="" групи;="" **п="">< 0,05,="" неупарени="" т="" тест.="" (г)="" оцр="" мерења="" у="" хк-2="" ћелијама="" у="" ограниченим="" медијима="" у="" одсуству="" или="" присуству="" бт2.="" где="" је="" назначено,="" 2-дг,="" ето="" и="" рот="" су="" додати.="" (х)="" квантификације="" базалног="" митохондријалног="" оцр-а,="" немитохондријалног="" оцр-а="" и="" промена="" у="" оцр-у="" након="" додавања="" 2-дг="" и="" етомоксира="" у="" хк-2="" ћелије="" у="" одсуству="" или="" присуству="" бт2.="" н="8" по="" групи;="" *п="">< 0,05="" у="" односу="" на="" бт2;="" двосмерна="" анова="" са="" тукијевом="" корекцијом="" за="" вишеструко="" тестирање.="" подаци="" су="" средњи="" ±="" сем="" са="" н="" који="" означава="" број="" биолошких="">
Слично томе, прикупљање података о претходно објављеном низу експресије из тубулоинтерстицијалног одељка 36 хуманих пацијената са ЦКД (хипертензивни и дијабетичариболести бубрега) у поређењу са контролним пацијентима (6) показало је да се неколико БЦАА гена регулише на сличан начин као код мишева третираних ААИ (слика 6Д). Да би се додатно разјаснио однос измеђуфункцију бубрега, експресију КЛФ6 и експресију БЦАА гена у хуманој ЦКД, користили смо објављени низ експресије из тубу лоинтерстицијалног одељка серије од 164 пацијената са различитимболести бубрега (29). Ranking of patients by eGFR showed a significant inverse correlation between eGFR and KLF6 expression and a significant positive correlation between eGFR and each BCAA gene expression, with significant inverse correlations also between KLF6 and each BCAA gene expression (Fig. 6E). Indeed, even individuals with only moderate decreases in eGFR (∼45 to 60 mL/min/1.73m2) had significantly increased expression of KLF6 and decreased BCAA gene expression compared to individuals with normal eGFR (>90 мЛ/мин/1,73м2) (П <0,001 за="" све="" гене),="" што="" показује="" да="" се="" ове="" промене="" у="" експресији="" гена="" могу="" јавити="" рано="" у="" односу="" на="" функционалне="" промене.="" заједно,="" ови="" подаци="" сугеришу="" да="" клф6-посредована="" супресија="" гена="" критичних="" за="" катаболизам="" бцаа="" може="" да="" игра="" кључну="" улогу="" у="">повреда бубрегау мишјим моделимабубрегафиброзе као и код ЦКД код људи.
Дискусија
У овој студији демонстрирамо ин виво улогу КЛФ6 специфичног за ПТ у окружењуповреда бубрега.КЛФ6 је снажно и доследно регулисан на почетку ПТ као одговор наповреда бубрега, али ово је неприлагођен одговор, као што је показано заштитним ефектом губитка ПТ Клф6 након третмана са клинички релевантним и високо ПТ-специфичним токсином ААИ. Поред тога, демонстрирамо потенцијални значај нерегулисаног метаболизма БЦАА код повређеног ПТ као могућег доприноса АКИ и фиброзе која је уследила. Губитак Клф6 довео је до очувања експресије БЦАА катаболичког ензима, при чему неколико гена који кодирају ове ензиме имају места везивања КЛФ6 у непосредној близини њихових ТСС, што сугерише да КЛФ6 може бити супресор транскрипције БЦАА катаболизма. Иако је раније показано да други члан породице КЛФ, КЛФ15, регулише експресију аминотрансферазе 2 (Бцат2) разгранатог ланца скелетних мишића (30), регулација других БЦАА ензима није пријављена. Претпостављамо да КЛФ6 делује на сузбијање експресије више гена који кодирају БЦАА ензиме.
Код неповређеног ПТ, експресија Клф6 је ниска и променљиво изражена у неким ПТ ћелијама, а не у другим. Брза и снажна регулација која се јавља након више врста повреда сугерише физиолошки важну улогу КЛФ6. У фибробластима се недавно показало да је КЛФ6 појачано регулисан као одговор на онкогени и оксидативни стрес, што доводи до ћелијског старења, док је утишавање КЛФ6 довело до акумулације маркера оштећења ДНК и геномске нестабилности (31). Дакле, физиолошка улога КЛФ6 у повредама може бити индукција ћелијског старења, омогућавајући поправку оштећења ДНК која могу бити резултат токсичних или оксидативних/исхемијских увреда. Међутим, у повређеним ПТ ћелијама, изгледа да је друга последица регулације Клф6 навише супресија БЦАА катаболизма што је вероватно штетно у ПТ ћелијама. Занимљиво, упркос делимичном нокдауну ПТ-специфичног Клф6 на почетку код Клф6ПТКД мишева, ово је и даље било у стању да пружи јасан заштитни ефекат након повреде. Ово има важне терапеутске импликације, јер сугерише да само мала манипулација нивоима или активностима КЛФ6 (нпр. употребом инхибитора малог молекула) може показати терапеутску ефикасност. Заиста, фактори транскрипције су вероватнији него друге породице гена
у људском геному да имају осетљивост на дозу (32). Слично томе, једно ограничење нашег индуцибилног мишјег модела прекомерне експресије КЛФ6 је то што то није ограничена ПТ ћелије, и као такве, будуће студије ће морати да се фокусирају на коришћење ћелијско-специфичног-индуцибилног модела да би се разјаснила улога КЛФ6 зависна од ћелијског контекста.
Претходно смо показали да је губитак Клф6 у гломеруларним подоцитима штетан за постављање ФСГС-а због његове улоге у транскрипционој активацији синтезе цитокром ц оксидазе 2 (Сцо2). Губитак Клф6 у ФСГС довео је до погоршања фиброзе, уз повећану активацију унутрашњег апоптотичког пута (15). Испитивање доступних једноћелијских РНА-сек скупова података показује то код здравих мишевабубрези,Клф6 се експресује у много већем уделу подоцита него у ПТ ћелијама, и то на много вишем нивоу (реф. 33; хттпс:// сусзтаклаб.цом/). КЛФ6 стога вероватно игра важнију физиолошку улогу у нормалним подоцитима него у ПТ ћелијама, док су други познати главни регулатори митохондрија (нпр. Ппара) експримирани много више у ПТ ћелијама него у подоцитима. Дакле, губитак Клф6 у подоцитима стога вероватно има штетнији ефекат него у ПТ ћелијама. Контрастне улоге КЛФ6 у различитим типовима ћелија унутарбубрегапаралелно са претходним налазима специфичних ефеката ћелија на срце и јетру. Дакле, нокдаун Клф6 у срчаним миоцитима код мишева ослабио је срчану фиброзу након преоптерећења ангиотензином ИИ, што указује на улогу КЛФ6 у пропагирању фиброзе, али нокдаун Клф6 у срчаним миофибробластима није имао утицаја на фиброзу (14). Супротно томе, у јетри, обарање Клф6 у хепатоцитима миша није имало утицаја на фиброзу јетре након хроничне примене ЦЦл4, али прекомерна експресија КЛФ6 у звездастим ћелијама јетре је резултирала смањеном фиброзом, што сугерише да је КЛФ6 протективан (13).
ЦИСТАНЦХЕ ЋЕ ПОБОЉШАТИ БОЛ БУБРЕГА/БУБРЕГА
Губитак ФАО токомповреда бубрегасада је познато да је важан догађај у патологијиповреда бубрегаи заиста може директно допринети фибрози. У одсуству ФАО-а, који је главни извор енергије за неповређени ПТ, други потенцијални извори енергије могу добити већи значај. БЦАА доприносе циклусу ТЦА кроз производњу ацетил-ЦоА и сукцинил-ЦоА. Недавна студија је показала да не само да БЦАА обележени са 13Ц доприносе ТЦА интермедијерима циклуса убубрегаалибубрегаимала је четврту највећу инкорпорацију 13Ц у интермедијере ТЦА циклуса тестираних органа, после панкреаса, мишића и белог масног ткива (34), што сугерише да БЦАА потенцијално могу да допринесу ТЦА циклусу. Међутим, значај БЦАА катаболизма у доприносу ТЦА циклусу, било код нормалних или повређенихбубрези, није раније истражен. На пример, није познато да ли би губитак ПТ БЦАА катаболизма сам изазвао промене у ПТ хомеостази и/или поправци, а ове студије ће захтевати генерисање нових модела миша као што су ПТ-специфични Бцкдхб мишеви. У поставцибубрегаповреда, када је ФАО озбиљно потиснут, додатно сузбијање од
гени који кодирају БЦАА метаболичке ензиме могу лишити тубуларне ћелије важног алтернативног потенцијалног извора енергије. Важно је напоменути да је експресија БЦАА гена већ смањена 24 х након једне ињекције, пре било каквих промена у серумском креатинину или губитка ПТ, што указује да су ове смањене регулације биле специфична последица повреде ПТ и нису повезане са смањеном потражњом за енергијом за ПТ која је резултирала од смањене ГФР и последично смањене потребе за уносом растворене супстанце. Ови путеви су сачувани код Клф6ПТКД мишева који су били заштићени од повреда и даље потиснути код хКЛФ6ОЕ мишева који су имали гору повреду. Поред тога, КЛФ6-ОЕ ћелије су имале смањену производњу митохондријалног АТП-а након третмана ААИ у поређењу са КЛФ6-Цон ћелијама, и док су унутарћелијске БЦАА смањене у КЛФ6-Цон ћелијама, у складу са њиховим катаболизмом , ово смањење није откривено у КЛФ6-ОЕ ћелијама. Штавише, обарање БЦКДХБ у ХК-2 ћелијама довело је до смањене производње митохондријалног АТП-а. Дакле, очувана експресија БЦАА гена код Клф6ПТКД мишева може обезбедити заштиту од повреда снабдевањем виталних интермедијара ТЦА циклуса у окружењу озбиљно смањене оксидације ФА. Будуће студије које користе мишеве са генетским манипулацијама катаболизма БЦАА и/или третмана са БТ2 омогућиле би нам да истражимо динамику између БЦАА катаболизма и ФАО уповреда бубрега.
Показали смо да губитак експресије БЦАА гена доводи до смањеног дисања митохондрија и производње АТП-а, а ово представља један механизам помоћу којег губитак БЦАА катаболизма може допринетиповреда бубрега. Алтернативни механизам може бити кроз акумулацију БЦАА, која може имати токсични ефекат. Заиста, ово се показало у поставци срчане ИРИ. Показало се да акумулација БЦАА услед губитка катаболизма инхибира употребу пирувата у митохондријама посттранслационом инактивацијом пируват дехидрогеназе, чиме се уклања даљи ћелијски извор енергије и погоршава повреда (35). Ово је преокренуто или повећањем БЦАА катаболизма третирањем мишева са БТ2 или повећањем метаболизма глукозе прекомерном експресијом ГЛУТ1. Недавна студија је такође показала погоршање срчане ИРИ губитком БЦАА катаболизма код дијабетичких мишева. Ово је било праћено повећаним оксидативним стресом и поново је поништено реактивацијом БЦАА катаболизма (36). Познато је да БЦАА и посебно леуцин активирају сигнализацију рапамицинског (мТОР) комплекса 1 (мТОРЦ1) код сисара. У мишјем моделу полицистичнихобољење бубрега,у којима ћелије које окружују цисте имају активацију мТОР
сигнализација, суплементација са БЦАА додатно је активирала мТОРЦ1 сигнализацију, што је довело до повећане пролиферације (37). Транскрипционо профилисање хепатоцелуларних карцинома открило је смањену експресију БЦАА гена, што је довело до акумулације БЦАА у туморском ткиву. Ово је било повезано са повећаном сигнализацијом и пролиферацијом мТОРЦ1, која је смањена ограничавањем БЦАА или третманом са БТ2, а погоршана је код мишева храњених високом БЦАА исхраном (38). мТОРЦ1 сигнализација је потребна за ПТ функцију, а студије које користе мТОР инхибиторе уповреда бубрегасу показали опречне резултате, вероватно због различитих режима дозирања, времена третмана и модела повреда (39–42). мТОРЦ1 сигнализација доводи до мноштва ћелијских одговора, укључујући раст и пролиферацију ћелија, синтезу липида, митохондријалну синтезу и супресију аутофагије (43). Вероватно је да или недовољна или претерана активација мТОРЦ1 сигнализације може бити штетна и да је потребна равнотежа за исправну ћелијску функцију. На пример, прекомерна активација мТОРЦ1 сигнализације код повреде ПТ може довести до штетне супресије аутофагије, која је потребна за уклањање оштећених митохондрија, а показало се да је важна за опоравак након ПТповреда (39, 42, 44, 45). Дакле, акумулација леуцина може имати штетну улогу уповреда бубрегапрекомерном активацијом мТОРЦ1 сигнализације и супресијом аутофагије. У закључку, показали смо да се снажна регулација Клф6 навише која се јавља уповреда бубрегаје штетан, при чему је губитак ПТ-специфичног Клф6 сачувао експресију БЦАА гена и ослабио АКИ и евентуалну фиброзу. Супротно томе, индукција КЛФ6 код мишева је потиснула експресију БЦАА гена и довела добубрегаподложанповреда бубрега.Штавише, гени који кодирају више БЦАА ензима имају КЛФ6 везујућа места, што сугерише да КЛФ6 може бити транскрипциони регулатор катаболизма БЦАА. Смањење регулације катаболизма БЦАА ин витро прекомерном експресијом КЛФ6 и третманом са ААИ, или обарањем БЦКДХБ, довеодо смањене производње митохондријалног АТП-а. Колективно, теподаци сугеришу да терапеутски циљано очувањеБЦАА катаболизам може да обезбеди алтернативни митохондријизвор енергије у окружењуповреда бубрегау којој ФАОсмањено је.
