Ламивудин побољшава когнитивни пад код САМП8 мишева: Интеграција ин виво фармаколошке евалуације и мрежне фармакологије

Апстрактан

Инхибитори реверзне транскриптазе као што је ламивудин (3ТЦ) играју важну улогу упротив старења, али њихов утицај нанеуродегенеративне болести узроковане старењемнису јасне, посебно о функцијаманервни систем као што је спознаја. У овој студији, давали смо 3ТЦ мишевима 8 (САМП8) склоном старењу са убрзаним старењем гастричном перфузијом (100 мг/кг) током 4 недеље. Наши резултати су показали да је 3ТЦ значајно побољшаостатус старења САМП8 мишева, посебно пад когнитивне способности процењен Моррисовим тестом воденог лавиринта. Да би даље истражили молекуларне механизмепобољшање статуса старењаСАМП8 мишева помоћу 3ТЦ, кПЦР и методе бојења ткива су коришћене за проучавање можданих ткива (тј. хипокампуса и кортекса) мишева, док је анализа мрежне фармакологије примењена за истраживање потенцијалних циљева 3ТЦ. Резултати су показали да се нивои мРНА гена односе на дуго интерсперговани елемент-1, одговор интерферона типа 1, фенотип лучења повезан са старењем иАлцхајмерова болесту хипокампусу и кортексу САМП8 мишева су повећане збогстарење, али је овај тренд делимично преокренуо 3ТЦ. Резултати хистолошких студија су показали да 3ТЦ смањује смрт хипокампалних неурона, док резултати мрежне фармаколошке анализе указују да 3ТЦ може да утиче на више путева, укључујући сигнализацију естрогена и сигналне путеве ПИ3К/Акт и неуроактивне интеракције лиганд-рецептор, што смо верификовали кроз ин витро експерименте. Ови налази пружају доказе о терапеутском потенцијалу 3ТЦ у лечењу неуродегенеративних болести.

КЉУЧНЕ РЕЧИстарење, когнитивна способност, ламивудин, лумешан елемент-1, неуродегенеративне болести

Кинеско биље Цистанцхе Еффецт ОнИнхибитори реверзне транскриптазе против старења

1|УВОД

До данас су старење и неуродегенеративне болести, као нпрАлцхајмерова (АД) или Паркинсонова болесткоји су повезани са старењем, све су у порасту због глобалних демографских промена.1,2 когнитивни пад представља озбиљну препреку постизању дугог и здравог живота. Деценијама су улагани значајни напори у потрази за лековима који се могу користити за лечење когнитивне дегенерације са старењем.3 Последњих година, елемент са дугим испреплетањима-1 (Л1) добија све већу пажњу као потенцијални роман циљ за проучавање старења.4 Л1 припада најзаступљенијој породици ретротранспозона са недугим терминалним понављањем са ~500,000 копија, који чине ~17 процената људског генома. Л1 ген се састоји од оперона са два отворена оквира читања (ОРФ1 и ОРФ2), од којих су оба потребна за ретротранспозицију.5–7 ОРФ1 кодира протеин (ОРФ1п) са активностима реверзне транскриптазе које могу инхибирати аналози нуклеозида, као нпр. ламивудин (2'-3'-деокси-3'-тиоцитидин, 3ТЦ).8

Активни Л1 може да синтетише цДНК изван хроматина, а затим је поново убаци у геном који катализира ОРФ1п, на крају мењајући експресију других гена и резултирајући болестима повезаним са геномском нестабилношћу.9,10 Домаћин генерално инхибира транспозибилну активност Л1 кроз низ регулација, као што су епигенетска модификација и регулација ограничавајућег фактора домаћина.11,12 Транспозиција Л1 се генерално дешава само у клицама или ћелијама рака, док су недавне студије показале да је Л1 такође веома активан у централном нервном систему или ћелијама које старе, иако основни нервни механизми Л1 су нејасни.13 Студије су показале да фактори (нпр. ТРЕКС1, РБ1 и ФОКСА1) који се односе на механизам праћења Л1 нису функционални у ћелијском старењу, што доводи до активације Л1. ТРЕКС1 је 3' егзонуклеаза која разграђује стране ДНК инвазије и његов губитак је повезан са акумулацијом цитоплазматске Л1 цДНК.14 Показало се да се РБ1 везује за елементе који се понављају, укључујући Л1 елементе, и промовише њихову хетерохроматинизацију.15 А ФОКСА1 је регулисани навише у сенесцентним ћелијама13 и везани за централни регион Л1 5' УТР. Активирани Л1 даље активира одговор интерферона типа-И (ИФН-И), који индукује упалу путем реверзне транскрипционе цДНК и одржава фенотип лучења повезан са старењем (САСП). Стога, као важан фактор у асептичној инфламацији изазваној старењем, Л1 се сматра важном метом за лечење болести повезаних са старењем. Код старијих мишева лечених 3ТЦ, акумулација инфламаторних фактора је побољшана инхибицијом екстрацелуларне транскрипције Л1 у мишићном и другим ткивима.16 До данас, студије о ефектима инхибитора реверзне транскриптазе на функције нервног система су ретке. Недавно су хиљаде варијанти геномске цДНК (генцДНК) пронађене у мозгу преминулих пацијената са АД, које су резултат поновног уметања карактеристичних варијанти спајања РНК у геном.17 Овај феномен се сматра важним узроком АД. Фактори који изазивају стварање генцДНК укључују транскрипцију, уништавање ДНК, реверзну транскриптазу и старење.

Студије су показале да је процес формирања генцДНК блокиран употребом нуклеозидних инхибитора реверзне транскриптазе у ћелијским линијама јајника кинеског хрчка (ЦХО) са активностима ендогене реверзне транскриптазе.19 Штавише, пацијенти са АИДС-ом старији од 65 година који су узимали инхибиторе реверзне транскриптазе дуго времена ретко развијао АД.20 Стога, ми спекулишемо да 3ТЦ, као инхибитор реверзне транскриптазе, може бити потенцијални лек за лечење когнитивних оштећења и неуродегенеративних болести изазваних старењем. Показало се да мишеви склоне старењу 8 (САМП8), као модел за проучавање старења људи и болести повезаних са старењем, показују многе карактеристике за које се зна да се јављају у раним стадијумима неуродегенеративних болести, као што су повећани оксидативни стрес, неуроинфламација и когнитивни пад.21 Стога су у овој студији САМП8 мишеви одабрани као идеалан животињски модел за неуродегенеративне болести изазване старењем. Фокусирали смо се на когнитивне ефекте 3ТЦ на мишеве превременог старења и молекуларне путеве повезане са старењем, пружајући доказе о улози инхибитора реверзне транскриптазе у лечењу неуродегенеративних болести услед старења. Даље смо применили метод мрежне фармакологије да бисмо предвидели циљеве 3ТЦ, конструисали мреже и анализирали биолошке функције и путеве повезане са 3ТЦ.

2|ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ДЕО 2.1 |

Животиње 44-недељни мужјак САМП8 и сродни мишеви са нормалним убрзаним старењем Р1 (САМР1) које је обезбедио Универзитет традиционалне кинеске медицине Тиањин коришћени су након 1-недељног периода аклиматизације. Експериментални протокол на животињама је одобрио Комитет за етику животиња провинцијске болнице Шандонг и изведен је на основу Водича за негу и употребу лабораторијских животиња Националног института за здравље (НИХ). Мишеви су држани у аутоклавираним кавезима и давани су стерилном храном и водом. Телесна тежина мишева је бележена сваког дана. Дијаграм тока експеримената спроведених у овој студији дат је на слици 1А. По завршетку експеримената, мишеви су еутаназирани инхалацијом диетил етра.

2.2|Припрема и третман 3ТЦ

Лекови су свеже припремљени на дан сваког експеримента. 3ТЦ купљен од МЦЕ (Шангај, Кина) растворен је у ДМСО до коначне концентрације од 2 ммол/Л. Основни раствор је затим разблажен до радне концентрације коришћењем воде за пиће са коначном концентрацијом ДМСО мањом од 0.1 проценат. Формиране су три групе мишева: контролна група третирана раствором вехикулума (вода за пиће), тест група третирана са 3ТЦ и група САМР1 која је примила вехикулум који се користи као друга контролна група за старење. Тест група је орално примала 3ТЦ у дози од 100 мг/кг дневно. Сви мишеви су храњени интрагастричном применом током 4 недеље (Слика 1Б).

СЛИКА 1 Експериментални дизајн и ефекти 3ТЦ на побољшање релативног губитка тежине због оцена старења и старења. (А) Дијаграм тока фармаколошких експеримената за проучавање ефекта 3ТЦ на когнитивне способности САМП8 мишева. (Б) Шематски приказ распореда експеримената на животињама. (Ц) Концептуални ток рада за предвиђање интеракција лек-циља помоћу Пхарммаппер-а који приказује, с лева на десно, молекуларну структуру 3ТЦ, 3Д структурни дијаграм 3ТЦ и фармакофорски модел предвиђен са 3ТЦ везивањем за рецептор естрогена са највишом нормализованом фит сцорес. (Д) Образац раста телесне тежине у свакој групи мишева. (Е) Промене у оценама пре и после третмана 3ТЦ. САМР1 плус возило: 44-недељни САМР1 мишеви третирани возилом током 4 недеље. САМП8 плус возило: 44-недељни САМП8 мишеви третирани возилом током 4 недеље. САМП8 плус 3ТЦ: 44-недељни САМП8 мишеви третирани 3ТЦ током 4 недеље. Студентов т-тест: *п < 0.05, **п < 0.01 и ***п < 0,001. нс: нема статистичке значајности. Црне звездице представљају поређење са групом возила САМР1 плус. Црвене звездице представљају поређење са групом возила САМП8 плус. Плава линија означава САМП8 плус 3ТЦ групу у доби од 44 и 48 недеља.

2.3|Систем оцењивања

Степен старења код мишева је процењен коришћењем система оцењивања који је претходно описан.22 Свака категорија резултата садржи пет нивоа, у распону од 0 до 4 са највишим резултатом оцене који указује на највиши степен старења животиње . Резултати за сваку категорију су одвојено процењени од стране четири искусна експериментатора који су били заслепљени за услове лечења (додатна табела С1).

.2.4|Моррисов тест воденог лавиринта

Студије Моррисовог воденог лавиринта вршене су према Моррисовом протоколу, укључујући експеримент оријентацијске навигације и испитивања сонде.23 Водени лавиринт је био кружни базен (120 цм у пречнику опремљен платформом од 10 цм у пречнику) и испуњен водом на 25 ± 1 степен. Мишеви су обучени да пронађу платформу испод површине воде у року од једног минута. Ако миш није пронашао платформу у року од 60 с, вођен је до платформе и дозвољено му је да тамо остане 20 с. Сваки од мишева је трениран пет пута дневно са сваким одвојеним један од другог за 15 минута. У сваком огледу, почетна позиција је била другачија, у псеудослучајном редоследу. Шестог дана теста, платформа је уклоњена и животиња је ушла у водени лавиринт са тачке супротне од квадранта лавиринта где се платформа налазила током тренинга и дозвољено јој је да истражује лавиринт 60 с. Путања пливања и количина времена које су мишеви провели тражећи лавиринт снимљени су видео камером и анализирани помоћу ЕтхоВисион КСТ (Нолдус софтвер). Свака група се састојала од најмање осам животиња.

2.5|Екстракција РНК и квантитативни ПЦР

Укупна РНК је екстрахована из хипокампалног и кортикалног ткива мишева након третмана коришћењем ТРИзол реагенса (Инвитроген) према протоколу произвођача. Сваки узорак РНК (1 уг) је реверзно транскрибован да се генерише цДНК коришћењем комплета за реверзну транскрипцију цДНК (Такара), а затим ПЦР-амплификован коришћењем ТаКаРа Так комплета (Такара). Сетови прајмера су описани у додатној табели С2.

2.6|Припрема ткива

Животиње су анестезиране диетил етром, а њихови мозгови су сакупљени након транскардијалне перфузије физиолошким раствором пуферованим фосфатом (ПБС) и 4 процентним раствором параформалдехида. Ткива мозга су уклоњена и фиксирана у параформалдехиду више од 2 дана. Фиксни мозгови су уграђени у парафин са ткивом хипокампуса пресеченим на дебљини од 5 μм.

2.7|Бојење хематоксилином и еозином (Х & Е).

Морфологија мозга је анализирана коришћењем метода бојења хематоксилином и еозином (Х&Е). Парафински делови ткива хипокампуса су депарафинисани и дехидрирани са градијентом алкохола низа концентрација. ХЕ бојење је изведено коришћењем комплета за бојење Х&Е (Соларбио) према упутствима произвођача. Након потапања у етанол и ксилен, секције су монтиране смолом и посматране под светлосним микроскопом (Олимпус).

2.8|Ниссл бојење

Метода Ниссл бојења (Бииунтиан) је коришћена за откривање неуронске повреде на деловима ткива хипокампуса. Секције су инкубиране са Ниссл бојом 30 минута и испране са 95% етанола. Обојене ћелије су избројане и фотографисане под светлосним микроскопом (Олимп). Ћелије су пребројане на три насумично одабрана поља која се не преклапају у сваком слајду хипокампалног ткива са индексом преживљавања дефинисаним као број преживелих неурона/укупан број неурона.

2.9|ТУНЕЛ бојење

Секције хипокампалног ткива су инкубиране са раствором протеиназе К током 15 минута, након чега је уследила инкубација са ТУНЕЛ реакционом смешом (Беиотиме). Након три пута прања са ПБС-ом, секције су монтиране раствором за монтажу који садржи нуклеарну боју ДАПИ и посматрано коришћењем конвенционалног флуоресцентног микроскопа или конфокалног ласерског флуоресцентног микроскопа.

2.10|Изградња циљне базе података 3ТЦ

Циљна база података 3ТЦ-а је конструисана на основу две базе података. Прво, потенцијалне мете 3ТЦ су идентификоване коришћењем реверзне фармакодинамичке генске мапе засноване на Пхарммаппер бази података (хттп://ввв.лилаб-ецуст.цн/пхарммаппер/ресултс/20081 6062539.хтмл). Све хемијске компоненте су конвертоване у формат '.мол2' од стране компаније Цхембиодрав и отпремљене у Пхарммаппер базу података (Слика 1Ц). Молекули са нормализованим резултатом прилагођавања већим од 4.0 идентификовани су као потенцијалне мете 3ТЦ. Друго, ЦхЕМБЛ база података (хттпс://ввв.еби.ац.ук/цхембл/цомпоунд_ре порт_цард/ЦХЕМБЛ141/) је коришћена за испитивање биолошких активности мета или једињења. Протеини за које је потврђено да потичу од Хомо сапиенса идентификовани су као потенцијалне мете 3ТЦ.

2.11|Анализа интеракције циљног протеина и изградња мреже

The target proteins screened were integrated for the protein-protein interaction (PPI) analysis using String 9.1 (http://string-db.org/) with the protein network interaction diagrams generated. Protein interactions with a confidence score >0.4 су изабрани у дизајнираној поставци након елиминисања дупликата.

Да би се свеобухватно истражили молекуларни механизми 3ТЦ, ППИ мреже су конструисане коришћењем софтвера Цитосцапе верзије 3.6.0.(хттп://ввв.цитосцапе.орг/). Анализа степена чворова је извршена помоћу Центисцапе-а 2.2 (хттп:// аппс.цитосцапе.орг/аппс/центисцапе) да би се скринирали гени чворишта у мрежама са вредношћу централности блискости, централне вредности између вредности и вредности централности степена постављене на {{6 }}.2, 450 и 50, респективно.

2.12|Обогаћивање и скрининг сигналних путева за 3ТЦ

Анализа обогаћивања генске онтологије (ГО) са биолошким процесима, ћелијским компонентама и молекуларним функцијама потенцијалних мета спроведена је за означавање биолошких функција на основу ДАВИД базе података о биоинформатици (хттпс://давид.нцифцрф.гов/гене2гене.јсп). Метаболички путеви КЕГГ-а су означени на основу Кјото енциклопедије гена и генома (КЕГГ) база података користећи онлајн КЕГГ сервер за аутоматске анотације (хттп://ввв.геноме.јп/кегг/)

2.13|Везивање 3ТЦ за предвиђене циљеве

СДФ структурне датотеке једињења 3ТЦ су добијене на веб локацији Пубцхем (хттпс://пубцхем.нцби.нлм.них.гов/). СДФ датотека је трансформисана у ПДБ датотеку помоћу ОпенБабел2.3.2 софтвера, а рецепторски протеини АДРБ2 (ПДБИД:3КЈ6), АКТ1 (ПДБИД:4ЕКЛ) и ЕГФР (ПДБИД:6С9Ц) су добијени из базе података Протеин Дата Банк (ввв.ввпдб). .орг). Софтвер ПИМОЛ2.3.4 је коришћен за уклањање воде и лиганада из рецепторских протеина. Студија пристајања је изведена коришћењем АутоДоцк Вина (1.1.2), који је софтвер за молекуларно спајање отвореног кода који је развио Сцриппс. Софтвер Тоолс је коришћен за модификацију четири рецепторска протеина, а команда Грид Бок у оквиру програма Грид је коришћена да се отвори алат Грид Оптион за анализу сваког протеина рецептора. Размак између решетки је постављен на 1, а центар џепа је постављен као центар места везивања.

2.14|Ћелијска култура и третман

Неуронске ћелијске линије хипокампуса миша ХТ22 су купљене од компаније Схангхаи Целл Биотецхнологи Цомпани. ХТ22 ћелије су култивисане у ДМЕМ са додатком 10 процената феталног говеђег серума (ФБС). Ћелије су засејане у 6-плоче са бунарима 1 дан пре експерименталног третмана. Старење ћелија је индуковано формалдехидом (ФА), купљеним од Сигма-Алдрицх, као што је претходно описано.24 ХТ22 ћелије су подељене у три групе, укључујући ФА групу третирану са 30 µмол/Л ФА током 24 сата, ФА/3ТЦ група третирана са 30 µмол/Л ФА и 50 µмол/Л 3ТЦ, а контролна група узгајана без ФА или 3ТЦ.

2.15|Имунофлуоресценција и микроскопија

Медијум је уклоњен, а ћелије су фиксиране коришћењем 2 процентног раствора параформалдехида током 1 х на собној температури. Експеримент имунофлуоресценције је спроведен како је претходно описано.25 Антитела коришћена у овој студији укључивала су антитело ЛИНЕ-1 ОРФ1п (1:1000; Сигма-Алдрицх) са Алека Флуор 594 ​​секундарним антителом (1:1000; Инвитроген) . Ћелије су инкубиране са ДАПИ (разблажење 1:500; Тхермо Фисхер Сциентифиц) током 1 мин да би се обележила језгра. Након што је додат агенс за монтажу против флуоресценције, ћелије су посматране помоћу конфокалног микроскопа (Никон). 2.16|Вестерн блот анализа

Експресије ЕГФР, п-АКТ1 (активан Акт1: фосфорилисан на С473) и АДРБ2 мерене су Вестерн блот анализом. Укупни протеин је сакупљен из ћелија након различитих третмана. Вестерн блот је изведен као што је претходно описано.26 Антитела коришћена у овој студији укључивала су анти-ЕГФР антитело (1:500; Сигма-Алдрицх), анти-пАКТ1 антитело (1:1000; Сигма-Алдрицх) и анти-АДРБ2 антитело (1:200; Сигма-Алдрицх) са секундарним антителом против зеца (1:1,000; Инвитроген). Након прања, мрље су развијене помоћу ЕЦЛ Вестерн блоттинг система за детекцију (Амерсхам, Аилесбури, УК).

2.17|Анализа података и статистика

Сваки експеримент је поновљен најмање три пута и сматран је валидним, а испитивања су показала сличне резултате. Резултати су представљени као средња вредност ± стандардна девијација (СД). Значајна разлика је одређена или Студентовим т-тестом са п < 0.05.

Тражи више:

Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com вхатсапп: плус 86 15292862950