Ко-имунотерапија заснована на липозомима са ТЛР агонистом и ЦД47-СИРП блокадом контролне тачке за ефикасан третман рака дебелог црева

Апстрактан:

Антитуморски имунитет је суштинска компонента терапије рака и првенствено је посредован урођеним имунолошким одговором, који игра кључну улогу у покретању и обликовању адаптивног имунолошког одговора. Нови докази су идентификовали урођене имунолошке контролне тачке и рецепторе за препознавање образаца, као што су ЦД47 и Толл-лике рецептор 7 (ТЛР7), као обећавајуће терапеутске мете за лечење рака. На основу фузионог протеина Фц-ЦВ1, који се састоји од СИРП варијанте високог афинитета (ЦВ1), и Фц фрагмента хуманог ИгГ1 антитела, искористили смо препарат који спаја Фц-ЦВ1 са липозомима напуњеним имиквимодом (ТЛР7 агонист) ( ЦИЛП) да активно циљају ЦТ26. ВТ сингенични модели тумора дебелог црева. Ин витро студије су откриле да ЦИЛП показују супериорна својства продуженог ослобађања и ефикасност узимања ћелија у поређењу са слободним имиквимодом. Ин виво, тестови су доказали да ЦИЛП-ови показују ефикаснију акумулацију у туморима и значајнији ефекат супресије тумора него контролне групе. Овај имунотерапијски препарат је имао предности ниске дозе и ниске токсичности. Ови резултати су показали да комбинација терапије блокаде имунске контролне тачке (ИЦБ) и агониста урођеног имунитета, као што су препарати липозома Фц-ЦВ1 и имиквимодом који се користе у овој студији, може представљати високо ефикасну стратегију за терапију тумора.

Предности цистанцхе тубулоса-Антитумор

Кључне речи:

имиквимод; липозом; Фц-ЦВ1; имунотерапија; канцер дебелог црева

1. Представљање

Глобална учесталост рака наставља да расте из године у годину, што представља озбиљну претњу по здравље светске популације и представља велики терет за здравствене системе. Према извештају Светске здравствене организације, у 2020. години, 19,29 милиона нових случајева рака и 9,96 милиона смртних случајева од рака догодило се широм света [1]. Међутим, уз континуирани напредак у клиничкој дијагнози, хирургији, радиотерапији и хемотерапији, укупно преживљавање и квалитет живота пацијената оболелих од рака значајно су се побољшали. Значајно је да имунотерапија, која је настала са Цолеи вакцином 1890-их [2], претходила је и радиотерапији и хемотерапији и остварила је значајан напредак у последњој деценији, од користи пацијентима са раком.

Имунотерапија тумора је препозната по својој одличној биокомпатибилности и високој специфичности и способна је да изазове имуне одговоре да елиминише туморске ћелије [3–5]. Две главне стратегије за имунотерапију тумора су јачање имунитета и нормализација имунитета [6]. Обрасци побољшања имунитета се углавном састоје од терапије цитокином, вакцина за лечење тумора и моноклонских антитела. Толл-лике рецептори (ТЛР) се сматрају потенцијалним метама за имунотерапију рака због њихове улоге у активацији урођеног имуног система. ТЛР агонисти су развијени као имуни адјуванс, а различити ТЛР агонисти су подвргнути клиничким испитивањима [7]. Монофосфорил липид А и агонисти имиквимода, ТЛР4 и ТЛР7 добили су одобрење од Управе за храну и лекове за клиничку примену [7–9]. Имиквимод, агонист ТЛР7 [9], активира имуне одговоре и појачава антитуморско деловање активирањем ТЛР7 [10,11]. Стратегију нормализације имунитета представљају лекови за блокаду имунске контролне тачке (ИЦБ) који регулишу дефектни адаптивни имуни одговор тумора. Од првог инхибитора контролне тачке, ипилимумаб је одобрен за клиничку примену у САД 2011. године, инхибитори имунолошке контролне тачке, као што су ПД1/ПДЛ1 инхибитори, направили су пробој у имунотерапији рака [12–14]. Осим прилагођених имунолошких контролних тачака сличних ПД1/ПДЛ1, неке урођене имунолошке контролне тачке, као што је СИРП -ЦД47, такође су привукле велику пажњу и постале области од значајног интересовања у развоју лекова за антитела [15–17].

Контролна тачка СИРП -ЦД47 је први пут идентификована 1999. године [18,19]. СИРП је ЦД47 рецептор експримиран у неуронима централног нервног система [20] и мијелоидним ћелијама, укључујући моноците, макрофаге, гранулоците и дендритске ћелије. ЦД47 је „молекул који се самообележава“ експримиран на скоро свим нормалним ћелијама и прекомерно експримиран на већини туморских ћелија [21]. На површини туморских ћелија, ЦД47 се везује за СИРП, инхибирајући фагоцитозу посредовану макрофагом, што је важно средство за бекство туморског имуног система [22]. Показало се да фагоцитоза макрофага унутар туморског микроокружења може бити појачана када је везивање ЦД47 и СИРП блокирано [20–25]. Због тога су развијени инхибитори контролних тачака имунитета који блокирају пут ЦД47/СИРП и примењени у терапији рака [26].

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

Кликните овде да видите производе Цистанцхе Енханце Иммунити

【Затражите више】 Е-пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Вхатс Апп: 0086 18599088692 / Вецхат: 18599088692

У овој студији користили смо комбинацију имиквимода и фузионог протеина (Фц-ЦВ1) за лечење рака дебелог црева. ЦВ1 је модификовани хумани рекомбинантни СИРП протеин који има 50,000-пута већи афинитет за ЦД47 од оригиналног протеина [27]. Фц-ЦВ1 је конструисан коришћењем технологије "Кнобс-инто-холес", засноване на ЦВ1 мономеру и Фц фрагменту хуманог ИгГ1. Да бисмо превазишли ограничења лоше терапеутске ефикасности и системске токсичности повезане са имиквимодом [28,29], припремили смо нанолипозоме методом ињекције етанола. Нанолипосоми имају карактеристике ниске токсичности у испоруци лекова [30,31]. Након тога, имиквимод је инкапсулиран у липозоме који су површински коњуговали Фц-ЦВ1. Коначно, овај нови нано-препарат може активно да испоручује агонисте ТЛР7 у туморска ткива и има двоструке функције као ИЦБ лек и ТЛР агонист. Коришћен је за лечење ЦД47+ ЦТ26.ВТ модела сингеног тумора дебелог црева [32].

2. Резултати и дискусија

2.1. Карактеризација ЛП (празни липозоми), ИЛП (не-ЦД47-циљани имиквимод-инкапсулирани липозоми), ЦЛП-ови (ЦД47 циљани липозоми) и ЦИЛП (упарени Фц-ЦВ1 са имиквимодом (ТЛР7 агонист)-напуњени)

ЦИЛП-ови су успешно припремљени ињекцијом етанола и методом градијента амонијум сулфата. Слика 1А приказује процес синтезе ЦИЛП-ова. ТЕМ анализа је показала да су ЦИЛП-ови сферни и униформног облика (слика 1Б). Штавише, ДЛС резултат је открио да је величина честица четири липосома била унимодална дистрибуција (слика 1Ц). Брзина везивања (БР) је верификована помоћу СДС-ПАГЕ, која је приказана на слици 1Д, Е. Слика 1Д приказује молекулску тежину Фц-ЦВ1 и релативну светлост траке дијализованих и претходно дијализованих ЦИЛП-ова. БР је израчунат на 67,13 ± 37,10% помоћу скенирајуће дензитометрије електрофоретских трака на слици Ј (Слика 1Е), пружајући могућност за ЦД47-циљање туморских ћелија.

Слика 1. (А) Шематски приказ синтезе ЦИЛП-ова. (Б) ТЕМ слика ЦИЛП-а

ХПЛЦ је коришћен за детекцију ефикасности инкапсулације (ЕЕ) имиквимода (додатна слика С1). Као што је приказано на додатној слици С1А, слободни имиквимод је показао значајан појединачни пик, док ЦЛП нису показали никакав врх под истим условима теста (додатна слика С1Б). Стога је могуће открити ЦИЛП-ове директно под условима тестирања. Као што се очекивало, вредности детекције ЦИЛП-а пре и после дијализе су сматране као укупан садржај лека и садржај лека у липосомима, респективно (додатна слика С1Ц, Д). Израчунато је да је ЕЕ имиквимода 85,44 ± 4,11%. У поређењу са пријављеним пасивним системом за испоруку лекова [33–35], ова студија је постигла већу ефикасност инкапсулације и погоднији процес припреме.

ДЛС је показао да су пречници ЛП-ова били 111.567 ± 0.655 нм, док су ЦЛП, ИЛП-ови и ЦИЛП-ови показали нешто већу величину од 117.467 ± 0.34{{10} } нм, 120.233 ± 0.776 нм и 13{{30}}.033 ± 0.974 нм, респективно (Табела 1). Промене у величини ових липосома могу се приписати модификацији Фц-ЦВ1 и имиквимода. ПДИ је био близу 0,1 (Табела 1), што указује да су ова средства за испоруку лекова била веома хомогена у својој дистрибуцији. Поред тога, измерене су вредности зета-потенцијала ЛП, ЦЛП, ИЛП и ЦИЛП на -2,231 ± 0,167 мВ, -2,492 ± 0,033 мВ, -2,383 ± 0,070 мВ и -2,075 ± 0,10 мВ, односно -2,075 ± 0 мВ. , што сугерише да су површински коњуговани Фц-ЦВ1 и инкапсулирани имиквимод имали мали утицај на наелектрисање липозома.

Табела 1. Пречници, зета-потенцијал, ПДИ и ЕЕ ЛП, ЦЛП, ИЛП и ЦИЛП, респективно.

2.2. Ефикасност преузимања ћелија ин витро

Ефикасност апсорпције ћелија ЦИЛП-а је процењена кроз интензитет флуоресценције Ци5 који су преузеле ЦТ26.ВТ ћелије коришћењем система за снимање високог садржаја. Као што је приказано на слици 2, у поређењу са слободним Ци5 и ИЛП-Ци5 групама, ЦИЛПс-Ци5 групе су показале јачи капацитет узимања ћелија након 30 минута инкубације. Ови резултати су закључили да је Фц-ЦВ1 побољшао способност интрацелуларне испоруке липозома напуњених имиквимодом због специфичног афинитета према Фц-ЦВ1 рецептору, што је довело до снажнијег антитуморског ефекта.

Слика 2. Слике ЦТ26.ВТ ћелија након инкубације са слободним Ци5, ИЛПс-Ци5 и ЦИЛПс-Ци5 (црвено) током 0.5 х, и бојење са ДАПИ (плаво). Скала трака: 50 µм. (н {{10}}). * п < 0,05; **** п < 0,0001

2.3. Криве ослобађања липозома

Криве ослобађања лека слободног имиквимода, ИЛП-а и ЦИЛП-а мерене су у симулираном ин виво окружењу. Слика 3 показује да је слободни имиквимод у потпуности ослобођен након 1 х, док је стопа ослобађања (РР) имиквимода који је инкапсулиран са ИЛП и ЦИЛП била само 54,75 ± 4.08% и 39,70 ± 0,05% у 12 х , редом. Штавише, споро ослобађање имиквимода у ИЛП-овима и ЦИЛП-овима могло би се затворити контролисаним својством липозома да ослобађа лек. РР имиквимода у ИЛП-овима и ЦИЛП-овима није показао значајну разлику у 96 х, што указује да је "пост инсерција" показала занемарљив утицај на стабилност мембране липозома.

слика 3. Криве ослобађања имиквимода слободног имиквимода, ИЛП-а и ЦИЛП-а у ПБС-у на 37 ◦Ц. Подаци су представљени као средње вредности ± стандардна девијација (н=3). * п < 0.05, ** п < 0,01

2.4. Цитотокицити Студи

Да би се проучавала цитотоксичност ЦИЛП ин витро, ЦЦК{{0}} тест је изведен на ЦТ26.ВТ ћелијама. Као што је приказано на слици 4, ЦИЛП при ниским концентрацијама (0,1–1 µг/мЛ) нису испољили цитотоксичност, што је у складу са безбедношћу терапије имунизацијом. Вијабилност ћелија је благо смањена након третмана имиквимодом од 5 µг/мЛ, вероватно због РОС-а и имуногене смрти ћелија посредоване ендоплазматским ретикулумом изазване имиквимодом [36]. Штавише, ЦИЛП доводе до значајног смањења виталности ћелија у поређењу са контролним групама, што се приписује синергистичком ефекту имиквимода и Фц-ЦВ1.

Слика 4. Вијабилност ћелија третираних са Фц-ЦВ1, имиквимодом, ЦЛПс, ИЛПс и ЦИЛПс током 24 х. Концентрације Фц-ЦВ1 и имиквимода су биле 0–10 µг/мЛ. * п < 0.05, ** п < 0.01, нс=нема значајних разлика

2.5. Студија о биодистрибуцији

Расподела и акумулација различитих формулација у туморима и главним органима директно утиче на терапеутски ефекат. Након интравенске примене, сигнали флуоресценције су праћени коришћењем скоро инфрацрвеног система вивисекције да би се проценила дистрибуција и акумулација различитих формулација у туморима и главним органима након 24 х. Као што је приказано на слици 5, укупни интензитет флуоресценције ИЛПс-Ци5 и ЦИЛПс-Ци5 био је већи од слободног Ци5, што указује да липозоми поседују својство дугог циркулације ин виво. Поред тога, интензитет флуоресценције групе третмана ЦИЛПс-Ци5 био је највећи у туморском ткиву, што се може приписати ефекту циљања на тумор Фц-ЦВ1 лиганда, чиме се појачава антитуморски ефекат. Запањујуће је да је интензитет флуоресценције јетре и слезине био јачи од других органа, што је вероватно последица фагоцитозе липозома од стране ретикулоендотелног система (РЕС) у јетри и бубрезима [37].

Слика 5. Расподела Ци5-флуоресценције у туморима и главним органима 24 х након интравенске примене. Подаци су приказани као средње вредности ± стандардна девијација (н=3). **** п < 0.0001

2.6. Ин виво студија инхибиције тумора

Терапијски распоред (Слика 6А) и ефекти различитих препарата приказани су на Слици 6. У поређењу са групама које су примале ПБС и ЛП, друге групе за лечење су показале одређене тумор-супресорске ефекте. Приметно је да је запремина тумора била минимална након третмана са ЦИЛП, што сугерише да ЦИЛП поседују одличан ефекат супресора тумора (Слика 6Б).

Слика 6. (А) Шематска илустрација третмана против рака дебелог црева на моделу тумора ЦТ26.ВТ. (Б) Криве раста запремине тумора током периода лечења. (Ц) Релативне фотографије тумора и (Д) тежина тумора сакупљене из различитих група третмана 17. дана. (Е) Однос релативне телесне тежине телесне тежине у поређењу са 0 даном. Подаци су представљени као средња вредност ± стандардна девијација (н=5). * п < 0.05, ** п < 0.01, *** п < 0,001.

На крају експеримента, мишеви су жртвовани, а њихови тумори су изрезани, фотографисани и измерени да би се утврдила терапијска ефикасност различитих препарата. Као што је приказано на слици 6Ц, Д, група за лечење ЦИЛП-а имала је најмање и најлакше туморе у поређењу са другим групама, што показује да ЦИЛП-ови поседују највеће ефекте супресора тумора. Табела 2 показује да је стопа инхибиције раста тумора ЦИЛП-а израчуната на 84,35%. Поред тога, стопа супресије тумора од 84,35% била је значајно већа од оне у ЦЛП и ИЛП групама, а то значи да постоји синергистички ефекат блокирања осе „немој ме једи“ и активације имунолошког одговора. . У поређењу са еквивалентним препаратом ин витро (2,5–5 µг/мЛ), виша стопа инхибиције била је уско повезана са стопом имуног одговора активираног формулацијом и блокирала је имуни механизам за бекство ин виво, који није био доступан ин витро.

Табела 2. Подаци о тежини тумора и инхибицији раста тумора (ТГИ) различитих група лечења.

2.7. ЦИЛП-ови су повећали инфилтрацију Т-ћелија и излучивање ИФН-а

Да би се истражио имуни ћелијски миље тумора, имунолошка ћелија индукована ЦИЛП-овима је анализирана имунохистохемијски на крају антитуморског теста. ЦД4+ и ЦД8+ Т ћелије су повећане у секцијама тумора ЦИЛП група (слика 7). Заједничка испорука Фц-ЦВ1 и терапије имиквимодом је резултирала значајном инфилтрацијом ЦД4+ и ЦД8+ Т ћелија. Поред тога, дошло је до значајног лучења ИФН-а у туморима који су били подвргнути ЦИЛП третману, што је било зато што су ЦИЛП-ови покренули Толл-лике рецептор 7 и активирали имуни одговор.

Слика 7. Имунохистохемија туморских ткива миша; позитивне ћелије су обојене браон. Скала бар, 50 µм (н=5).

2.8. Процена биолошке безбедности ЦИЛП-ова

Биобезбедност терапије посредоване ЦИЛП-ом такође је била важан индекс у смислу приступа терапијској евалуацији. Током студије инхибиције тумора ин виво, ЦИЛП-ови нису изазвали значајан губитак тежине у периоду лечења (Слика 6Д). Сви биохемијски параметри јетре и бубрега били су у нормалном опсегу према стандардном референтном опсегу мишева (Табела 3), а хистологија органа није показала значајне промене, што указује да су ЦИЛП-ови поседовали одличну биосигурност (Слика 8). Ови налази су кључни у процени потенцијала ЦИЛП-а као безбедног и ефикасног имунотерапеутског средства за лечење рака.

Табела 3. Биохемијски параметри јетре и бубрега

Слика 8. Х&Е (хематоксилин и еозин) бојење главних органа. Скала бар, 50 µм (н=3)

3. Материјали и методе

3.1. Материјали

Имиквимод је купљен од МедЦхем Екпресс-а (Шангај, Кина). Фц-ЦВ1 је обезбедила Државна кључна лабораторија за лекове против антитела и циљану терапију. Холестерол, хидрогенизовани лецитин (ХСПЦ), ДСПЕ-ПЕГ2000, ДСПЕ-ПЕГ2000-НХС и ДСПЕ-ПЕГЦи5 су купљени од Кси'ан Руики Биологицал Тецхнологи Цо., Лтд. (Си'ан, Кина). 40,6-диамидино-2-фенилиндола (ДАПИ) добијено је од Кеиген Биотецх-а (Нањинг, Кина). Амонијум сулфат је добијен од Синопхарма (Шангај, Кина). Метанол (хроматографски квалитет) и ацетонитрил (хроматографски квалитет) набављени су од компаније Аладдин Реагент (Шангај, Кина). Сви остали реагенси су домаћег аналитичког квалитета. Ћелијска линија рака дебелог црева миша ЦТ26. ВТ је обезбедила Банка ћелија Кинеске академије наука. Ћелије су узгајане у ћелијском инкубатору у медијуму РПМИ 1640 који садржи 10% ФБС (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Њујорк, Њујорк, САД) са 5% ЦО2 и 95% ваздуха. Женке БАЛБ/ц мишева од 4-6 недеља испоручене су од Пенгиуе Лаборатори Анимал Бреединг Цо., Лтд. (Јинан, Кина).

3.2. Припрема празних липозома

Прво, 13,455 мг ХСПЦ, 4,3595 мг ДСПЕ-ПЕГ2000 и 4,7095 мг холестерола су прецизно измерени и растворени у 0,1 мЛ етанола (ХСПЦ: ДСПЕ-ПЕГ2000:цхолестерол.5:12} моларни однос 5,05:39,3). Друго, раствор етанола је брзо убризган у претходно загрејани раствор амонијум сулфата (250 мМ, 1 мЛ, 65 ◦Ц) преко шприца и затим инкубиран 30 минута на 65 ◦Ц уз магнетно мешање. Након тога, припремљени раствор је сукцесивно екструдиран кроз поликарбонатне мембране (Аванти, Алабастер, АЛ, УСА); величина је била 200 нм, 100 нм и 50 нм, респективно. Коначно, добијени раствор су били празни липозоми (ЛП) са концентрацијом липида од 22,5 мг/мЛ.

3.3. Припрема ЦД47 циљаних имиквимод-инкапсулираних липозома

Прво, ДСПЕ-ПЕГ2000-НХС је растворен у ддХ2О (60 ◦Ц), а затим помешан са Фц-ЦВ1 и инкубиран у столу за мућкање на собној температури 5 х (Фц-ЦВ1:ДСПЕПЕГ2000- НХС=12:1 моларни однос). Механизам хемијске реакције везе између Фц-ЦВ1 и ДСПЕ-ПЕГ2000-НХС укључивао је НХС естар који реагује са примарним амином на Фц-ЦВ1 и формирао је стони коњугат аминске везе. Припремљени раствор је пропорционално помешан са ЛП и инкубиран на 60 ◦Ц током 1 х да би се убацио Фц-ЦВ1 у липозоме, што је названо "пост инсертион" [38]. Пропорције смеше су биле да је 2,25 мг Фц-ЦВ1 модификовано на 22,5 мг липозома. Затим су добијени ЦД47 циљани липозоми (ЦЛП).

Након тога, ЦЛП су стављени у врећу за дијализу (300 кДа) и дијализовани против ХЕПЕС (10 мМ, пХ=7.4) током 1 х да би се уклонио амонијум сулфат и резидуални Фц-ЦВ1 у спољној воденој фази. Дијализовани ЦЛП су инкубирани са раствором имиквимода (5 мг/мЛ) у односу од 1 мг до 7 µмол укупних фосфолипида на собној температури током 24 х, а затим дијализовани против ПБС (300 кДа) три пута да би се елиминисао некапсулирани имиквимод, што се односило на техника градијента амонијум сулфата [39]. Затим су добијени ЦИЛП-ови. Поред тога, припремљени су не-ЦД{14}}циљани имиквимод-инкапсулирани липозоми (ИЛП). ЦЛП и ИЛП су сматрани као контрола за ЦИЛП.

3.4. Карактеризација

Морфологија ових липосома је фотографисана трансмисионим електронским микроскопом (ТЕМ, Јоел, Токио, Јапан). Величина, зета-потенцијал и индекс полимерне дисперзности (ПДИ) ових липосома су одређени динамичким расејањем светлости (ДЛС) и електрофоретским расејањем светлости (ЕЛС) коришћењем Малверновог Зета сизера ЗСЕ (Малверн, УК). Брзина везивања (БР) Фц-ЦВ1 уметнутог у липозоме мерена је електрофорезом 15% натријум лаурил сулфат-полиакриламидног гела (СДС-ПАГЕ) и софтвером Имаге Ј (Бетхесда, МД, САД). Ефикасност енкапсулације (ЕЕ) имиквимода је откривена течном хроматографијом високих перформанси (ХПЛЦ, Тхермо Фисхер Сциентифиц, Њујорк, Њујорк, САД).

Предности цистанцхе тубулоса-Антитумор

3.5. Ин витро студија преузимања ћелија

Ин витро ћелијска апсорпција ових липозома одређена је кумулативним интензитетом флуоресценције Ци5 у ЦТ26. ВТ ћелије. ДСПЕ-ПЕГ-Ци5 је инкубиран са ЦИЛП-овима и ИЛП-овима (ДСПЕ-ПЕГ-Ци5: ЦИЛП-ови или ИЛП-ови=1: 5 масени однос) на 60 ◦Ц током 1 х, а затим флуоресцентним липозомима добијени су називи ЦИЛПс-Ци5 и ИЛПс-Ци5. ЦТ26.ВТ ћелије су засејане у 96-плоче са бунарима и насумично подељене у три групе (1 × 104 ћелије/бунарићу, н=3). Након што је конфлуентност ћелија достигла 50–70%, свака група је инкубирана са слободним Ци5, ИЛПс-Ци5 и ЦИЛПс-Ци5, респективно, 30 минута на 37 ◦Ц, при чему су коначне концентрације Ци5 биле 1 µг/мЛ у 0,1 мЛ РПМИ 1640 медијум. Након тога, ћелије су имобилисане 4% параформалдехидом током 15 минута након што су два пута испране ПБС-ом, а затим обојене са 10 µЛ ДАПИ (1 µг/µЛ) током 10 минута након што су два пута испране ПБС-ом. Коначно, унос сваке групе ћелија је забележен помоћу система за снимање високог садржаја (Молецулар Девицес, Суннивале, ЦА, УСА) након два пута испирања са ПБС.

3.6. Студија ослобађања Имиквимода

Криве ослобађања различитих липозома напуњених лековима су изведене методом дијализе (300 кДа), а резултати су упоређени са слободним раствором имиквимода. Укратко, 0.6 мЛ ИЛП, ЦИЛП и раствор имиквимода одвојено су упаковани у вреће за дијализу и затим стављени у 500 мЛ раствора ПБС (пХ=7.4, 37 ◦Ц). Једнаке количине узорака екстраховане су из кеса у унапред одређеним временским интервалима (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72 и 96 х), а брзина ослобађања (РР) имиквимода је израчунато коришћењем следеће једначине:

где су Сунд и Сд представљали површину ХПЛЦ врха имиквимода у претходно дијализованим и дијализованим препаратима у различито време, респективно (н=3).

3.7. Цитотоксичност ЦИЛП-а

ЦТ{{0}}.ВТ ћелије су засејане у 96-плочу са бунарчићима (1 × 104/бунарићу, н=3) и култивисане у 100 µЛ РПМИ 1640 медијума до конфлуенције близу 70%. Да би се одредила цитотоксичност ЦИЛП-а, медијум РПМИ 1640 је уклоњен из сваког базена и замењен комплексним раствором ЦИЛП-а и РПМИ 1640 медијума, са концентрацијама Фц-ЦВ1 и имиквимода у распону од 0 до 10 µг/мЛ. Ћелије су инкубиране са комплексним раствором 24 сата. Поред тога, ћелије које су третиране Фц-ЦВ1, ЦЛП, раствором имиквимода и ИЛП у сличној концентрацији сматране су контролним групама. Преживеле ћелије су детектоване ЦЦК-8 тестом после 24 х, а одрживост нетретираних ћелија је сматрана 100%.

3.8. Студија о биодистрибуцији

Девет женки БАЛБ/ц мишева је убризгано субкутано са ЦТ26. ВТ ћелије (5 × 105) у десном боку и ови мишеви са тумором су насумично подељени у три групе (н=3). Запремине тумора су мерене помоћу калибара и израчунате су по следећој формули:

Када је запремина тумора достигла 100 мм3, слободни Ци5, ИЛП-Ци5 и ЦИЛПс-Ци5 су убризгани интравенозно у дози Ци5 од 0,4 мг/кг. Двадесет четири сата након интравенске ињекције, извађени су тумор, срце, јетра, слезина, плућа и бубрег. Сигнали флуоресценције тумора и главних органа детектовани су ИВИС оптичким системом за снимање (ИВИС Лумина ЛТ ИИИ, ПеркинЕлмер, Валтхам, МА, САД).

3.9. Ин виво студија инхибиције тумора

Тридесет пет женки БАЛБ/ц мишева је насумично подељено у седам група (н=5), и 5 × 105 ЦТ26. ВТ ћелије су убризгане субкутано у десни бок сваког миша. Када је величина тумора миша била око 100 мм3, започет је третман. ПБС, ЛП, имиквимод, Фц-ЦВ1, ИЛП, ЦЛП и ЦИЛП су интравенозно убризгани 0, 4, 8 и 12 дана. Доза имиквимода је била 2,5 мг/кг у првој и другој ињекцији и 5 мг/кг у трећој и четвртој ињекцији. У свим ињекцијама, доза Фц-ЦВ1 је била 5 мг/кг. При овој дози, концентрација лека у телу била је 2,5–5 µг/мЛ, што је испољило цитотоксичност на ћелије у ин витро експерименту. Пречник тумора и телесна тежина су мерени сваки дан током лечења. 17. дана мишевима су извађени тумори и измерена је њихова тежина. Инхибиција раста тумора (ТГИ) израчуната је према следећој формули:

3.10. Имунохистоцхемистри

Имунохистохемијско бојење ЦД4, ЦД8 и ИФН обављено је у туморским ткивима према стандардном протоколу. Након депарафинизације и рехидратације парафинског пресека пресека туморског ткива, 3% БСА је додат у круг да покрије ткиво, а затим је затворен 30 минута на собној температури. Секције су обојене ЦД4, ЦД8 и ИФН антителима (Сервицебио, Вухан, Кина) преко ноћи на 4 ◦Ц, а затим инкубиране са секундарним антителом (ХРП-обележеним, Сервицебио, Вухан, Кина) на собној температури 50 мин. након два прања са ПБС. На крају, пресеци су визуелизовани под микроскопом (Никон, Е100, Токио, Јапан) након реакције са ДАБ хромогеним агенсом.

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

3.11. Процена биолошке безбедности ЦИЛП-ова

На крају студије инхибиције тумора, сакупљени су сви тумори и измерена је тежина ових тумора. Биохемијски параметри, укључујући аланин трансаминазу (АЛТ), аспартат трансаминазу (АСТ), креатинин (ЦРЕА) и уреу (УРЕА), откривени су у крви мишева. Свежа туморска ткива и главни органи су фиксирани са 4% параформалдехида и уграђени у парафин помоћу машине за уградњу (Вухан Јуњие Елецтроницс, ЈБ-П5, Вухан, Кина). Резови ткива дебљине 5 µм су исечени кроз микротом (Леица Инструмент, РМ2016, Шангај, Кина), а затим обојени хематоксилином и еозином (Х&Е) према протоколу. Након тога, резови за бојење су посматрани под микроскопом (Никон, Е100, Токио, Јапан).

3.12. Статистичка анализа

Сви подаци су изражени као средња вредност ± СД. Ниво значајности између група је тестиран једносмерном АНОВА коришћењем Грапхпад Присм 8.0.2. п < 0.05 је дефинисана као значајна разлика.

3.13. Анимал Етхицс

Све процедуре и препоруке у вези са животињама одобрио је Специјални комитет за научноистраживачку етику Универзитета Лиаоцхенг у складу са националним смерницама за негу и употребу лабораторијских животиња (код одобрења: 2022111010; датум одобрења: 1. новембар 2022.).

цистанцхе биљке које повећавају имуни систем

4. Закључци

Укратко, имиквимод-инкапсулирани ЦД47-циљани липозоми су успешно развијени, а ин витро резултати су показали да ЦИЛП-ови поседују боље продужено ослобађање и специфичан ефекат циљања. Резултати ин виво су показали да се препарат може ефикасно унети у туморске ћелије и да је показао одличну ефикасност лечења тумора и биосигурност због двоструке функције имунолошког одговора и блокаде урођене имунолошке контролне тачке. Стога се чини да липозоми инкапсулирани имиквимодом повезани са Фц-ЦВ1 обећавају нови наномедицину за побољшање лечења тумора експресије ЦД47. Имунотерапија заснована на урођеном имунитету може послужити као општа стратегија против раста тумора за синергијске комбинације са ИЦБ у будућности.

Референце

1. Сунг, Х.; Ферлаи, Ј.; Сиегел, РЛ; Лаверсанне, М.; Соерјоматарам, И.; Јемал, А.; Браи, Ф. Глобал Цанцер Статистицс 2020: Глобоцан процене инциденције и морталитета широм света за 36 карцинома у 185 земаља. ЦА Цанцер Ј. Цлин. 2021, 71, 209–249. [ЦроссРеф] [ПубМед]

2. Царлсон, РД; Флицкингер, ЈЦ, Јр.; Сноок, АЕ Талкин' Токинс: од Цолеиса до модерне имунотерапије против рака. Токинс 2020, 12, 241. [ЦроссРеф] [ПубМед]

3. Барбари, Ц.; Фонтаине, Т.; Парајули, П.; Ламицххане, Н.; Јакубски, С.; Ламицххане, П.; Десхмукх, РР Имунотерапија и комбиноване стратегије за имуно-онкологију. Инт. Ј. Мол. Сци. 2020, 21, 5009. [ЦроссРеф]

4. Хегде, ПС; Цхен, ДС Топ 10 изазова у имунотерапији рака. Имунитет 2020, 52, 17–35. [ЦроссРеф]

5. Јаин, КК Персонализована имуно-онкологија. Мед. Принц. Практ. 2021, 30, 1–16. [ЦроссРеф]

6. Санмамед, МФ; Цхен, Л. Промена парадигме у имунотерапији рака: од побољшања до нормализације. Ћелија 2018, 175, 313–326. [ЦроссРеф]

7. Хусеин, ВМ; Лиу, ТИ; Скварцзински, М.; Тотх, И. Толл-Лике Рецептор Агонистс: А Патент Ревиев (2011–2013). Екперт Опин. Тхер. Пат. 2014, 24, 453–470. [ЦроссРеф]

8. Цхи, Х.; Ли, Ц.; Зхао, ФС; Зханг, Л.; Нг, ТБ; Јин, Г.; Сха, О. Анти-туморска активност агониста рецептора 7 сличних наплати. Фронт. Пхармацол. 2017, 8, 304. [ЦроссРеф] [ПубМед]

9. Ванг, И.; Зханг, С.; Ли, Х.; Ванг, Х.; Зханг, Т.; Хутцхинсон, МР; Иин, Х.; Ванг, Кс. Смалл-Молецуле Модулаторс оф Толл-Лике Рецепторс. Ацц. Цхем. Рес. 2020, 53, 1046–1055. [ЦроссРеф] [ПубМед]

10. Ле Мерциер, И.; Поујол, Д.; Санлавилле, А.; Сисирак, В.; Гоберт, М.; Дуранд, И.; Дубоис, Б.; Треиллеук, И.; Марвел, Ј.; Влах, Ј.; ет ал. Промоција тумора интратуморалним плазмацитоидним дендритским ћелијама је поништена третманом Тлр7 лигандом. Цанцер Рес. 2013, 73, 4629–4640. [ЦроссРеф]

11. Ма, Ф.; Зханг, Ј.; Зханг, Ј.; Зханг, Ц. Агонисти Тлр7 Имиквимод и Гардиквимод побољшавају имунотерапију засновану на ДЦ за меланом код мишева. Ћелија. Мол. Иммунол. 2010, 7, 381–388. [ЦроссРеф]

12. Билан, С.; Каидар-Персон, О.; Гил, З. Третман након прогресије у ери имунотерапије. Ланцет Онцол. 2020, 21, е463–е476. [ЦроссРеф] [ПубМед]

13. Дарвин, П.; Тоор, СМ; Сасидхаран Наир, В.; Елкорд, Е. Иммуне Цхецкпоинт Инхибиторс: Недавни напредак и потенцијални биомаркери. Екп. Мол. Мед. 2018, 50, 1–11. [ЦроссРеф] [ПубМед]

14. Ли, Б.; Цхан, ХЛ; Цхен, П. Иммуне Цхецкпоинт Инхибиторс: Басицс анд Цхалленгес. Цурр. Мед. Цхем. 2019, 26, 3009–3025. [ЦроссРеф] [ПубМед]

15. Јиа, Кс.; Иан, Б.; Тиан, Кс.; Лиу, К.; Јин, Ј.; Схи, Ј.; Хоу, И. Цд47/Сирпалпха пут посредује у бекству од рака и имунотерапији. Инт. Ј. Биол. Сци. 2021, 17, 3281–3287. [ЦроссРеф]

16. Свобода, ДМ; Саллман, ДА Обећање инхибитора контролних тачака усмерених на макрофаге у мијелоидним малигнитетима. Најбоља пракса и истраживање. Цлин. Хаематол. 2020, 33, 101221.

17. Лентз, РВ; Цолтон, МД; Митра, СС; Мессерсмитх, ВА Инхибитори урођених контролних тачака имунитета: Следећи пробој у медицинској онкологији? Мол. Цанцер Тхер. 2021, 20, 961–974. [ЦроссРеф]

18. Јианг, П.; Лагенаур, ЦФ; Нараианан, В. Протеин повезан са Интегрином је лиганд за П84 Неурал Адхесион Молецуле. Ј. Биол. Цхем. 1999, 274, 559–562. [ЦроссРеф]

19. Сеифферт, М.; Цант, Ц.; Цхен, З.; Рапполд, И.; Бруггер, В.; Канз, Л.; Бровн, ЕЈ; Уллрицх, А.; Бухринг, ХЈ Хуман Сигнал-Регулаторни протеин је изражен на нормалном, али не на подскуповима леукемијских мијелоидних ћелија и посредује у ћелијској адхезији која укључује његов контрарецептор Цд47. Крв 1999, 94, 3633–3643. [ЦроссРеф]

20. Матлунг, ХЛ; Сзилагии, К.; Барцлаи, НА; ван ден Берг, ТК. Цд47-Сирпалфа сигнална оса као урођена имунолошка контролна тачка код рака. Иммунол. Рев. 2017, 276, 145–164. [ЦроссРеф] [ПубМед]

21. Олденборг, ПА; Зхелезниак, А.; Фанг, ИФ; Лагенаур, ЦФ; Гресхам, ХД; Линдберг, ФП Улога Цд47 као маркера себе на црвеним крвним зрнцима. Наука 2000, 288, 2051–2054. [ЦроссРеф]

22. Ли, З.; Ли, И.; Гао, Ј.; Фу, И.; Хуа, П.; Јинг, И.; Цаи, М.; Ванг, Х.; Тонг, Т. Тхе Роле оф Цд47-Сирпалпха Иммуне Цхецкпоинт ин Тумор Иммуне Евасион анд Инте Иммунотхерапи. Лифе Сци. 2021, 273, 119150. [ЦроссРеф]

23. Хаиат, СМГ; Бианцони, В.; Пирро, М.; Јаафари, МР; Хатамипур, М.; Сахебкар, А. Цд47: Улога у имунолошком систему и примена у терапији рака. Ћелија. Онцол. 2020, 43, 19–30. [ЦроссРеф]

24. Хуанг, И.; Може.; Гао, П.; Иао, З. Циљање на Цд47: достигнућа и забринутост тренутних студија о имунотерапији рака. Ј. Тхорац. Дис. 2017, 9, Е168–Е174. [ЦроссРеф]

25. Зханг, В.; Хуанг, К.; Ксиао, В.; Зхао, И.; Пи, Ј.; Ксу, Х.; Зхао, Х.; Ксу, Ј.; Еванс, ЦЕ; Јин, Х. Напредак у третманима против тумора који циљају на осу Цд47/Сирпалпха. Фронт. Иммунол. 2020, 11, 18. [ЦроссРеф] [ПубМед]

26. Лиу, Кс.; Пу, И.; Црон, К.; Денг, Л.; Клине, Ј.; Фразиер, ВА; Ксу, Х.; Пенг, Х.; Фу, ИКС; Ксу, ММ Цд47 блокада покреће уништавање имуногених тумора посредовано Т ћелијама. Нат. Мед. 2015, 21, 1209–1215. [ЦроссРеф] [ПубМед]

27. Веископф, К.; Ринг, АМ; Хо, ЦЦ; Волкмер, ЈП; Левин, АМ; Волкмер, АК; Озкан, Е.; Фернхоф, НБ; ван де Ријн, М.; Веиссман, ИЛ; ет ал. Конструисане Сирпалфа варијанте као имунотерапеутски додаци антителима против рака. Наука 2013, 341, 88–91. [ЦроссРеф]

28. Ксионг, З.; Охлфест, ЈР Локални имиквимод има терапеутске и имуномодулаторне ефекте против интракранијалних тумора. Ј. Иммунотхер. 2011, 34, 264–269. [ЦроссРеф]

29. Каматх, П.; Дарвин, Е.; Арора, Х.; Ноури, К. Преглед терапије имиквимодом и дискусија о оптималном управљању карциномом базалних ћелија. Цлин. Друг Инвестиг. 2018, 38, 883–899. [ЦроссРеф]

30. Лиу, И.; Кастро Браво, КМ; Лиу, Ј. Циљана испорука липозомалних лекова: нанонаука и биофизичка перспектива. Наносцале Хориз. 2021, 6, 78–94. [ЦроссРеф] [ПубМед]

31. Фарјадиан, Ф.; Гхасеми, А.; Гохари, О.; Рооинтан, А.; Карими, М.; Хамблин, МР Нанофармацеутика и наномедицини тренутно на тржишту: Изазови и могућности. Наномедицина 2019, 14, 93–126. [ЦроссРеф]

32. Зхоу, Кс.; Јиао, Л.; Киан, И.; Донг, К.; Сун, И.; Зхенг, В.; Зхао, В.; Зхаи, В.; Киу, Л.; Ву, И.; ет ал. Репозиционирање азелнидипина као двоструког инхибитора који циља на Цд47/Сирпалпха и Тигит/Пвр путеве за имунотерапију рака. Биомолецулес 2021, 11, 706. [ЦроссРеф]

33. Ни, К.; Луо, Т.; Цулберт, А.; Кауфманн, М.; Јианг, Кс.; Лин, В. Наносцале метал-органиц Фрамеворк ко-испоручује Тлр-7 агонисте и анти-Цд47 антитела за модулацију макрофага и оркестрирање имунотерапије рака. Џем. Цхем. Соц. 2020, 142, 12579–12584. [ЦроссРеф]

34. Цхен, К.; Ксу, Л.; Лианг, Ц.; Ванг, Ц.; Пенг, Р.; Лиу, З. Фототермална терапија са имуно-адјувантним наночестицама заједно са блокадом контролне тачке за ефикасну имунотерапију рака. Нат. Цоммун. 2016, 7, 13193. [ЦроссРеф] [ПубМед]

35. Веи, Ј.; Лонг, И.; Гуо, Р.; Лиу, Кс.; Танг, Кс.; Рао, Ј.; Иин, С.; Зханг, З.; Ли, М.; Хе, К. Мултифункционална хемо-имунотерапија заснована на полимерној мицели са блокадом имунске контролне тачке за ефикасан третман ортотопског и метастатског рака дојке. Ацта Пхарм. Син. Б 2019, 9, 819–831. [ЦроссРеф]

36. Хуанг, СВ; Ванг, СТ; Цханг, СХ; Цхуанг, КЦ; Ванг, ХИ; Као, ЈК; Лианг, СМ; Ву, ЦИ; Као, СХ; Цхен, ИЈ; ет ал. Имиквимод испољава антитуморске ефекте изазивањем имуногене ћелијске смрти и појачава га гликолитички инхибитор 2-деоксиглукоза. Ј. Инвестиг. Дерматол. 2020, 140, 1771–1783.е6. [ЦроссРеф] [ПубМед]

37. Ванг, Б.; Хе, Кс.; Зханг, З.; Зхао, И.; Фенг, В. Метаболизам наноматеријала ин виво: циркулација крви и чишћење органа. Ацц. Цхем. Рес. 2013, 46, 761–769. [ЦроссРеф]

38. Акхтари, Ј.; Резаиат, СМ; Теимоури, М.; Алавизадех, СХ; Гхеиби, Ф.; Бадиее, А.; Јаафари, МР циљање, биодистрибутивна и инхибиција раста тумора карактеризација спајања анти-Хер2 афитела са липозомалним доксорубицином помоћу Балб/Ц мишева који носе тубо туморе. Инт. Ј. Пхарм. 2016, 505, 89–95. [ЦроссРеф]

39. Воодле, МЦ; Папахадјопоулос, Д. Припрема липозома и карактеризација величине. Метходс Ензимол. 1989, 171, 193–217. [ПубМед]