Дуга некодирајућа РНК КЦНК1ОТ1 регулише протеин киназу ЦК2 преко МиР-760 у старењу и ограничењу калорија Ⅱ

3. Дискусија

Epigenetic regulation mechanisms, including microRNAs (miRNAs), nucleosome remodeling, DNA methylation, and histone modification, can change heritable phenotypes without changing the DNA sequence (26). There are two main classes of non-coding RNAs(ncRNAs): the larger long ncRNAs (IncRNAs; >200 нуклеотида), и мање миР.НА (21-25 нуклеотида) [1-3]. КЦНО10Т1 је првобитно идентификован као лнцРНА, која утишава неколико гена унутар кцнг1 локуса успостављањем структуре вишег реда хроматина (4 61. Недавно су другибиолошке функције КЦНО1ОТ1су пријављени укључујући и оне повезане сафиброза,церебрална исхемија,мождани удар атеросклероза, онкогенеза, остеогене диференцијације, зарастање прелома, ихипертрофија срца(7-13). Међутим, детаљни механизми помоћу којих КЦНО10Т1 регулише ћелијско старење и ЦР су још увек непознати. Стога смо покушали да разјаснимо да ли је КЦНО10Т1 био укључен у старење и ЦР. Ова студија показује да је КЦНО10Т1 обарање изазвало неколико маркера ћелијског старења, укључујући индукцију СА--гал активности, активацију п53-21Цип1/ВАФ1 пута, повећану триметилацију Х3К9 која је потребна за формирање САХФ и фактор САСП (Л{{ 13}}, ИЛ-6 и ММП3) у ћелијама хуманог рака ХЦТ116 и МЦФ-7 (Слике 1 и 2А). Пошто је оксидативни стрес значајан узрок старења (14,15 истражен је ефекат КЦНО10Т1 на генерисање РОС. Као што се очекивало, КЦНО1ОТкноцкдовн повећао је интрацелуларни РОС у ХЦТ116 и МЦФ-7 ћелијама (Слика 2Б). Поред тога, ниво КЦНО10Т1 мРНА је смањена у ЛПС-индукованим сенесцентним ћелијама, а ектопична експресија КЦНК10Т1 потиснула је експресију САСП фактора посредовану ЛПС-ом у овим ћелијама рака (слика 3А,Б). Штавише, КЦНО10Т1 нокдаун индуковао је СА-Б-гал активност у ИМР-у хуманих плућних фибробласта{ {39}} ћелија, а експресија КЦНО10Т1 је смањена током репликативног старења у ИМР-90 ћелијама (Слика 6). Заједно, ови резултати указују на то да КЦНО10Т1 делује каореагенс против старењаиантиоксидансу људским ћелијама рака залепљене за фибробласте.

Кликните овде да бисте сазнали више Цистанцхе додатака против старења

Раније је показано да нокдаун Цк2 индукује маркере старења као што је СА-гал бојење [16], активација п53-п21Цип1/ВАФ1 пута (генерација 171РОС [18САХФ формирање (19л, и експресија САСП фактора 20). испитивана је веза између КЦНО10Т1 и ЦК2 Ова студија показује да је прекомерна експресија ЦК2к поништила ове маркере старења узроковане обарањем КЦНО10Т1 (Слике 1, 2 и 6Б) Поред тога, обарање КЦНО10Т1 је смањило ниво протеина и мРНК (слике ЦК2А1кБ4 нивое ЦКА1кБ4). ), и прекомерна експресија КЦНО10Т1 (36,181-37,140) стимулисала је ниво мРНК ЦК2к (слика 4А), што указује да КЦНК1ОТ1 функционише као позитиван регулатор ЦК2а у ћелијама. Недавне студије су откриле да лнцРНА могу сунђер миРНА инхибирати експресија циљне мРНА (1-3). Пошто су претходне студије показале да миР-760 реагује са ЦК2а (21,22] и КЦНО10Т1 [27], сигналном мрежом КЦНО10Т1, ЦК2к и миР{{ 47}}. Ова студија показује да додатни третман са миР-760 опонаша потиснуту КЦНК10Т1-посредовану ЦК2к регулацију, а додатни третман миР-760 инхибитором потискује КЦНО10Т1 ЦК2 посредован с нокдауном регулација на ниже (слика 4). Конзистентно, третман са ЛПС, који је смањио експресију КЦНО10Т1, повећао је ниво миР-760 (слика 3Ц). Стога, ове студије сугеришу да количина КЦНК1ОТ1 РНК може да титрира миР-760 и на тај начин регулише доступност миР-760 за везивање за иРНК ЦК2к. КЦНО1ОТ1 и ЦК2а могу преслушавати кроз способност свог транскрипта да се такмиче за миР-760 везивање.

Пошто ЦР пружаефекат против старења(23], испитано је како ЦР регулише КЦНК1ОТ1 и миР-760. Ова студија показује да је стање ЦР повећало експресију КЦНО10Т1 и ЦК2к и смањило ниво миР-760 (Слика 5А,Б). , третман са миР-760 опонаша потиснуту ЦР посредовану ЦК2к регулацију (Слика 5Ц). Конзистентно, КЦНО10Т1 нокдаун повећава нивое миР-760, док су додатни услови потиснули миР посредовано обарањем КЦНК10Т1{{19} } индукција (Слика 5Д). Коначно, ЦР стање је спасило смањену експресију КЦНО1ОТ1 и ЦК2а, посредовану репликативним старењем (Слика 6Ц). Све у свему, ови резултати су открили да је ЦР стање смањило миР-760 преко повећања КЦНО10Т1, што доводи до повећања ЦК2к у људским ћелијама. Иако лнцРНА СНХГ6 делује као сунђер миР-760у ЦРЦ ћелијама [25], ЦР није променио експресију СНХГ6 у експерименталним условима (подаци нису приказани). Како ЦР појачава регулацију КЦНК1ОТ1 Друге групе су раније показале да фактори транскрипције НФИ и -катенин регулишу КЦНО10Т1 (28,29). Међутим, ЦР није могао да регулише експресију НФ-И и Б-катенина најмање у експерименталним условима (подаци нису приказани). Стога су потребне додатне студије да би се идентификовао специфични узводни регулатор КЦНО10Т1 у условима ЦР.

У закључку, на основу резултата ове студије, предложен је модел за улогу КЦНК1ОТ1 у старењу и ЦР. КЦНК1ОТ1 повећава регулацију ЦК2 тако што уништава миР-760. КЦНК1ОТ1–миР-760–ЦК2 пут је укључен у старење и ЦР. Третман ЛПС-ом и подела ћелија у фибробластима индукују старење смањењем КЦНК1ОТ1. ЦР потискује старење активирањем пута КЦНК1ОТ1–миР-760–ЦК2 (слика 6Д). Стога, ова студија сугерише КЦНК1ОТ1 као нову терапијску мету код старења и болести повезаних са старењем, као и алтернативни третман који опонаша ефекте ЦР.

4. Материјали и методе

4.1. Материјали

4.2. Ћелијска култура и ЦР

ИМР-90 ћелије хуманих диплоидних фибробласта су добијене из Америчке колекције типских култура (АТЦЦ, Манассас, ВА, САД) на нивоу удвостручавања популације (ПДЛ) од 24. МЦФ-7 ћелије рака дојке код људи, ћелије рака дебелог црева ХЦТ116 (АТЦЦ) и ИМР-90 ћелије су узгајане у Дулбеццо-овом модификованом Еагле-овом медијуму који садржи 10 процената (в/в) говеђег серума и 1 проценат (в/в) пеницилин-стрептомицина, у влажној атмосфери од 95 процената (в/в) ваздуха и 5 процената (в/в) ЦО2 на 37 ◦Ц. ПДЛ ИМР-90 ћелија је израчунат коришћењем формуле ПД=лог(Нф/Ни)/лог2, где је Нф коначни број ћелије, а Ни почетни број засејаних ћелија. За гладовање ћелија (ограничење калорија), ћелије са физиолошким раствором пуферованим фосфатом су два пута испране и култивисане у Еарле-овом балансираном раствору соли (Тхермо Фисхер, Валтхам, МА, УСА), са 5,5 мМ глукозе, без аминокиселина, седам сати.

4.3. Екстракција РНК и миРНА квантитативни ПЦР у реалном времену

4.4. Трансфекција ДНК и интерференција РНК

4.5. СА- Тест активности -гал

Ћелије у суб-конфлуентним културама су испране ледено хладним физиолошким раствором пуферованим фосфатом (ПБС), фиксиране са 3 процента (в/в) формалдехида у ПБС током 10 мин на собној температури, а затим инкубиране са бојењем раствор који садржи 1 мг/мЛ 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-Д галактозида, 40 мМ лимунска киселина-натријум фосфат (пХ 6,0), 5 мМ калијум ферцијанида, 5 мМ калијум фероцијанида, 150 мМ НаЦл и 2 мМ МгЦл2 током 24 х на 37 ◦Ц. Плаво обојене ћелије су избројане у најмање десет поља при увећању од 400 × и изражене као проценат позитивних ћелија.

4.6. Мерење интрацелуларних нивоа РОС

Флуоресцентна сонда осетљива на оксидацију ЦМ-Х2ДЦФДА је коришћена за процену нивоа РОС. Ћелије су третиране са 5 µМ ЦМ-Х2ДЦФДА током 20 минута на 37 ◦Ц у мраку,одвојен трипсинизацијом, а затим испран са ПБС. Интензитет флуоресценције је одвраћаоминирано коришћењем Цоултер Елите ЕСП Целл Сортера (Бецкман Цоултер Инц., Бреа, Калифорнија, САД). Тхекапије напредног и бочног расипања су постављене да искључе све мртве ћелије из анализе; барем10,000 догађаја у оквиру капије је добијено по узорку.

4.7. Реверзна транскрипција (РТ)-ПЦР

4.8. Имуноблотинг

4.9. Статистичка анализа

Једносмерна анализа тестирања варијансе података спроведена је коришћењем СПСС пакет програма (ИБМ, Армонк, Њујорк, САД). Резултати су сматрани значајним ако је п-вредност била<0.05. Duncan's multiple range test was conducted if the differences between the groups were identified as α = 0.05. 

Додатни материјали: Следеће пратеће информације се могу преузети на:

Доприноси аутора: И.-СБ је осмислио и дизајнирао експерименте, ИЛ је извео експерименте, а И.-СБ је написао рад. Сви аутори су прочитали и сложили се са објављеном верзијом рукописа.

Финансирање: Ово истраживање је подржано од стране Програма основних научних истраживања, преко Националне истраживачке фондације Кореје (НРФ) коју финансира Министарство науке, ИКТ и планирања будућности (НРФ-2019Р1А2Ц1005219).

Изјава институционалног одбора за ревизију: Није применљиво.

Изјава о информисаној сагласности: Није применљиво.

Изјава о доступности података: Није применљиво.

Сукоб интереса: Аутори изјављују да нема сукоба интереса.

Референце

1. Улитски, И.; Бартел, ДП линцРНА: Геномика, еволуција и механизми. Ћелија 2013, 154, 26–46. [ЦроссРеф] [ПубМед]

2. Естеллер, М. Нон-цодинг РНАс ин хуман дисеасе. Нат. Рев. Генет. 2011, 12, 861–874. [ЦроссРеф] [ПубМед]

3. Куинн, ЈЈ; Цханг, ХИ Јединствене карактеристике дуге некодирајуће биогенезе и функције РНК. Нат. Рев. Генет. 2016, 17, 47–62. [ЦроссРеф] [ПубМед]

4. Манцини-Динардо, Д.; Стееле, СЈ; Леворсе, ЈМ; Инграм, РС; Тилгхман, СМ Продужење Кцнк1от1 транскрипта је потребно за геномско утискивање суседних гена. Генес Дев. 2006, 20, 1268–1282. [ЦроссРеф] [ПубМед]

5. Пандеи, РР; Мондал, Т.; Мохаммад, Ф.; Енротх, С.; Редруп, Л.; Коморовски, Ј.; Нагано, Т.; Манцини-Динардо, Д.; Кандури, Ц. Кцнк1от1 антисенсе некодирајућа РНК посредује утишавање транскрипције специфично за лозу кроз регулацију на нивоу хроматина. Мол. Целл 2008, 32, 232–246. [ЦроссРеф]

6. Кандури, Ц. Кцнк1от1: Регулаторна РНК хроматина. Семин. Ћелија. Дев. Биол. 2011, 22, 343–350. [ЦроссРеф]

7. Ианг, Ф.; Кин, И.; Лв, Ј.; Ванг, И.; Цхе, Х.; Цхен, Кс.; Јианг, И.; Ли, А.; Сун, Кс.; Иуе, Е.; ет ал. Утишавање дуге некодирајуће РНК Кцнк1от1 ублажава пироптозу и фиброзу код дијабетичке кардиомиопатије. Целл Деатх Дис. 2018, 9, 1000. [ЦроссРеф]

8. Иу, С.; Иу, М.; Хе, Кс.; Вен, Л.; Бу, З.; Фенг, Ј. КЦНК1ОТ1 промовише аутофагију регулацијом пута миР-200а/ФОКСО3/АТГ7 код церебралног исхемијског можданог удара. Агинг Целл 2019, 18, е12940. [ЦроссРеф]

9. Иу, КСХ; Денг, ВИ; Цхен, ЈЈ; Ксу, КСД; Лиу, КСКС; Цхен, Л.; Схи, МВ; Лиу, ККС; Тао, М.; Рен, К. ЛнцРНА кцнк1от1 промовише акумулацију липида и убрзава атеросклерозу тако што функционише као цеРНА кроз ос миР-452-3п/ХДАЦ3/АБЦА1. Целл Деатх Дис. 2020, 11, 1043. [ЦроссРеф]

10. Цагле, П.; Ки, К.; Нитуре, С.; Кумар, Д. КЦНК1ОТ1: Онкогена дуга некодирајућа РНК. Биомолекули 2021,

11, 1602. [Унакрсна референца] 11. Ванг, ЈЛ; Веи, Кс.; Ванг, АГ; Баи, И.; Ву, КСЈ КЦНК1ОТ1 регулише остеогену диференцијацију хБМСЦ по оси миР-320а/Смад5. ЕУР. Рев. Мед. Пхармацол. Сци. 2020, 24, 2843–2854. [ПубМед]

12. Цхен, Л.; Ксионг, И.; Иан, Ц.; Зхоу, В.; Ендо, И.; Ксуе, Х.; Ху, И.; Ху, Л.; Ленг, Кс.; Лиу, Ј.; ет ал. ЛнцРНА КЦНК1ОТ1 убрзава зарастање прелома преко модулације миР-701-3п/ФГФР3 осе. ФАСЕБ Ј. 2020, 34, 5208–5222. [ЦроссРеф] [ПубМед]

13. Цхен, И.; Зханг, З.; Зху, Д.; Зхао, В.; Ли, Ф. Нокдаун КЦНК1ОТ1 ублажава хипертрофију срца кроз модулацију миР-2054/АКТ3 осе. Ј. Тхорац. Дис. 2020, 12, 4771–4780. [ЦроссРеф] [ПубМед]

14. Чајлдс, БГ; Дурик, М.; Бакер, ДЈ; ван Деурсен, ЈМ Ћелијско старење у старењу и болестима везаним за старење: од механизама до терапије. Нат. Мед. 2015, 21, 1424–1435. [ЦроссРеф]

15. МцХугх, Д.; Гил, Ј. Старење и старење: узроци, последице и терапијски путеви. Ј. Целл Биол. 2018, 217, 65–77. [ЦроссРеф]

16. Риу, СВ; Воо, ЈХ; Ким, ИХ; Лее, ИС; Парк, ЈВ; Бае, ИС Смањење регулације протеин киназе ЦКИИ је повезано са ћелијским старењем. ФЕБС Летт. 2006, 580, 988–994. [ЦроссРеф]

Тражи више:

Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com вхатсапп: плус 86 15292862950