Лизозомална липидна пероксидација регулише имунитет тумора

Лизозомална инхибиција изазвана инхибиторима палмитоил-протеин тиоестеразе 1 (ППТ1) као што је ДЦ661 може довести до смрти ћелије, али механизам за то није у потпуности схваћен. Програмирани путеви ћелијске смрти (аутофагија, апоптоза, некроптоза, фероптоза и пироптоза) нису били потребни да би се постигао цитотоксични ефекат ДЦ661. Инхибиција катепсина, или хелација гвожђа или калцијума, није спасила ДЦ661-индуковану цитотоксичност. Инхибиција ППТ1 индуковала је лизозомалну пероксидацију липида (ЛЛП), што је довело до пермеабилизације лизозомалне мембране и ћелијске смрти која се могла поништити антиоксидантом Н-ацетилцистеином (НАЦ), али не и другим антиоксидантима пероксидације липида. Лизозомални цистеински транспортер МФСД12 је био потребан за интрализозомални транспорт НАЦ-а и спасавање ЛЛП-а. Инхибиција ППТ1 произвела је ћелијску интринзичну имуногеност са површинском експресијом калретикулина која се могла поништити само са НАЦ. Ћелије које су третиране ДЦ661-има примају наивне Т ћелије и повећавају токсичност посредовану Т ћелијама. Мишеви вакцинисани ДЦ661-третираним ћелијама изазвали су адаптивни имунитет и одбацивање тумора код „имунолошких врућих“ тумора, али не и код „имунолошких хладних“ тумора. Ови налази показују да ЛЛП покреће лизозомалну ћелијску смрт, јединствени имуногени облик ћелијске смрти, указујући на пут ка рационалним комбинацијама имунотерапије и лизозомалне инхибиције које се могу тестирати у клиничким испитивањима.

Предности цистанцхе тубулоса-Антитумор

Увод

Уз охрабрујућу активност у клиничким испитивањима која укључују лизозомални инхибитор хидроксихлорокин (ХЦК) (1), идентификацију палмитоил-протеин тиоестеразе 1 (ППТ1) као молекуларне мете деривата хлорокина (2) и лансирање нових инхибитора ППТ1 у клиничку испитивања (3, 4), постоји потреба да се разуме механизам којим лизозомални инхибитори индукују ћелијску смрт и ефекат лизозомалне инхибиције на имунитет тумора. Канонски механизам смрти лизозомске ћелије описан за ХЦК укључује пермеабилизацију лизозомалне мембране (ЛМП), цурење катепсина и активацију апоптозе посредоване каспазом (5, 6). Раније смо показали да лизозомални инхибитор ДЦ661 продире у ћелије у киселом микроокружењу тумора и локализује се на лизозом ефикасније од ХЦК (2, 7). ДЦ661 производи снажну ћелијску смрт у многим ћелијским линијама рака (2). ДЦ661 везује и инхибира ППТ1, декисели лизозом и инхибира аутофагију. ДЦ661 такође индукује ЛМП и повећава нивое расцепљене каспазе 3 (2, 7). Последњих година дефинисани су нови механизми ћелијске смрти који имају имуногене последице и укључују некроптозу, фероптозу и пироптозу (8). Показало се да аутофагија зависна од лизозома деградира МХЦ класу И (9), као и компоненте имунопротеасома (10), што сугерише да инхибиција аутофагије може да побољша процесирање антигена. Међутим, имуногени ефекти лизозомалне инхибиције и последичне ћелијске смрти нису у потпуности окарактерисани. Да бисмо решили овај јаз у знању, истражили смо ефекте ДЦ661 на механизме канонске ћелијске смрти да бисмо утврдили да ли је лизозомална ћелијска смрт његов облик ћелијске смрти или једноставно претеча једног од других утврђених механизама. Открили смо да су ХЦК и ДЦ661 изазвали значајно повећање само малог броја протеина у протеому меланома и већина њих су били протеини повезани са аутофагијом и апоптозом. Инхибитори програмиране ћелијске смрти (апоптоза, некроптоза, фероптоза и пироптоза) нису ублажили цитотоксичне ефекте након оштећења лизозома од стране ДЦ661. Лизозомална липидна пероксидација (ЛЛП) је главни покретач ћелијске смрти изазване ЛМП-ом повезане са експресијом калретикулина (ЦАЛР) на површини ћелије. Овај облик ћелијске смрти може се преокренути само употребом антиоксиданта Н-ацетилцистеина (НАЦ). Активност НАЦ је ослабљена инхибицијом увозника лизозома цистеина МФСД12. ЛЛП је изазвао имуногене фенотипове који промовишу убијање посредовано Т ћелијама. Ови налази показују да је смрт ћелија лизозома потенцијално јединствен облик имуногене ћелијске смрти.

цистанцхе биљке које повећавају имуни систем

Резултати

Лизозомална инхибиција изазива значајне промене у протеому повезане са аутофагијом и апоптозом. Да бисмо утврдили цитотоксичне ефекте лизозомалних инхибитора, проценили смо одрживост А375П меланома, РКО карцинома дебелог црева и МИА ПаЦа{1}} ћелијских линија рака панкреаса третираних вакуоларним инхибитором Х+-АТПазе бафиломицином-А1 (1 00 нМ); ППТ1 инхибитори ДЦ661 (3 μМ) или ХЦК (10 μМ или 30 μМ); палмитат миметик хексадецил сулфонил флуорид (ХДСФ; 60 μМ); инхибитори катепсина пепстатин А (ПепА; 10 уг/мЛ), Е64 (ПепА; 10 уг/мЛ) или ПепА+Е64; и дисруптор лизозомалне мембране Леу-Леу метил естар хидробромид (20 μМ) током 48 сати. Само бафиломицин-А1 и ДЦ661 изазвали су значајно смањење вијабилности ћелија преко ћелијских линија рака (Слика 1А и Додатна слика 1А; додатни материјал доступан на интернету уз овај чланак; хттпс://дои.орг/10.1172/ЈЦИ164596ДС1), при чему је ДЦ661 производио дубље смањење виталности ћелија од бафиломицина-А1. На основу ових података и фармаколошких својстава деривата хлорокина налик лековима, фокусирали смо нашу студију на деривате хлорокина као алате за разумевање лизозомалне ћелијске смрти. Непристрасна глобална анализа протеома примењена је на ћелије меланома А375П третиране са ДЦ661 (3 μМ) или мање моћним ХЦК (10 μМ или 30 μМ) током 24 сата. Од 4.264 квантификована протеина са високом поузданошћу, само 87 и 55 протеина је значајно повећано са ДЦ661 (3 μМ) и ХЦК (30 μМ), респективно; додатно, 14 и 15 протеина су значајно смањени са ДЦ661 (3 μМ) и ХЦК (30 μМ), респективно (апсолутна промена пута већа од 2; к < 0,05) са ДЦ661 (3 μМ) или ХЦК (30 μМ), респективно. , у поређењу са контролом возила. Нижа доза ХЦК (10 μМ) није показала значајне промене протеина у поређењу са контролом носача. Топ 50 протеина који су значајно повећани након третмана ДЦ661 углавном су били повезани са аутофагијом и апоптозом, а сличне промене су примећене и за већу дозу ХЦК (Слика 1Б). Из ових разлога, одлучили смо да фокусирамо даље студије на моћнији ДЦ661. Примери неких од највећих промена протеина повезаних са аутофагијом и апоптозом су били порески{62}}везујући протеин 1 (ТАКС1БП1; повећан 15-пут); БЦЛ2-протеин 3 у интеракцији (БНИП3; повећан 6-пут); сусед протеина БРЦА1 гена 1 (НБР1; повећан 12-пут); секвестозом-1 (СКСТМ1/п62; повећан 5-пут); коактиватор нуклеарног рецептора 4 (НЦОА4; повећан 3-пут); и ЛЦ3Б (МАП1ЛЦ3Б; повећан 3-пут). Аполипопротеин Б-100 (АПОБ; повећан 66- пута) је изведен из феталног телећег серума и није даље проучаван. Имуноблотинг је потврдио да третман са ДЦ661 или вишим концентрацијама ХЦК доводи до значајног повећања експресије карго рецептора аутофагије НБР1, ТАКС1БП1, СКСТМ1/п62 и НЦОА4 на начин који зависи од дозе и времена (додатна слика 1, Б и Ц). ЦРИСПР/Цас9 КО ППТ1 у А375П ћелијама је фенокопирао ефекте ДЦ661 на ове протеине у поређењу са њиховим ВТ колегама (додатна слика 1Д). Међутим, експресија карго рецептора аутофагије и релативна повећања изазвана третманом ДЦ661 били су променљиви код рака дебелог црева, рака панкреаса и других ћелијских линија меланома у којима ДЦ661 показује цитотоксичност (додатна слика 1Е). Ово сугерише да сами рецептори аутофагије, иако су повећани на нивоу протеина, вероватно неће бити одговорни за ћелијску смрт након третмана ДЦ661. Да бисмо ово потврдили, фокусирали смо се на рецепторе аутофагије ТАКС1БП1 и БНИП3 јер имају познате проапоптотичке ефекте у ћелијама рака (Слика 1Ц). ТАКС1БП1 је аутофагијски карго адаптер (11) и такође регулише апоптозу индуковану инхибиторима синтезе протеина или агенсима који оштећују ДНК у ћелијама рака (12). Обарање ТАКС1БП1 помоћу сиРНА (слика 1Д) није утицало на цитотоксичност изазвану ДЦ661-у краткорочним (слика 1Е) и дугорочним тестовима одрживости (слика 1Ф). Ови резултати су показали да ТАКС1БП1 не игра битну улогу у цитотоксичности посредованој ДЦ{126}. БНИП3 је проапоптотски протеин који нарушава биоенергетику митохондрија и регулише митофагију (13). Ефикасно уништавање БНИП3 (слика 1Г) није утицало на цитотоксичност индуковану ДЦ661-(слике 1, Х и И). Ови резултати су показали да су цитотоксични ефекти ДЦ661 независни од експресије БНИП3. Затим смо проучавали ефекте исцрпљивања ћелија канонских гена аутофагије потребних за производњу аутофагозома на ефикасност ДЦ661 тако што смо обарали унц-51 попут киназе 1 која активира аутофагију (УЛК1) и гена 7 (АТГ7) повезаног са аутофагијом. Ефикасно обарање УЛК1 или АТГ7 (додатна слика 2, А и Б) инхибира аутофагични ток (допунска слика 2Ц), али није утицало на цитотоксичност изазвану ДЦ661- (слика 1, Ј–М). Ови резултати су показали да одсуство суштинске машинерије аутофагије не поништава цитотоксичне ефекте ДЦ661. Лизозомална инхибиција ДЦ661 индукује вишеструке програмиране путеве ћелијске смрти. Канонско гледиште је да је смрт лизозомских ћелија последица апоптозе (5). Имуноблотинг је открио да је третман ДЦ661 резултирао активацијом каспазе-3, -7 и -9 и цепањем ПАРП-1, потврђујући да је ДЦ661 активирао апоптозу (слика 2А). Инхибитор пан-капазе З-ВАД-ФМК спречио је активацију каспазе помоћу ДЦ661, али није инхибирао акумулацију ЛЦ3Б и п62, показујући да су активација апоптозе и блокада аутофагије одвојиви након лизозомалне инхибиције (слика 2Б). Блокирање апоптозе са ЗВАД-ФМК није појачало или ограничило цитотоксичност ДЦ661, што сугерише да је апоптоза неопходна за смрт лизозомских ћелија (Слика 2, Ц и Д). Цитотоксични ефекти ДЦ661 били су слични код примарних ћелија коштане сржи Бак/Бак са двоструким КО неспособним да се подвргну апоптози и ВТ ћелија (Слика 2Е). Блокада апоптозе такође није утицала на цитотоксичност изазвану ДЦ661-у ћелијама рака дебелог црева и панкреаса (додатна слика 2, Д–Ф). Пошто смо открили да је апоптоза неопходна за ћелијску смрт изазвану ДЦ661-, истражили смо да ли ДЦ661 индукује некроптозу, други облик програмиране ћелијске смрти регулисан протеин киназом која интерагује на рецептор (РИПК) и протеином налик домену киназе мешовите лозе ( МЛКЛ). Нивои фосфорилисаних и активираних облика РИПК и МЛКЛ су повећани након третмана ДЦ661 са 0,1–1 μМ (слика 2Ф). Код 3 μМ ДЦ661 није било фосфорилисаног РИПК1, али је постојао фосфорилисани МЛКЛ, што сугерише да би, при овој вишој концентрацији, могли бити укључени додатни облици ћелијске смрти. Предтретман инхибиторима РИПК1 некростатинима-1 или некростатинима-1 или МЛКЛ инхибитором некросулфонамидом спречио је фосфорилацију РИПК1 након третмана ДЦ661 (1 μМ) у ћелијама меланома (слика 2Г), али није успео{{101}спасити ДЦ }}индукована цитотоксичност у ћелијама меланома (слика 2Х) или ћелија рака дебелог црева или панкреаса (допунска слика 2Г). Ови налази указују на то да је некроптоза активирана, али неопходна за ћелијску смрт посредовану ДЦ{195}.

Слика 1. Инхибиција лизозомалне аутофагије изазива значајне промене у протеинима апоптозе и аутофагије. (А)

Лизозоми су једно од главних места складиштења гвожђа. Дисрегулисани интрацелуларни метаболизам гвожђа у комбинацији са смањеним редуктивним капацитетом може изазвати неапоптотичку ћелијску смрт познату као фероптоза. Обележје фероптозе је појачана регулација простагландин-ендопероксид синтазе 2 (ПТГС2), хомолога 1 регулатора транспорта катјона (ЦХАЦ1) и цистеинил-тРНА синтетазе (ЦАРС) (14). Сва 3 ова маркера фероптозе су транскрипционо повећана третманом ДЦ661 (слика 3А), што сугерише да лизозомална инхибиција индукује фероптозу. ДЦ661 је изазвао промену флуоресценције у ћелијама А375П третираним Ц11–БОДИПИ, што указује на пероксидацију липида, карактеристичну за фероптозу. Овај ДЦ661-индуковани помак је значајно преокренут у присуству инхибитора фероптозе феростатина-1 или роксстатина за усне-1 који су давани у ефективној концентрацији (слика 3Б и додатна слика 3А), што даље указује да ДЦ661 индукована фероптоза. Међутим, инхибиција фероптозе није спасила цитотоксичност повезану са ДЦ661 (Слика 3, Ц и Д). Котретман ћелија рака дефероксамином (ДФО) и ДЦ661 није спасио цитотоксичност ДЦ661 (слика 3Е). Третман феростатином-1, роксстатином усана-1 или ДФО није спасио ДЦ661 инхибицију краткорочне одрживости или дуготрајног клоногеног раста ћелија рака меланома, дебелог црева и панкреаса (допунска слика 3, Б –Е и Додатна слика 4, А–Д). Ови подаци показују да је фероптоза активирана, али неопходна за ДЦ{31}посредовану ћелијску смрт. Пироптоза је облик програмиране ћелијске смрти повезане са инфламаторним одговором који укључује активацију каспаза које обрађују гастрин (ГСДМ), омогућавајући формирање пора на плазма мембрани и накнадно ослобађање молекуларних образаца повезаних са оштећењем, као што је висока покретљивост групна кутија 1 (ХМГБ1). Третман ДЦ661 у више ћелијских линија меланома (А375П, А375, ВМ35 и ВМ793) је резултирао активацијом иницијаторске каспазе-8 и -9 и каспазе егзекутора-7, типичне за пироптозу, и произведених цепање ГСДМЕ пуне дужине, сличног обима познатом индуктору пироптозе ПЛКС4720 и ПД0325901 (додатна слика 5А). ДЦ661 је произвео јаче екстрацелуларно ослобађање ХМГБ1 од познатог индуктора пироптозе, БРАФ и МЕК инхибиције у 1% ФБС (15), што одражава функционалну последицу активиране пироптозе. Затим смо тестирали да ли би инхибиција пироптозе помоћу ГСДМЕ КО побољшала цитотоксичне ефекте ДЦ661. Третман ДЦ661 индуковао је акумулацију ЛЦ3ИИ и СКСТМ1/п62 и активацију каспазе, али ослобађање ХМГБ1 је скоро потпуно поништено у ГСДМЕ-КО ВМ35 људским ћелијама, показујући да је постигнута функционална последица инхибиције пироптозе (слика 3Ф). Међутим, третман ДЦ661 је произвео једнаку цитотоксичност у ИУММ1.7 ВТ, празном вектору (ЕВ) и Гсдме КО1 и КО2 ћелијама у 10% и 1% ФБС условима (слика 3Г и додатна слика 5Б). Један уобичајени исход вишеструких облика ћелијске смрти је ослобађање ЛДХ. ДЦ661 је произвео значајно повећање ослобађања ЛДХ, а то се није могло поништити апоптозом, некроптозом или инхибицијом фероптозе (додатна слика 5Ц). Ови резултати су показали да ДЦ661 индукује вишеструке начине ћелијске смрти, укључујући апоптозу и пироптозу, као и некроптозу и фероптозу, али ниједан од ових начина ћелијске смрти није потребан за ДЦ{73}}индуковану ћелијску смрт. Инхибиција катепсина или келација калцијума не спречава смрт ћелије услед пермеабилизације лизозомске мембране. Пошто смо показали да је активација каспазе (која је потребна за апоптозу и пироптозу) неопходна за ћелијску смрт индуковану ДЦ661-, претпоставили смо да ослобађање катепсина из лизозома може изазвати ћелијску смрт зависну од каспазе. Хемијска (ДЦ661) или генетска (ППТ1 сиРНА [сиППТ1]) инхибиција ППТ1 произвела је пермеабилизацију лизозомске мембране (ЛМП), док ХДСФ, мање моћни иреверзибилни инхибитор ППТ1 који се брзо исцрпљује у ћелијској култури, није могао да изазове ЛМП, како је мерено помоћу галектина-3–позитивне пунцта (Слика 4А). ЛМП доводи до ослобађања катепсина и другог лизозомалног садржаја у цитоплазму и сматра се да је кључна проксимална карактеристика ћелијске смрти засноване на лизозомима. ЛМП индукована ДЦ661 била је повезана са значајним повећањем активности цитоплазматског катепсина-Л, која је била значајно блокирана инхибитором цистеин протеазе Е64 (Слика 4Б). Претходни извештаји сугеришу да ослобађање катепсина из сломљених лизозома промовише активацију каспазе, што доводи до апоптотичке смрти ћелије (16–18). Потпуна инхибиција катепсина није спречила цепање каспазе (Слика 4Ц) и није спасила цитотоксичност изазвану ДЦ661-у краткорочним и дугорочним тестовима одрживости код меланома (Слика 4, Д и Е), рака дебелог црева и панкреаса ћелије рака (додатна слика 6, А–Ц). Ови резултати се супротстављају канонском гледишту о смрти ћелија лизозома изазваној ћелијском смрћу посредованом катепсином. Осим ослобађања катепсина из пропуштајућих лизозома, ослобађање калцијума из лизозома је укључено у ћелијску дисфункцију када је ППТ1 оштећен (19). Третман ДЦ661 је довео до екстензивног ослобађања калцијума, што је поништено претходном обрадом ћелијског трајног хелатора калцијума (Ца{101}}), БАПТА-АМ. (Слика 4Ф). Посебно, БАПТА-АМ није спречио ДЦ661-индуковану ЛМП (слика 4Г) или цепање каспазе (додатна слика 6, Д и Е) и, што је најважније, није спасио ДЦ{108}индуковану цитотоксичност ( Слика 4Х). Ови налази су такође примећени у ћелијским линијама РКО и МИА ПаЦа-2, у којима нису примећене значајне разлике у вредностима ИЦ50 са БАПТА-АМ и ДЦ661 (допунска слика 6Ф), што сугерише да је смрт ћелија повезана са ЛМП не зависи од калцијума или катепсина.

Слика 2. ДЦ661-индукована апоптоза и некроптоза. (А)

Слика 3. ДЦ661-индукована фероптоза и пироптоза. (А)

ЛЛП покреће ЛМП. Утврдивши да су инхибитори главних путева ћелијске смрти (апоптоза, некроптоза, фероптоза и пироптоза), катепсини (ПепА и Е64) и хелатори јона (БАПТА-АМ [Ца2+]] и ДФО [Фе{{3} }]) нису спречили ћелијску смрт од ДЦ661 и проналазећи доказе о пероксидацији липида помоћу Ц-11-БОДИПИ, извршили смо глобалну анализу липидома 2 и 4 сата након третмана ДЦ661. ДЦ661 је изазвао рано и трајно повећање од 3- до 10- пута у свакој класи лизофосфолипида (Слика 5А). Насупрот томе, минималне или никакве промене су примећене у класама фосфолипида, укључујући фосфатидилхолин, фосфатидилетаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерол и фосфатидну киселину (допунска слика 7А). Лизофосфолипидне врсте могу да се генеришу помоћу РОС, који оксидише ланац засићених масних киселина који се затим одваја фосфолипазама (20). Да бисмо утврдили да ли антиоксиданси могу да спрече оштећење липида посредовано РОС-ом, истражили смо ДЦ661-индуковану цитотоксичност у присуству пан-РОС чистача Н-ацетилцистеина (НАЦ) (21, 22) и наводних инхибитора пероксидације липида Тролок (23). ) и витамин Ц (аскорбинска киселина) (24, 25). За разлику од било ког другог до сада тестираног агенса, заједнички третман са НАЦ-ом је спасио ДЦ{24}}повезану цитотоксичност у више ћелијских линија (Слика 5Б и Додатна слика 7Б). Дуготрајни ЦФУ тестови су показали да НАЦ, за разлику од свих инхибитора ћелијске смрти, хелатора јона и инхибитора катепсина који су овде тестирани, спречава цитотоксичне ефекте ДЦ661 у ћелијама А375П, РКО, МИА ПаЦа-2, Б16Ф10 и МЦ38 ( Слика 5Ц и Додатна слика 7Ц). Занимљиво је да Тролок и витамин Ц нису спасили цитотоксичност ДЦ661 код хуманог меланома, колоректалног карцинома, ћелија рака панкреаса и меланома миша и ћелија рака дебелог црева (Слика 5Д и Додатна слика 7, Д-Х). Овај диспаритет нас је подстакао да тестирамо да ли НАЦ, Тролок и витамин Ц утичу на ЛМП. Наши резултати су показали да је НАЦ једини антиоксиданс који је значајно смањио ЛМП изазван ДЦ661-(Слика 5Е). Претпоставили смо да ЛЛП покреће производњу ЛМП помоћу ДЦ661, који НАЦ може поништити, али не и Тролок и витамин Ц. За проучавање процеса ЛЛП користили смо флуоресцентну сонду ФОАМ-ЛПО (26), која се специфично локализује на лизозому и производи спектрални помак од 586 до 512 нм (црвена ка зелена) када је изложена липидним пероксидима. Открили смо да је ДЦ661 индуковао ЛЛП у поређењу са контролом (Слика 5Ф). НАЦ је смањио пероксидацију липида у лизозомима ћелија меланома третираних ДЦ661-, док Тролок и витамин Ц нису успели да смање ЛЛП (слика 5Ф). НАЦ, Тролок и витамин Ц сами по себи нису имали значајан утицај на пероксидацију липида. Обарање ППТ1 (додатна слика 8А) или третман са високим концентрацијама ХЦК (допунска слика 8Б) такође је индуковао ЛМП који би могао да се поништи помоћу НАЦ, док хемијска инхибиција УЛК1 није изазвала ЛМП (додатна слика 8Ц). Важно је снижавање сиППТ1 такође укључивало ЛЛП који би се могао поништити помоћу НАЦ-а (додатна слика 8Д) Ови резултати су показали да инхибиција ППТ1 индукује ЛЛП који НАЦ може спасити и вероватно је узрок ЛМП-а изазваног ППТ1- инхибицијом. Даље, ови налази сугеришу да је ЛЛП критичан за смрт лизозомских ћелија.

Кинеска биљка цистанче-антитумор

Увоз цистеина у лизозоме помоћу МФСД12 смањује смрт лизозомских ћелија. Од 3 инхибитора пероксидације липида, само НАЦ је спречио ЛЛП. Недавни извештај је показао да је главни фасилитаторски домен суперпородице који садржи 12 (МФСД12) суштинска компонента увозника цистеина за лизозоме и меланозоме (27). Закључили смо да се НАЦ, или његов метаболит цистеин, транспортује у лизозом преко МФСД12, где се цистеин оксидује у свој дисулфид, цистеин. Да бисмо тестирали ову хипотезу, упоредили смо способност НАЦ-а да спасе ДЦ661 цитотоксичност у сиНТ и сиМФСД12 А375П-хГал3-ЕГФП ћелијама. Наши резултати су показали да је НАЦ спасио ДЦ661-индуковани ЛМП у сиНТ ћелијама, али није спасио ЛМП у ћелијама сиМФСД12 (Слика 6А). НАЦ је смањио ЛЛП ћелија сиНТ-А375П третираних ДЦ661-али не и ћелија сиМФСД12. сиМФСД12 ћелије третиране ДМСО или НАЦ имале су повећан базални ЛЛП (слика 6Б) у поређењу са сиНТ ћелијама. Док је НАЦ спасио ДЦ661 цитотоксичност у сиНТ ћелијама, способност НАЦ-а да спасе ДЦ661 цитотоксичност је потпуно укинута у ћелијама сиМСФД12 (слика 6Ц). Ово је показало да нокдаун МФСД12 блокира цитопротективне ефекте НАЦ-а против ДЦ661. НАЦ се деацетилује ацилазом у цитосолу (28). Да бисмо утврдили да ли третман НАЦ производи акумулацију цистеина или цистина унутар лизозома, користили смо технику лизозомалне имунопреципитације (Лисо-ИП) (29) да пречистимо лизозоме из ДМСО и НАЦ-третираних А375П ћелија (слика 6Д и допунска слика 9А) и извели смо циљана метаболомика за квантификацију НАЦ-а и сродних метаболита. Као што се очекивало, НАЦ је откривен у НАЦ-третираном лизату целих ћелија и повезаним невезаним фракцијама. Нивои Л-цистеина су значајно повећани у лизозомима третираним НАЦ-ом. Л-цистин је био детектован само у лизозомима третираним са НАЦ-ом. Запањујуће је да нисмо пронашли значајно повећање глутатиона (смањеног) у групама које су третиране НАЦ (Слика 6Е); ово је било изненађујуће јер се уобичајено верује да НАЦ третман изазива повећану производњу глутатиона, исправљајући редокс равнотежу. Ови резултати сугеришу да је цистеин увезен у лизозоме преко увозника МФСД12 критичан за спасавање ЛЛП, ЛМП и смрти лизозомских ћелија. ЛЛП је имуноген. Неки облици регулисане ћелијске смрти изазване ДЦ661 (пироптоза, некроптоза, фероптоза) идентификовани су као имуногени. Раније је описана имуногена ћелијска смрт за лекове за хемотерапију на основу карактеристичних карактеристика, које укључују приказ молекуларних образаца повезаних са оштећењем, укључујући експресију ЦАЛР на површини ћелије и ослобађање ХМГБ1 протеина и аденозин трифосфата (АТП) (30). ЦАЛР делује као сигнал „поједи ме“ када је изложен ћелијској површини током ћелијског стреса. Екстрацелуларно ослобађање ХМГБ1 и АТП делује као сигнал "нађи ме" који препознају фагоцитне ћелије. Упоредили смо два модела: ћелије Б16Ф10, које су у моделима сингених тумора скоро потпуно лишене лимфоцита који инфилтрирају тумор, и МЦ38 ћелије, које у моделима сингених тумора имају лимфоците који инфилтрирају тумор. Прво, показали смо да третман ДЦ661 или сиПпт1 значајно индукује експресију ЦАЛР површине која се може потпуно поништити третманом НАЦ у МЦ38 ћелијама (Слике 7, А и Б). Слични налази су примећени у Б16Ф10 ћелијама (Слика 7Ц). Инхибитори главних путева ћелијске смрти (апоптоза, некроптоза, фероптоза и пироптоза) нису успели да спрече површинску експресију ЦАЛР (слика 7Д). Да би се утврдило да ли је имуногена ћелијска смрт изазвана ДЦ661 последица појачане регулације МХЦ класе И, ћелије Б16Ф10 и МЦ38 су третиране са ДЦ661 (3 μМ) или ДМСО током 24 сата. Открили смо да третман ДЦ661 није повећао експресију МХЦ класе И и регулацију имунопротеасома (Слика 7Е и Додатна слика 9, Б и Ц).

Слика 4. Инхибиција катепсина или хелација калцијума не спречавају ћелијску смрт изазвану ДЦ661-. (А)

Да бисмо разумели ефекте инхибиције аутофагије на прајминг Т ћелија, извели смо ин витро експеримент са прајмингом и кокултуром користећи Ц57БЛ6/Ј спленоците као што је претходно описано (31). За прајминг, изложили смо спленоците ДЦ661- или ДМСО третираним Б16Ф10 или МЦ38 ћелијама. Затим, ови припремљени спленоцити су култивисани са живим Б16Ф10 или МЦ38 ћелијама и мерена је цитотоксичност (Слика 8А). Спленоцити напуњени ДЦ661-третираним Б16Ф10 ћелијама произвели су значајно повећање ИФН-а у поређењу са спленоцитима изложеним Б16Ф10 ћелијама третираним ДМСО. Убијање пролиферирајућих Б16Ф10 ћелија посредовано Т ћелијама значајно је повећано у ДЦ661-примираним спленоцитима у поређењу са ДМСО-примираним спленоцитима (Слика 8, Б и Ц). Ћелије МЦ38 третиране са ДЦ661 произвеле су још више цитотоксичности за ИФН и Т ћелије у поређењу са ћелијама Б16Ф10 (Слика 8, Д и Е). Третман НАЦ-ом са ДЦ661 био је у стању да потпуно поништи ослобађање ИФН-а из спленоцита и цитотоксичност Т ћелија са тупим прајмером (Слика 8, Ф и Г). Обарање калретикулина од стране сиЦалр-а у МЦ38 ћелијама (допунска слика 9Д) поништило је ефикасност примене ДЦ661 третмана и значајно смањило цитотоксичност припремљених Т-ћелија (слика 8, Х и И). Узети заједно, ови подаци подржавају механичку улогу регулације ЦАЛР-а повезане са ЛЛП-ом у промовисању имунитета Т ћелија антитуморских ћелија. Затим смо проширили ове ин витро налазе на ин виво студију антитуморске вакцинације на имунокомпетентним и имунодефицијентним моделима мишева. За овај тест, ин витро замрзавањем-одмрзнуте или ДЦ661-третиране Б16Ф10 или МЦ38 ћелије су убризгане сц на леви бок да би се заштитиле имунокомпетентне Ц57БЛ/6 или НОД/СЦИД мишеве од поновног изазивања са живим туморским ћелијама исте врсте које су убризгане 7 дана касније у десни бок (слика 9А). Ћелије Б16Ф10 третиране ДЦ661- нису успеле да спрече одбацивање тумора упркос ин витро тестовима, што сугерише да је ДЦ661 индуковао имуногену ћелијску смрт (слика 9Б и допунска слика 9Е). Насупрот томе, инокулација једног бока са ДЦ661-третираним МЦ38 ћелијама је промовисала потпуно одбацивање живих МЦ38 ћелија имплантираних на супротном боку (слика 9Ц и додатна слика 9Ф). Да бисмо утврдили да ли је адаптивни имунитет био критичан за ефекат вакцине који изгледа да ДЦ661 има са туморима МЦ38, поновили смо експеримент на мишевима НОД/СЦИД. Запањујуће је да смо открили да ћелије МЦ38 третиране ДЦ661- нису изазвале одбацивање тумора поновног изазивања код имунодефицијентних НОД/СЦИД мишева (Слика 9Д и Додатна слика 9Г), што указује да је за посматрани ефекат вакцине потребан адаптивни имунитет. Да бисмо тестирали робусност овог налаза, одабрали смо другу добро познату ћелијску линију рака миша, ЦТ26, и извели експеримент вакцинације као горе. Као што се очекивало, имплантација ДЦ661-третираних ЦТ26 ћелија у један бок миша произвела је ефекат сличан вакцини и спречила израстање живих ЦТ26 ћелија имплантираних на другом боку (слика 9Е и додатна слика 9Х). Наши налази сугеришу да је ДЦ661-индукована ЛЛП критична за имуногену ћелијску смрт посредовану ЛМП-ом, која је преокренута увозом цистеина у лизозом помоћу лизозомалног транспортера МФСД12 (слика 9Ф).

Дискусија

Чини се да је лизозомална инхибиција обећавајући терапијски приступ у претклиничким студијама, а клиничка испитивања ХЦК-а су дала охрабрујуће, али помешане резултате (1, 32). ППТ1 је молекуларна мета ХЦК, а снажнији инхибитори ППТ1, као што су ДЦ661 (2) и ГНС561 (3), индукују ћелијску смрт посредовану ЛМП ин витро. Прецизан механизам смрти лизозомске ћелије и његова улога у имуногености тумора није у потпуности разјашњен. Антитуморски имунитет се појачава када се инхибиција аутофагије комбинује са имунотерапијом (9, 10, 31). Предложени механизми за ћелијску интринзичну имуногеност након инхибиције аутофагије укључују МХЦ класе И и регулацију имунопротеасома, који подржавају побољшану обраду и презентацију антигена. Поред тога, губитак протеина аутофагије или инхибиција аутофагије хлорокином је повећао одговор ЦД8+ Т ћелија повећањем површинских нивоа МХЦ класе И у дендритским ћелијама (33). Раније смо показали да системска инхибиција ППТ1 може реполаризовати макрофаге од М2 до М1 фенотипа. ППТ1 инхибитори могу повећати нивое СТИНГ-а, што доводи до ослобађања ИФН-а и повећања убијања посредованог Т ћелијама у моделима меланома (31). Овде смо показали да сам ЛЛП производи интринзични имуногени облик смрти ћелије туморске ћелије. Открили смо да је лизозомална инхибиција изазвала врло мало промена протеина у ћелијама рака, а најзначајнији повишени протеини су укључивали рецепторе аутофагије и регулаторе апоптозе. Наш приступ који је циљао неке од ових гена у различитим функцијама показао је да протеини изазвани лековима вероватно нису главни регулатори ћелијске смрти. Генетска инхибиција УЛК1 или АТГ7 такође није спасила цитотоксичност ДЦ661. Показали смо да лизозомална инхибиција активира вишеструке облике програмиране ћелијске смрти, укључујући апоптозу, некроптозу, фероптозу и пироптозу, али сваки од њих је био неопходан за цитотоксичност изазвану лековима. Треба напоменути да се програмирани механизми ћелијске смрти могу преклапати и коциљање вишеструких механизама ћелијске смрти може обезбедити цитопротекцију против ћелијске смрти након пермеабилизације лизозомске мембране. Наш рад је искључио механизме зависне од катепсина и калцијума за лизозомалну ћелијску смрт и истакао важност ЛЛП-а као критичне детерминанте ћелијске смрти. Пронашли смо доказе о ЛЛП-у који је био реверзибилан антиоксидансом који је транспортован у лизозом, НАЦ и био је критичан за пермеабилизацију лизозомалне мембране и цитотоксичност. НАЦ је био једини агенс који је могао да ублажи или поништи ћелијску смрт изазвану ДЦ661-и овај капацитет је зависио од присуства лизозомалног цистеинског транспортера МФСД12. Недостатак лизозомске пенетрације је вероватно разлог зашто други наводни инхибитори пероксидације липида, Тролок и витамин Ц, нису били у стању да спрече цитотоксичност ДЦ661. НАЦ се претвара у цистеин, који се увози у лизозоме и оксидира у свој дисулфидни облик, цистин. Цистин се извози у цитосол помоћу другог лизозомалног транспортера, цистинозе, где се редукује на цистеин који ремобилише унутрашње изворе хранљивих материја, реактивира мету комплекса рапамицина 1 и промовише аутофагију (34). Овај оксидационо-редукциони циклус од цистеина до цистина (лизозома) и назад до цистеина (цитосол) могао би бити могући механизам спасавања НАЦ-а против ДЦ661 цитотоксичности или општије лизозомске повреде у другим контекстима болести где се НАЦ показао корисним у терапији (35) . НАЦ не само да је обрнуо ДЦ661-индуковане ЛЛП и ЛМП, већ и површинску експресију маркера имуногене ћелијске смрти калретикулина. Експресија ЦАЛР протеина на површини ћелије је била потребна за појачану цитотоксичност посредовану Т ћелијама индуковану ДЦ661-примираним спленоцитима, показујући да лизозомална инхибиција производи специфичан облик интринзичне имуногености ћелије.

Док су претходне студије показале да лизозомална инхибиција може побољшати антитуморску активност инхибиције имунолошке контролне тачке код установљених тумора бока (9, 31), наша студија је прва по нашем сазнању која показује ефекат сличан вакцини за МЦ38 туморе, али не и за туморе Б16 у туморске ћелије претходно третиране са ДЦ661 пре имплантације. Ово показује да смрт лизозомских ћелија може изазвати ћелијску интринзичну имуногеност, али ове промене саме по себи нису довољне да преокрену „имуно-хладно“ туморско микроокружење у „имуно-вруће“ туморско микроокружење. Наше претходне студије на моделима микроокружења тумора „имуне хладноће“ Б16 и БРафЦА ПтенлокП Тир: ЦреЕРТ2 генетски модификовани модели миша (31) су показале да системска лизозомална инхибиција производи ефекте на макрофаге повезане са тумором и ћелије изведене из мијелоидних ћелија које су биле довољне за супресију ћелија. ефикасност имунотерапије. Може бити да ћелијска интринзична имуногеност такође игра улогу у овим имуним хладним туморима који постају осетљивији на ИЦД након лизозомалне инхибиције. Ефекат инхибиције лизозома сличан вакцини уочен у контролисаном лабораторијском окружењу може, али не мора да се пренесе у клинику, али би могао да објасни зашто су неки пацијенти лечени дабрафенибом, траметинибом и ХЦК у претходно леченом БРАФ мутантном меланому имали тако дубок и издржљив одговор на овај режим (32). Потребно је даље истраживање да би се разумело како инхибиција ППТ1 производи лизозомални РОС и пероксидацију липида. ППТ{15}}зависна регулација В-АТПазе и закисељавања лизозома није довољно објашњење јер бафиломицин инхибира лизозомско закисељавање, али не производи ЛМП (подаци нису приказани). Импликације ових налаза сугеришу да се инхибитори лизозома који повећавају интринзичну имуногеност туморских ћелија могу рационално комбиновати са терапијама које повећавају активацију Т-ћелија, или инфилтрацију у микроокружење тумора, потенцијално дајући синергистичке ефекте.

Слика 5. Н-ацетил цистеин спречава ћелијску смрт изазвану ДЦ661-. (А)

Методе

Ћелијска култура. Хуман А375П (ЦРЛ-3224), РКО (ЦРЛ-2577), ДЛД-1 (ЦЦЛ- 221), МИА ПаЦа-2 (ЦРЛ-1420 ), А549 (ЦРМ-ЦЦЛ-185) и ћелијске линије миша Б16Ф10 (ЦРЛ-6475) су купљене од АТЦЦ. Људске линије А375 (ЦРЛ-1619, АТЦЦ), ВМ35, ВМ793 и мишје ИУММ1.7 (ВТ, Гсдме ЕВ и Гсдме КО1 и КО2) су добијене у компанији. Мишје ћелије МЦ38 и ЦТ26 обезбедио је Анди Минн, Универзитет у Пенсилванији. ФЛ5.12 и ИЛ-3–зависне Бак−/−Бак−/− (Бак/Бак ДКО) примарне ћелије коштане сржи добијене су од Катхрин Е. Веллен, Универзитет у Пенсилванији. Људску ћелијску линију Панц-1 (ЦРЛ-1469, АТЦЦ) обезбедио је Бен З. Стангер, Универзитет у Пенсилванији. Ћелијска линија миша ИУММЕР 1.7 је добијена од Ксиаовеи (Георге) Ксу, Универзитет у Пенсилванији. Све ћелијске линије су два пута годишње тестиране на микоплазму од стране центара Универзитета у Пенсилванији и потврђене су коришћењем кратких тандем поновљених отисака прстију од стране језгра Вистар Института Геномицс. А375П, РКО, ДЛД-1, А549, ЦТ26, ФЛ5.12 и Бак/Бак ДКО ћелијске линије су култивисане у РПМИ 1640 (Инвитроген, 11875); А375, МИА ПаЦа-2, Панц-1, Б16Ф10 и МЦ38 ћелијске линије су култивисане у ДМЕМ (Инвитроген, 11995); и ћелије ИУММЕР1.7, ИУММ1.7 ВТ, Гсдме ЕВ и Гсдме КО1 и КО2) (15) су култивисане у ДМЕМ/Ф12 50/50 (Цорнинг, 10-092-ЦВ). Подлога за културу је допуњена са 10% феталног говеђег серума (12306Ц, МиллипореСигма) и 1× антимикотичког раствора антибиотика (Гибцо, 15140-122). ФЛ5.12 и Бак/Бак ДКО ћелијске линије су одржаване у комплетном РПМИ медијуму са додатком 50 μМ -меркаптоетанола (Лифе Тецхнологиес, ​​21985-023), 10 мМ ХЕПЕС (Х3537, МиллипореСигма) и 0,35 нг/мЛ и /мЛ ИЛ-3, респективно. Ћелијске линије ИУММЕР1.7 и ИУММ1.7 (ВТ, Гсдме ЕВ и Гсдме КО) су одржаване у комплетном медијуму са додатком 1× МЕМ НЕАА (Гибцо, 11140-050). ВМ35 и ВМ793 ћелије су узгајане у МЦДБ медијуму 153 (МиллипореСигма, М7403), који садржи 10% ФБС у 1× Леибовитз Л-15 медијуму (Цорнинг, 10-045-ЦВ), 7,5% в/в натријум бикарбоната ( Цорнинг, 25-035-ЦИ), 1× антимикотички раствор антибиотика (Гибцо, 15140-122) и 5 ​​уг/мЛ инсулина (МиллипореСигма, И0516). Ћелије су узгајане на 37 степени у присуству 5% ЦО2. Хемикалије и реагенси. Купљене хемикалије су укључивале ХЦК сулфат (Спецтрум Цхемицалс, 747-36-4) и ДЦ661 (Селлецкцхем, С8808). Флуо-4, АМ (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Ф14201) је коришћен за бојење ћелија на калцијум према упутствима произвођача. Листа антитела и инхибитора је дата у Додатној табели 1 и Додатној табели 2.

Слика 6. НАЦ поништава ЛЛП на МФСД12-зависан начин. (А–Ц)

Екстракција и дигестија протеина за течну хроматографију-тандемску анализу масене спектрометрије за протеомику. {{0}}.7 × 106 А375П ћелија меланома је узгајано у посудама за културу од 60 мм. Ћелије су третиране ДМСО (контрола), ДЦ661 (3 μМ), ХЦК (10 μМ) или ХЦК (3{{70}} μМ) током 24 сата у приближно 5{{ 112}}% ушћа. Замрзнуте ћелијске пелете су лизиране са 50 мМ Трис пХ 7,4, 1% СДС, 150 мМ НаЦл, 1 мМ ЕДТА, 0.15 мМ ПМСФ, 1 уг/мЛ пепстатина, и 1 уг/мЛ леупептина. Пречишћени лизати (10 уг сваки) су подвргнути електрофорези 0,5 цм у бис-трис гел након чега је уследило фиксирање и бојење колоидним Цоомассие-ом. Свака гел трака од 0,5 цм је изрезана, обојена, редукована трис (2-карбоксиетил) фосфином, алкилована јодоацетамидом и дигестирана трипсином као што је претходно описано (36). Дигести (1 уг) су анализирани течном хроматографијом-тандемском масеном спектрометријом (ЛЦ-МС/МС) на К-Екацтиве Плус масеном спектрометру (Тхермо Фисхер Сциентифиц) у складу са наноАКУИТИ УПЛЦ (Воде). Аналитичко одвајање је изведено на колони 1,7 μм × 250 мм Пептиде БЕХ Ц18 (Ватерс, 186003546) користећи 245-минутни градијент са 0,1% мравље киселине у води (мобилна фаза А) и ацетонитрилом (мобилна фаза Б) на следећи начин : 5%–30% Б током 225 минута, 30%–80% Б током 5 минута, 15-минутно задржавање на 80% Б и повратак на почетне услове. Пуни МС спектри су добијени при резолуцији 70,000, са опсегом скенирања од 400–2,000 м/з, циљаном аутоматском контролом појачања од 3 × 106 јона и максималним временом убризгавања од 50 милисекунди. МС2 спектри зависни од података су добијени за 20 најзаступљенијих јона при резолуцији од 17.500, са ширином изолације од 1,5 м/з, циљаном аутоматском контролом појачања од 5 × 104 јона и максималним временом убризгавања од 50 милисекунди. Подударање пептида је постављено на предност, а недодељени и једноструко наелектрисани јони су одбијени (37). Необрађени МС подаци су анализирани коришћењем МакКуант 1.6.5.0 (хттпс:// маккуант.нет/персеус/) са Унипрот базом података људских секвенци (приступљено 10. октобра 2019) и уобичајеном базом података о загађивачима, укључујући трипсин, кератине, говеђе протеине, и микоплазма (38). Специфичност триптичног пептида са максимално 2 пропуштена цепања, фиксна модификација на цистеин (карбамидометилација) и варијабилна оксидација метионина или Н-терминална ацетилација су коришћени у потрази (39). За пептиде и протеине је коришћена граница од 1% ФДР. Меч између трчања је омогућен; протеини су квантификовани коришћењем квантитације без ознака (40). Статистичка анализа је извршена коришћењем Персеуса 1.6.2.3 (хттпс:// маккуант.нет/персеус/) (41, 42). Протеини су морали да буду идентификовани са најмање 3 јединствена пептида и да имају 3 важеће вредности (квантификација која није нула) у оквиру групе узорака, а контаминанти и реверзни протеини су филтрирани из скупа података. Вредности које недостају су импутиране из нормалне дистрибуције. Поређења у паровима између услова су обављена на нивоу протеина коришћењем 2-репог Студентовог т-теста са ФДР-ом заснованим на пермутацији са с0=0.1 и 250 рандомизација. Значајне промене су дефинисане као ФДР мањи од 5% и промена апсолутног пута већа од 1,5 или 2,0, како је наведено. Лисо-ИП. А375П ћелије су инфициране пЉЦ5-Тмем192-3кХА лентивирусом и одабране коришћењем 1 мг/мЛ пуромицина (МиллипореСигма, П4512). Приближно 3 × 106 ХА-означених ћелија А375П третиране су или са 10 мМ НАЦ или контролом воденог носача током 24 сата у претходно описаним условима културе. После третмана, ћелије су испране у ПБС, сакупљене у 0,5 мЛ хладног КПБС, и нежно хомогенизоване коришћењем 20 потеза у 2 мЛ Доунце хомогенизатору. Око 2,5% хомогената је резервисано за анализу лизата целе ћелије, а остатак је центрифугиран на 3,000г током 2 минута на 4 степена да би се уклонили остаци ћелијске мембране. Супернатант хомогената је затим пребачен у чисту епрувету од 1,5 мЛ и инкубиран са 50 μЛ анти-ХА перлицама (Пиерце, 88836) или анти-ДДК/Флаг куглицама (ОриГене, ТА150042) током 15 минута на 4 степена. Узорци су затим преципитирани стављањем епрувета на ДинаМаг (Тхермо Фисхер Сциентифиц, 12321Д) и лагано љуљани 2 минута на собној температури. Супернатант је резервисан за анализу невезаних фракција. ИП је испран 3 пута са КПБС који садржи 8 мМ ЦаЦл2. Лизо-ИП је екстрахован у 80% МеОХ за метаболомичку анализу. Екстракција и анализа липида коришћењем ЛЦ-МС/МС за глобални липидом. Ћелије меланома А375П су засејане у посуде од 60 мм при 0, 7 × 106 ћелија по посуди. Када су ћелије биле на приближно 50% конфлуенције, третиране су ДМСО (контрола), ДЦ661 (3 μМ) или ХЦК (30 μМ) током 24 сата. Ћелије су испране 2 пута са ХБСС, стругане у ледено хладан метанол и пренете у стаклене епрувете за екстракцију липида са хлороформ/метанол/0,88% НаЦл (2:1:1) који садржи ЕкуиСПЛАСХ интерни липидни стандард (Аванти Полар Липидс). Узорци су вортексирани, а затим соницирани у воденом купатилу 5 минута на леду. После центрифугирања на 500 г током 15 минута на 40 степени, доња фаза је пребачена у другу стаклену епрувету. Горња фаза је поново екстрахована коришћењем синтетичке доње фазе. После соникације и центрифугирања, доња фаза је комбинована са првом сакупљањем ниже фазе. Узорци су осушени под азотом, ресуспендовани у 10% хлороформу/90% метанолу и пребачени у стаклене ЛТК бочице. Узорци липида су анализирани на Тхермо Фисхер Сциентифиц КЕкацтиве ХФ-Кс масеном спектрометру и Ванкуисх Хоризон УХПЛЦ систему. За аналитичко одвајање коришћена је колона Аццуцоре Ц30 (2,1 мм × 150 мм, Тхермо Фисхер Сциентифиц) са 50:50 ацетонитрил/вода и 88:10:2 изопропанол/ацетонитрил/вода, од којих свака садржи 5 мМ амонијум формата и 0,1% мравље киселине. ЛЦ-МС/МС подаци су прикупљени одвојено у позитивним и негативним поларитетима са следећим параметрима инструмента: МС1 скенирање 120,000 резолуција; МС2 зависан од података о 20 најзаступљенијих јона у резолуцији од 15,000; 0,4 м/з ширина изолације; и степенасту нормализовану енергију судара од 20:30:40 (43).

Слика 7. Н-ацетил цистеин спречава површинску експресију калретикулина изазвану ДЦ661-. (А–Д)

Липиди су идентификовани и квантификовани коришћењем ЛипидСеарцх 4.2 (Тхермо Фисхер Сциентифиц). Идентификоване врсте липида су филтриране према очекиваним адуктима и степену идентификације на основу класе. Површине пикова су нормализоване према ЕкуиСПЛАСХ стандардима за подржане класе и даље нормализоване на основу укупне површине за сваки узорак да би се исправиле варијације у броју ћелија. Статистичка анализа је извршена на лог-трансформисаним подацима коришћењем Персеуса 1.6.2.3 (хттпс://маккуант.нет/персеус/) (41, 42). Екстракција и анализа метаболита коришћењем ЛЦ-МС/МС за метабалон. Поларни метаболити су екстраховани из целих ћелија, Лисо-ИП невезаних фракција и Лисо-ИП везаних узорака коришћењем 80% метанола и чувани су на –8{{30}} степени пре течне хроматографије –масена спектрометрија (ЛЦ-МС) анализа. Екстракти су анализирани помоћу ЛЦ-МС помоћу Тхермо Сциентифиц К-Екацтиве ХФ-Кс масеног спектрометра са ХЕСИ ИИ сондом у складу са Тхермо Ванкуисх Хоризон УХПЛЦ системом. ЛЦ одвајање је изведено коришћењем ЗИЦ-ХИЛИЦ колоне (2,1 мм × 150 мм, величина честица 5 μм, ЕМД Миллипоре) са ЗИЦ-ХИЛИЦ заштитном колоном (2,1 мм × 20 мм, ЕМД Миллипоре) држаном на 45 степени са брзином протока од 0,2 мЛ/мин. Хроматографија је изведена у киселим условима да би се смањила реактивност тиолних група. Мобилна фаза А је била вода, а Б је био ацетонитрил, обе садрже 0,1% мравље киселине. ЛЦ градијент је био 85% Б током 2 минута, 85% Б до 20% Б током 15 минута, 20% Б до 85% Б током 0,1 минута и 85% Б током 8,9 минута. Аутосамплер је држан на 4 степена, а по анализи је убризгано 4 μЛ сваког узорка. Коришћени су следећи МС параметри: брзина протока гаса у омотачу, 40 АЈ; проток помоћног гаса, 10 АЈ; брзина протока гаса за чишћење, 2 АЈ; температура помоћног гасног грејача, 350 степени; напон распршивања, 3,75 кВ за позитивни режим и 3,5 кВ за негативан режим; температура капилара, 375 степени; и ниво РФ левка, 40%. Сви узорци су анализирани потпуном МС са променом поларитета. Пуни МС скенирања су добијена од 65 до 975 м/з при резолуцији 120,000 са циљем аутоматске контроле појачања од 1 × 106 јона и максималним временом убризгавања од 100 милисекунди. Необрађени подаци су анализирани коришћењем ТрацеФиндер 4.1 (Тхермо Фисхер Сциентифиц). Циљани метаболити су идентификовани тачном масом и временом задржавања у њиховом жељеном поларитету на основу аналитичких стандарда. Детекција пикова је користила ИЦИС алгоритам са изравнавањем од 1. Релативна квантификација је извршена коришћењем интегрисане површине пика, а ове вредности су кориговане на укупну количину по узорку (дефинисану као укупна површина пика). ППТ1-ЦРИСПР/Цас9 уређивање. А375П ППТ1-нециљне и КО ћелије су припремљене као што је претходно описано (44). пСпЦас9(ББ)-2А-Пуро (ПКС459) је поклон од Фенг Зханга (Аддгене плазмид, 48139). Водећи РНК олиго (ИДТ) су жарени, фосфорилисани, а затим лигирани у БбсИ дигестирани и дефосфориловани пКс459 плазмид према Зханг лабораторијским протоколима, доступним преко Аддгене-а. Везани плазмиди су трансформисани у Стбл3 ћелије (Инвитроген). Секвенцирање препарата плазмида потврдило је присуство жељених секвенци водећих РНК. А375П ћелије су трансфектоване коришћењем Липофецтамине 3000 (Инвитроген, Л3000015), након чега је уследила селекција пуромицина. Испитивачи су потврдили уређивање гена ППТ1 од стране ЦРИСПР/Цас9, а обарање ППТ1 је потврђено Вестерн блотингом са ППТ1 антителом (Оригене). Секвенце за олиго РНА водича су следеће: нециљана РНК за вођење напред (ЦАЦЦГТАГЦГААЦГТГТЦЦГГЦГТ), нециљана РНК за вођење уназад (АААЦАЦГЦЦГГАЦАЦГТТЦГЦТАЦ), људска ППТ1 водећи РНК 1 напред (ЦАЦЦГТТГГАЦТЦЦЦТЦГАТГЦЦЦ), људски ППТ1ГАЦТЦЦТЦГАТГЦЦЦ), људски ППТ1ГАЦТЦЦТЦГАТГЦЦЦ), људски ППТ1ГАЦТЦЦТЦГАТГЦЦЦ, људски ППТ1ГАЦТЦЦТЦГАТГЦЦЦ, људски ППТ1ГАПГПТГАЦГААЦГАЦГААА, људски ППТ1ГПТ1ГПТГТАГЦАГАЦГА РНК 3 напред (ЦААЦЦГЦЦЦТЦГТГЦААГЦЦГААТАЦ), а хумани ППТ1 води РНК 3 уназад (АААЦГТАТТЦГГЦТТГЦАЦГАГГЦ). Клонови узгојени из појединачних ћелија коришћени у овом раду укључују следеће: клон Ц8 је људски водич 1 и клон Б5 је људски водич 3. Имуноблотирање. Милион ћелија је постављено у посуду од 10 цм, а третмани су дати следећег дана; ћелије су сакупљене стругањем. Лизати целих ћелија су припремљени коришћењем СДС пуфера за лизу. Концентрација протеина је мерена коришћењем Пиерце БЦА Протеин Ассаи Кит (Тхермо Фисхер Сциентифиц, 23225). 30–50 уг протеина је коришћено за СДС-ПАГЕ и пребачено је на ПВДФ мембрану (Био-Рад, 1620177). Мембрана је блокирана коришћењем 5% БСА или 5% обраног млека, према оптимизованим условима, и инкубирана са примарним антителом преко ноћи на 4 степена. ПВДФ мембране су испране са 1× ТБС-Т (Целл Сигналинг Тецхнологи Инц., ЦС-9997) и инкубиране 1 сат на собној температури са секундарним антителом специфичним за врсту ХРП коњугованим. Мембране су затим испране и развијене коришћењем Пиерце ЕЦЛ Вестерн Блоттинг супстрата (Тхермо Фисхер Сциентифиц, 32106) и ауторадиографских филмова (Лаб Сциентифиц Инц., КСАР АЛФ 1318). За студије пироптозе, протеински лизати су раздвојени помоћу СДС-ПАГЕ и пребачени на ПВДФ мембране. Након блокирања у 5% БСА, ПВДФ мембране су инкубиране са назначеним примарним антителима преко ноћи на 4 степена, испране у ПБС/Твеен и инкубиране са секундарним антителима везаним за пероксидазу. Имунореактивност је откривена коришћењем ХРП-коњугованих секундарних антитела (ЦалБиоТецх), хемилуминисцентног супстрата (Тхермо Фисхер Сциентифиц) и ЦхемицДоц МП система за снимање (Био-Рад). За експерименте који укључују супернатант, ћелије су култивисане у медијуму без ФБС да би се избегло изобличење СДС-ПАГЕ. Ћелијски супернатанти су сакупљени и центрифугирани 10 минута на 500 г на 4 степена да би се уклонили ћелијски остаци. Добијени супернатанти су концентровани 10× користећи Амицон Ултра 10К (МиллипореСигма) центрифугирањем током 30 минута на 4,500 г на 4 степена. Концентрати су помешани са пуфером за узорке и анализирани помоћу Вестерн блотинга као што је горе описано. Бојење протеинским гелом је изведено коришћењем Понцеау црвеног бојења. Тест активности ЛМП и катепсина Л. Хумани пЕГФП-хГал3 плазмид је поклон Тамотсу Иосхиморија (Аддгене плазмид, 73080) и коришћен је за креирање линије А375П-Галецтин{139}}. Купљена је окосница контролног плазмидног вектора пЕГФП-Ц1 (ново пролабс, В012024). Плазмиди су трансфектовани (1 уг/мЛ) у А375П ћелије коришћењем Липофецтамине 2000 (Инвитроген, 11668019) према протоколу произвођача; трансфектоване ћелије су стабилно одабране коришћењем Г418 (Гибцо, 10131035). За ЛМП, избројано је укупно 25 А375П-галектин-3 пунцта-позитивних ћелија у више поља слике. Проценат пункта позитивних ћелија израчунат је у сваком пољу посебно, а за сваку групу израчунат је просечан проценат. Комплет за испитивање Магиц Ред Цатхепсин Л (Абцам, аб270774) је коришћен према протоколу произвођача. Ћелије су снимљене под Зеисс Акио Обсервер 7 инвертованим микроскопом. Магиц Ред сирови интегрисани интензитет је израчунат коришћењем софтвера Фији - ИмагеЈ (НИХ). МТТ (3-[4, 5-диметилтиазол-2-ил]-2, 5-дифенил тетразолијум бромид) тест виталности ћелија. 2000 ћелија је постављено у три примерка у сваки бунар 96-плоче са бунарима, а 3-дневни МТТ тестови су изведени коришћењем комплета за виталност ћелија (Роцхе, 11465007001) према протоколу произвођача. Предтретман инхибиторима је дат 1 сат, након чега је уследила котретман ћелија инхибиторима са или без ДЦ661. За израчунавање ИЦ50 коришћена је метода нелинеарне регресије (прилагођавање криве).

цистанцхе тубулоса-побољшава имуни систем

Кликните овде да видите производе Цистанцхе Енханце Иммунити

【Затражите више】 Е-пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Вхатс Апп: 0086 18599088692 / Вецхат: 18599088692

Тест формирања колонија. 2,000 ћелије по бунарчићу су засејане у 6-плочу са бунарима и третиране су следећег дана; ћелије су држане под третманом укупно 8 дана. Колоније формиране у сваком бунарчићу су испране ПБС-ом, фиксиране хладним метанолом на –20 степена 20 минута и обојене 0,5% воденим раствором Цристал виолет (В5265; МиллипореСигма).

Тест искључења боје трипан плаве боје. Реакциона смеша за тест трипан плавог је припремљена мешањем 1 дела 0.4% трипан плавог (25- 900-ЦИ, Цорнинг) и 1 дела разблажених узорака ћелија. Смеша је инкубирана 1 минут, а ћелије су бројане на Целлометер Висион (Некцелом, Висион-310-0208).

Слика 8. ДЦ661-индукована површинска експресија калретикулина прима Т ћелије против туморских ћелија. (А)

Слика 9. Инокулација ћелија третираних ДЦ661- доводи до одбацивања тумора у специфичним контекстима. (А)

ПЕНА-ЛПО. ЛЛП је проучаван коришћењем флуоресцентне сонде, ФОАМЛПО. ФОАМ-ЛПО је синтетизован као што је претходно описано (26). Ћелије су култивисане на μСлиде са 8 јажица (ибид, 80807) и третиране инхибиторима и са или без ДЦ661. Ћелије су инкубиране са медијумом који садржи ФОАМ-ЛПО (1 М) у атмосфери од 5% ЦО2 и 95% ваздуха током 5 минута на 37 степени. Ћелије су два пута испране са медијумом, а затим су ћелије посматране под микроскопом (Зеисс Акио Обсервер 7 инвертирани микроскоп) да би се открило померање флуоресценције са 586 на 512 нм као одговор на ЛЛП. кРТ-ПЦР и прајмери. А375П (3 × 105) ћелије су култивисане у посудама од 60 мм и третиране са ДМСО или ДЦ661 (3 μМ) током 24 сата. Укупна РНК је изолована комплетом за изолацију РНК (КИАГЕН, 74134) према протоколу произвођача. цДНК је синтетизована коришћењем иСцрипт комплета реверзне транскриптазе са 500 нг пречишћене РНК према протоколу произвођача (Тхермо Сциентифиц, К1642). кПЦР реакција је постављена коришћењем СИБР Греен ПЦР Мастер Мик-а (БиоРад, 1725121) који садржи 1 μЛ цДНК. Сва мерења су обављена у три примерка, а БАЦТИН је коришћен као интерни стандард за ΔЦТ прорачуне. Анализа експресије гена је урађена коришћењем следећих прајмера: ПТГС2/ЦОКС-2 напред (ЦГГТГАААЦТЦТГГЦТАГАЦАГ), ПТГС2/ЦОКС-2 реверзно (ГЦАААЦЦГТАГАТГЦТЦАГГГА), ЦАРС напред (ЦТГГАЦТАЦТЦЦАГЦААЦАЦЦА), ЦАРС назад (ЦТГГАЦТАЦТЦЦАГЦААЦАЦЦА), ЦАРС назад (ГТЦЦАГАЦГАЦГАЦГГАЦЦАГГА напред), (ГТГГТГАЦГЦТЦЦТТГААГАТЦ), ЦХАЦ1 уназад (ГААГГТГАЦЦТЦЦТТГГТАТЦГ), БАЦТИН унапред (ЦААЦТГГГАЦГАЦАТГГАГААААТ) и БАЦТИН уназад (ЦЦАГАГГЦГТАЦАГГГАТАГЦАЦ).

сиРНА трансфекција. Студије генетског нокдауна за хумане УЛК1, АТГ7, ТАКС1БП1, БНИП3, ППТ1 и МФСД12 су спроведене у А375П ћелијским линијама. Студије генетске инхибиције за мишји Ппт1 и Цалретицулин су спроведене у МЦ38 ћелијама. Нециљна сиРНА (сц{{10}}), људска УЛК1 (сц-44182), АТГ7 (сц-41447), ТАКС1БП1/Т6БП (сц-106831), БНИП3 (сц{{20}}), ППТ1/ЦЛН1 (сц-105216), МФСД12 (сц-97888), миш Ппт1/Цлн1 (сц-142398) и Цалретицулин /Цалрегулин (сц-29895) сиРНА су купљене од Санта Цруз Биотецхнологи. Ове сиРНА се састоје од скупова од 3-5 циљно специфичних сиРНА. Проточна цитометрија. Индукција фероптозе је мерена коришћењем Ц11- БОДИПИ (БОДИПИ 581/591 Ц11, Тхермо Фисхер Сциентифиц, Д3861). А375П ћелије су засејане у 6-плочу са бунарима и третиране ДМСО, феростатином{{40}} (10 μМ), рокстатином за усне-1 (2 μМ), еластином (5 μМ ), ДЦ661 (3 μМ) или комбинација током 24 сата. Ћелије су сакупљене центрифугирањем на 300 г током 5 минута. Ћелије су ресуспендоване у 500 μЛ 1Кс ХБСС (Цорнинг, 21-023-ЦВ) који садржи 1 μМ Ц11-БОДИПИ и инкубиране на 37 степени 15 минута. Ћелије су пелетиране и ресуспендоване у 500 μЛ 1Кс ХБСС, а интензитет флуоресценције је мерен на БД ЛСРИИ цитометру коришћењем 530/30 Блуе (Флов Цоре Фацилити Универзитета у Пенсилванији). Квантификација експресије калретикулина на површини ћелије за имуногену ћелијску смрт је изведена као што је претходно описано (45) помоћу проточне цитометрије. Ћелије Б16Ф10 или МЦ38 су култивисане и третиране са НАЦ (10 мМ) или ДЦ661 (3 μМ) током 24 сата. МЦ38 ћелије су третиране са сиПпт1 или сиНТ током 48 сати у присуству или одсуству 10 мМ НАЦ током 24 сата. Ћелије су обојене ЦАЛР антителом (Целл Сигналинг Тецхнологи, 12238), Алека Флуор 647 козјим другим антителом против зеца (Инвитроген) и пропидијум јодидом (ПИ) (Биолегенд, 421301). Обојени узорци су добијени на БД ЛСРИИ проточном цитометру коришћењем 710/50 плаве и 670/30 црвене да би се ухватила ПИ и ЦАЛР флуоресценција, респективно (установа Флов Цоре Универзитета у Пенсилванији), а анализа је била ограничена на ЦАЛР-позитивне и ПИ-негативне ћелије да би се избегли лажно позитивни догађаји. Прајминг Т ћелија и проценат цитотоксичности. Б16 или МЦ38 туморске ћелије (5 × 104) су култивисане и третиране са НАЦ (10 мМ) или ДЦ661 (1 μМ или 3 μМ), респективно, током 24 сата. За Цалр генетску инхибицију, МЦ38 ћелије су третиране са Цалр сиРНА или нециљном сиРНА (сиНТ) током 48 сати, након чега је уследио третман са ДМСО или 3 μМ ДЦ661 током 24 сата. Спленоцити су затим култивисани са ДЦ661 са или без Б16 или МЦ38 ћелија у присуству ИЛ-2 (5 ИУ/мЛ) и заједно култивисани током 72 сата. Прајминг је потврђен ИФН-ЕЛИСА (Биолегенд, 430815) супернатанта. Прајмовани спленоцити су затим заједно култивисани са свеже култивисаним ћелијама Б16 или МЦ38 са односом циља према ефектору (Б16 или МЦ38 према спленоцитима) од 1:20 и 1:50 за ћелије Б16 и МЦ38. Ослобађање ЛДХ повезано са смрћу ћелија Б16 или МЦ38, а затим процентуална цитотоксичност мерени су према протоколу произвођача (МиллипореСигма, 4744926001) (31). Тестови антитуморске вакцинације и студије хемотерапије са утврђеним моделима рака. Женке мишева ВТ Ц57БЛ/6, НОД/СЦИД и БАЛБ/ц, старе од шест до осам недеља, добијене су из Тхе Јацксон Лаборатори. За експерименте против туморске вакцинације, ћелије ВТ Б16Ф10, МЦ38 и ЦТ26 су третиране са ДЦ661 (3 μМ) током 36 сати у боцама од 175 цм2. Затим су супернатанти и одвојене ћелије сакупљени у епрувету од 50 мЛ Фалцон. Ћелије су центрифугиране и испране ледено хладним ПБС. За вакцинацију, 150 μЛ ћелијске суспензије је убризгано сц у леви бок имунокомпетентних мишева Ц57БЛ/6, имунодефицијентних НОД/СЦИД мишева (1,8 × 104 Б16Ф10 ћелија, 1,5 × 106 МЦ38 ћелија по мишу) (БАЛБ3 не мице) или сингене 0 мииц мишева. × 106 ЦТ26 ћелија по мишу). Замрзнуте одмрзнуте ћелије ресуспендоване у ПБС су убризгане као негативна контрола. Недељу дана касније, живе ћелије рака истог типа (3 × 104 Б16Ф10 ћелије, 2 × 105 МЦ38 ћелија, или 5 × 105 ЦТ26 ћелија по мишу) са једнаком запремином Матригела (Цорнинг, 354248) су убризгане у десни бок вакцинисаних мишева. Тумори су мерени помоћу електронских чељусти, а запремина је израчуната као Л × В2 × 0,5. Раст тумора је редовно праћен наредних дана, а одсуство тумора се сматрало показатељем ефикасне антитуморске вакцинације. ДЦ661-Студије вакцинације МЦ38 су поновљене на НОД/СЦИД мишевима. Статистика. Статистичка значајност је одређена коришћењем Студентовог непарног, 2-репа т-теста приликом поређења 2 групе. 1-тест АНОВА је коришћен када је упоређено више од 2 групе. Нул хипотеза је значајно одбачена ако је П вредност била мања од 0,05. Подаци су приказани као средња вредност ± СЕМ. Одобрење студије. Сви експерименти на животињама су изведени у складу са протоколима које је одобрио Комитет за институционалну негу и употребу животиња Универзитета у Пенсилванији.

Кинеска биљка цистанче-антитумор

Референце

1. Зех ХЈ, ет ал. Рандомизована фаза ИИ преоперативна студија инхибиције аутофагије са високим дозама хидроксихлорокина и гемцитабина/Наб-паклитаксела код пацијената са карциномом панкреаса. Цлин Цанцер Рес. 2020;26(13):3126–3134.

2. Ребецца ВВ, ет ал. ППТ1 промовише раст тумора и молекуларна је мета деривата хлорокина код рака. Цанцер Дисцов. 2019;9(2):220–229.

3. Брун С, ет ал. ГНС561, нови инхибитор аутофагије активан против матичних ћелија рака у хепатоцелуларном карциному и метастазама у јетри од колоректалног карцинома. Ј Цанцер. 2021;12(18):5432–5438.

4. Брун С, ет ал. ГНС561, ППТ1 инхибитор клиничке фазе, ефикасан је против хепатоцелуларног карцинома путем модулације лизозомских функција. Аутофагија. 2022;18(3):678–694.

5. Оберле Ц, ет ал. Пермеабилизација лизозомалне мембране и ослобађање катепсина је Бак/Бак-зависан, појачавајући догађај апоптозе у фибробластима и моноцитима. Целл Деатх Диффер. 2010;17(7):1167–1178.

6. Боиа П, Кроемер Г. Пермеабилизација лизозомалне мембране у смрти ћелије. Онкоген. 2008;27(50):6434–6451.

7. Ребецца ВВ, ет ал. Јединствени приступ циљању деградативних и сигналних улога лизозома за раст. Цанцер Дисцов. 2017;7(11):1266–1283.

8. Танг Р, ет ал. Фероптоза, некроптоза и пироптоза у имунитету против рака. Ј Хематол Онцол. 2020;13(1):110.

9. Иамамото К, ет ал. Аутофагија промовише имунолошку евазију рака панкреаса деградацијом МХЦИ. Природа. 2020;581(7806):100–105.

10. Денг Ј, ет ал. Инхибиција УЛК1 превазилази компромитовану презентацију антигена и обнавља антитуморски имунитет код ЛКБ1 мутантног рака плућа. Нат Цанцер. 2021;2(5):503–514.

11. Лазароу М, ет ал. Убиквитин киназа ПИНК1 регрутује рецепторе аутофагије да изазове митофагију. Природа. 2015;524(7565):309–314.

12. Цхои ИБ, ет ал. ТАКС1БП1 ограничава апоптозу изазвану вирусом тако што олакшава деградацију митохондријалног адаптера МАВС посредовану сврабом. Мол Целл Биол. 2017;37(1):е00422-16.

13. Рикка С, ет ал. Бнип3 нарушава биоенергетику митохондрија и стимулише обрт митохондрија. Целл Деатх Диффер. 2011;18(4):721–731.

14. Леу ЈИ, ет ал. Механистичка основа за оштећену фероптозу у ћелијама које експримирају афричко-центричну С47 варијанту п53. Проц Натл Ацад Сци УС А. 2019;116(17):8390–8396.

15. Еркес ДА, ет ал. Мутантни БРАФ и МЕК инхибитори регулишу имунолошко микроокружење тумора путем пироптозе. Цанцер Дисцов. 2020;10(2):254–269.

16. Серано-Пуебла А, Боиа П. Пермеабилизација лизозомалне мембране у ћелијској смрти: нови докази и импликације на здравље и болест. Анн НИ Ацад Сци. 2016;1371(1):30–44.

17. Тхирусангу П, ет ал. Аутофагија изазвана кинакрином код рака јајника покреће катепсин-Л посредовану пермеабилизацију лизозомалне/митохондријалне мембране и ћелијску смрт. Ракови (Базел). 2021;13(9):2004.

18. Мицхаллет МЦ, ет ал. Катепсин зависна апоптоза изазвана супраоптималним активирањем Т лимфоцита: могући механизам толеранције високе дозе. Ј Иммунол. 2004;172(9):5405–5414.

19. Мондал А, ет ал. Недостатак Ппт1-дисрегулише хомеостазу лизозома Ца++ доприносећи патогенези на мишјем моделу ЦЛН1 болести. Ј Инхерит Метаб Дис. 2022;45(3):635–656. 20. Енгел КМ, ет ал. Фосфолипазе и реактивне врсте кисеоника су извукле липидне биомаркере код здравих и болесних људи и животиња - фокус на лизофосфатидилхолину. Фронт Пхисиол. 2021;12:732319.

21. Фу Р, ет ал. Ефикасност Н-ацетилцистеина у фенотипској супресији мишјих модела Ниеманн-Пицкове болести, тип Ц1. Хум Мол Генет. 2013;22(17):3508–3523.

22. Боз З, ет ал. Н-ацетилцистеин спречава оксидативни стрес изазван оланзапином у мХипоА-59 неуронима хипоталамуса. Сци Реп. 2020;10(1):19185.

23. Кхаре С, ет ал. АСС1 и АСЛ потискују раст карцинома бубрежних ћелија бистрих ћелија путем измењеног метаболизма азота. Цанцер Метаб. 2021;9(1):40.

24. Геготек А, ет ал. Поређење заштитног ефекта аскорбинске киселине на интеракције редокс и ендоканабиноидних система ин витро култивисани фибробласти људске коже изложени УВ зрачењу и водоник пероксиду. Арцх Дерматол Рес. 2017;309(4):285–303.

25. Де Раедт Т, ет ал. Искоришћавање рањивости ћелија рака за развој комбиноване терапије за туморе изазване рас. Цанцер Целл. 2011;20(3):400–413.

26. Зханг Кс, ет ал. Праћење пероксидације липида у пенастим ћелијама помоћу сонде која циља на лизозом и ратиометријске сонде. Анал Цхем. 2015;87(16):8292–8300.

27. Веи ЦИ, ет ал. Анализа заснована на биоинформатици открива повишени МФСД12 као кључни промотер пролиферације ћелија и потенцијални терапеутски циљ у меланому. Онкоген. 2019;38(11):1876–1891.

28. Алдини Г, ет ал. Н-ацетилцистеин као антиоксидант и средство за разбијање дисулфида: разлози зашто. Фрее Радиц Рес. 2018;52(7):751–762. 29. Абу-Ремаилех М, ет ал. Метаболомика лизозома открива регулацију ефлукса амино киселина из лизозома зависну од В-АТПазе и мТОР. Наука. 2017;358(6364):807–813.

30. Зхоу Ј, ет ал. Имуногена ћелијска смрт у терапији рака: садашњи и нови индуктори. Ј Целл Мол Мед. 2019;23(8):4854–4865. 31. Схарма Г, ет ал. Инхибиција ППТ1 појачава антитуморску активност анти-ПД-1 антитела код меланома. ЈЦИ Инсигхт. 2020;5(17):е133225.

32. Мехнерт ЈМ, ет ал. БАММ (БРАФ аутофагија и инхибиција МЕК код меланома): испитивање фазе И/ИИ дабрафениба, траметиниба и хидроксихлорокина код узнапредовалог БРАФВ600-мутантног меланома. Цлин Цанцер Рес. 2022;28(6):1098–1106. 33. Лои М, ет ал. Протеини макроаутофагије контролишу нивое МХЦ класе И на дендритским ћелијама и обликују антивирусне ЦД8(+) Т ћелијске одговоре. Целл Реп. 2016;15(5):1076–1087.

34. Јоуандин П, ет ал. Лизозомална мобилизација цистеина обликује одговор ТОРЦ1 и раста ткива на гладовање. Наука. 2022;375(6582):еабц4203.

35. Сцхвалфенберг ГК. Н-ацетилцистеин: преглед клиничке корисности (стари лек са новим триковима). Ј Нутр Метаб. 2021;2021:9949453.

36. Беер ЛА, ет ал. Систематско откривање серумских биомаркера ванматеричне трудноће коришћењем 3-Д профилисања протеина у комбинацији са квантификацијом без ознака. Ј Протеоме Рес. 2011;10(3):1126–1138. 37. Голдман АР, ет ал. Примарни ефекат на протеом АРИД1А-мутираног карцинома јајника јајника је смањење регулације мевалонатног пута на пост-транскрипционом нивоу. Мол Целл Протеомицс. 2016;15(11):3348–3360.

38. Цок Ј, Манн М. МакКуант омогућава високе стопе идентификације пептида, индивидуализовану тачност масе у опсегу ппб и квантификацију протеина на нивоу протеома. Нат Биотецхнол. 2008;26(12):1367–1372.

39. Цок Ј, ет ал. Андромеда: претраживач пептида интегрисан у МакКуант окружење. Ј Протеоме Рес. 2011;10(4):1794–1805.

40. Цок Ј, ет ал. Прецизна квантификација без ознака на нивоу протеома одложеном нормализацијом и екстракцијом максималног односа пептида, названа МакЛФК. Мол Целл Протеомицс. 2014;13(9):2513–2526.

41. Тианова С, ет ал. Персеус рачунарска платформа за свеобухватну анализу података (проте)омике. Нат Метходс. 2016;13(9):731–740.

42. Тианова С, Цок Ј. Персеус: биоинформатичка платформа за интегративну анализу протеомских података у истраживању рака. Методе Мол Биол. 2018;1711:133–148.

43. Алицеа ГМ, ет ал. Промене у метаболизму липида фибробласта у старости изазивају отпорност ћелија меланома зависну од старости на циљану терапију преко транспортера масних киселина ФАТП2. Цанцер Дисцов. 2020;10(9):1282–1295.

44. Ран ФА, ет ал. Инжењеринг генома помоћу система ЦРИСПР-Цас9. Нат Протоц. 2013;8(11):2281–2308.

45. Лиу П, ет ал. Квантификација изложености калретикулину повезане са имуногеном смрћу ћелија. Метходс Ензимол. 2020;632:1–13.