Многе студије су потврдиле да су алергијске болести резултат не само активације урођеног имунитета 2

Контактирајтеoscar.xiao@wecistanche.comза више информација

3. Дискусија

Патогенеза атопијског дерматитиса (АД) није у потпуности схваћена, али болест је посредована абнормалним имунолошким одговором имуноглобулина Е (ИгЕ) у дисфункцији кожне баријере. Међу њима, мастоцити (МЦ) могу изазвати алергијске болести посредоване ИгЕ, укључујући АД. Када се мастоцити активирају, ослобађају своје мембраном везане цитоплазматске честице, што доводи до ослобађања разних молекула. Ови молекули играју важну улогу у патогенези АД и одбрани домаћина [27]. Пошто инхибиција активације или дегранулације мастоцита помаже у регулисању различитих реакција преосетљивости посредованих ИгЕ, мастоцити су једна од идеалних мета за истраживање антиалергијских лекова. У нашој студији, мастоцити су дегранулирани као одговор на једињење 48/80 и калцијум јонофор А23187 и анти-ДНП/ИгЕ плус ДНП/ХСА. Открили смо да референца ефикасно инхибира ефекат дегранулације мастоцита, показујући његову антиалергијску реакцију. Штавише, повећање интрацелуларног калцијума и активација МАПК је инхибирано референцом. Штавише, инфилтрација мастоцита коже узрокована ДНЦБ-ом и понашање при гребању узроковано једињењем 48/80 су такође смањени. Стога, механизам неферинског анти-атопијског дерматитиса има мултипликативни ефекат на кератиноците и мастоците.

Патогенија атопског дерматитиса (ДА) није цомпренде пор цомплето, перо ла енфермедад еста медиада пор уна респуеста инмунитариа анормал де ла инмуноглобулина Е (ИгЕ) ен ла дисфунцион де ла баррера цутанеа. Ентре еллос, лос мастоцитос (МЦ) пуеден цаусар енфермедадес алергицас медиадас пор ИгЕ, инцлуида ла ЕА. Цуандо лос мастоцитос се ацтиван, либеран сус партицулас цитопласмицас унидас а ла мембрана, ло куе ллева а ла либерацион де уна вариедад де молецулас. Естас молецулас јуеган ун папел импортанте ен ла патогенесис де ла ЕА и ла дефенса дел хуеспед [27]. Дебидо а куе ла инхибицион де ла ацтивацион о десгранулацион де лос мастоцитос аиуда а регулар вариас реацционес де хиперсенсибилидад медиадас пор ИгЕ, лос мастоцитос сон уно де лос објетивос идеалес пара екплорар фармацос антиалергицос. Ен нуестро естудио, лос мастоцитос се десгранулан ен респуеста ал цомпуесто 48/80 и ал ионофоро де цалцио А23187, и анти-ДНП/ИгЕ плус ДНП/ХСА. Енцонтрамос куе ла референциа инхибио ефецтиваменте ел ефецто де десгранулацион де лос мастоцитос, мострандо су реаццион антиалергица. Адемас, ел аументо де цалцио интрацелулар и ла ацтивацион де МАПК фуерон инхибидос пор референциа. Адемас, тамбиен се редујерон ла инфилтрацион де мастоцитос ен ла пиел цаусада пор ДНЦБ и ел цомпортамиенто де расцадо цаусадо пор ел цомпуесто 48/80. Пор ло танто, ел мецанисмо де ла дерматитис антиатопица де ла неферина тиене ун ефецто мултиплицадор собре лос куератиноцитос и лос мастоцитос.

Кликните овде да бисте сазнали више

Цитоплазма мастоцита пронађених у ткивима испуњена је великим, густим честицама претходно формираних инфламаторних медијатора[28]. Процес ослобађања ових медијатора из секреторних гранула у мастоцитима назива се дегранулација. Пошто инхибиција дегранулације мастоцита може регулисати различите реакције преосетљивости посредоване ИгЕ, мастоцити су једна од идеалних мета за истраживање антиалергијских лекова [29,30]. Наши резултати показују да референца има веома добар ефекат на дегранулацију мастоцита без обзира на употребу антигена, стимулатора рецептора или јонофора. Ово показује да је референца потенцијално средство против алергија (Слика 2).

Све претходно ускладиштене грануле, новосинтетизовани медијатори, па чак и грануле и њихове компоненте могу се користити као индикатори активације МЦ [31]. Поред тога, стандардна метода је мерење интрацелуларне концентрације Ца4т. Већина МЦ секретагога (нпр. антиген, једињење 48/80) који су генерално коришћени у лабораторији изазвали су повећање интрацелуларне концентрације Ца2 плус. У ствари, повећање интрацелуларне концентрације Ца2 плус такође може изазвати дегранулацију МЦ. Обично се повећање интрацелуларног Ца4т индукује активацијом МЦ једињењима, као што су тапсигаргин (посебно блокирају Сарцо/ендоплазматску Ца2 плус АТПазу, СЕРЦА) пумпе и јонофоре (тј. јономицин и А23187) [32,33]. Стога, у Ца2т зависној МЦ активацији, мерење прилива Ца2т се такође сматра методом за одређивање услова активације МЦ. У истраживању МЦ, Фура-2 се широко користи за одређивање интрацелуларних промена Ца2 плус. У нашим експериментима, открили смо да је интензитет флуоресценције активираних мастоцита био значајно потиснут након третирања референцом (слика 3). Претходни извештаји су показали да је повећање интрацелуларне концентрације Ца4т у складу са ослобађањем хистамина [34]. Према томе, закључујемо да ће ослобађање хистамина такође бити инхибирано третманом референце. Даљи експерименти су оправдани да би се потврдила ова хипотеза.

Мастоцити имају значајно различите функционалне излазе.цистанцхе досаге реддитТо укључује дегранулацију, формирање прекурсора арахидонске киселине, хемотаксу и производњу цитокина, и сви су у одређеној мери зависни од сигнала калцијума, без обзира на стимулансе [32] Активирани МЦ ослобађа цитокине, који су главни посредници алергија и инфламаторних болести [ 35]. Производња цитокина од стране активираних мастоцита је резултат индукције транскрипције гена цитокина у овим ћелијама. Стимулација мастоцита доводи до активације НФ-кБ и АП-1 и производње многих цитокина [36]. МАПК каскадни сигнални путеви играју суштинску улогу у регулацији експресије цитокина. Активација ових путева кроз активацију ПКЦ помоћу ПИ доводи до активације различитих гена, укључујући инфламаторне цитокинске гене као што су ИЛ-1, ИЛ-6 и ТНФ [37]. Наше недавне студије су показале да референца може инхибирати цитокине који се ослобађају активацијом кератиноцита. У исто време, такође смо открили да ће активација пута МАПК такође бити инхибирана третманом референце [18]. У нашој тренутној студији, показали смо да референца такође може смањити експресију цитокина кроз инхибицију активације МАПК у мастоцитима (Слике 4 и 5). Активација НФкБ је такође смањена због инхибиције активације МАПК (слика 6).

Цистанцхе може против старења

Бројне студије су известиле да су различити цитокини код пацијената са АД повишени, што доводи до дисфункције кожне баријере, укључујући цитокине које луче кератиноцити и цитокине изведене из Тх2- [38,39]. Поред тога, објављено је да ови излучени цитокини такође могу смањити експресију протеина чврстог споја (Т]) и гена за терминалну диференцијацију, укључујући филагрин (ФЛГ), лорикрин (ЛОР) и инволукрин (ИВЛ) [39,40 ](Про)филагрина експресија је смањена у АД и обрнуто је повезана са МЦ триптазом и ИЛ-6[41]. ИЛ-1 посредује у хроничној инфламацији код мишева са оштећеном кожном баријером [35]. У претходној студији је објављено да су експресије ФЛГ, ИВЛ и ЛОР смањене након примене ДНЦБ на дорзалну кожу НЦ/Нга мишева[42,43]. У овој студији, експресије ФЛГ, ИВЛ и ЛОР су значајно смањене у дорзалној кожи контролне групе, што је указивало на оштећење епидермалне баријере. Референтна примена значајно је опоравила смањене експресије ФЛГ, ИВЛ и ЛОР након третмана ДНЦБ, док је референтна примена благо повећала експресију ИВЛ и ЛОР у поређењу са контролном групом (Слика 8). Познато је да је једињење 48/80 ефикасан активатор мастоцита коже. Реакција коже стимулисана једињењем 48/80 може да изазове понашање чешања ослобађањем хистамина из мастоцита [44]. Хистамин ослобођен из активираних мастоцита игра важну улогу у повећању васкуларне пермеабилности изазване једињењем 48/80. Током пруритуса код људи, такође се узима у обзир хистамин који се ослобађа из мастоцита путем различитих стимуланса. постао важан посредник. Због тога је инхибиција дегранулације мастоцита важан корак у регулисању ослобађања хистамина током понашања чешања. У овој студији, 48/80 је изазвало ефикасну активацију мастоцита коже. Међутим, предтретман са референцом значајно је смањио ниво дегранулације мастоцита (Слика 2).предности екстракта цистанцхеОви резултати указују на то да референтни ефекат понашања против огреботина може бити последица смањења васкуларне пермеабилности регулацијом дегранулације мастоцита (Слика 9).

Опште је утврђено да пацијенти са АД пате од дисфункције кожне баријере, упале коже или обоје, тако да је тешко пронаћи одговарајуће методе лечења. Због тога се обично препоручује комбинована терапија. Наше недавно истраживање је показало да никада нема имуномодулаторну функцију и способност поправљања баријере. Стога је важна референтна карактеристика у лечењу АД у будућности одржавање функције коже и побољшање хидратације коже и поправка баријере. Референца такође може да смањи понашање при чешању изазвано алергенима и иритантима. Штавише, атопијски марш је болест повезана са феноменом која се јавља и напредује корак по корак. Атопијски дерматитис се често јавља у детињству. Алергија на храну се често јавља након 1-2 година. Алергијски ринитис често може да почне пре и после школе. Симптоми астме се јављају у различито време, али већина њих је након алергијског ринитиса. Након детињства, атопијски дерматитис и одређене алергије на храну могу се побољшати или нестати. Алергијски ринитис и астму није лако излечити[45,46]. Дакле, они су коморбидни феномени у болестима. Природни производи, укључујући референце, имају терапеутски потенцијал коморбидитета, а њихова ефикасност у сродним болестима вреди проучавати у будућности.

4. Материјали и методе

4.1. Базофилне ћелије леукемије пацова

Ћелије базофилне леукемије пацова (РБЛ-2Х3) су поклон од ТЛХванга, Универзитета Цханг Гунг, Таоиуан, Тајван. РБЛ-2Х3 ћелије су мастоцити слузокоже који се користе за проучавање дегранулације изазване антигеном или калцијум јонофором, интрацелуларног Ца4т и трансдукције сигнала [29]. Ћелије су култивисане у ЕМЕМ-у који садржи 10 процената ФБС, са пеницилином и стрептомицином на 37 степени, 5 процената ЦО2. Исцове-ов модификовани Дулбеков медијум (ИМ) и фетални говеђи серум (ФБС) купљени су од Тхермо Фисхер Сциентифиц-а (ГИБЦОТМ, Њујорк, Њујорк, САД).

4.2.МТТ тест

3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Х-тетразолијум бромид (МТТ) тест се користи за мерење метаболичка активност ћелија. РБЛ-2Х3 ћелије су засејане у 24-плочу за културу бунара при 5 × 10 плус по бунарчићу. После 24 х третмана лековима, додато је 30 μЛ МТИ по бунарчићу и стављено у ћелијски инкубатор на 37 степени на 2-4 х, а затим су љубичасти кристали формазана растворени са ДМСО. ЕЛИСА читач је коришћен за мерење интензитета апсорбанције на таласној дужини од 550 нм као тест виталности ћелије.

4.3. Мерење интрацелуларног нивоа Ца2 плус

[Ца2т] Измерен сам са фура-2 као што је претходно описано[47].РБЛ-2Х3 ћелије су ресуспендоване у ИМДМ који садржи 5 уМ Фура 2-АМ и 1,2 мМ ЦаЦлз на 37 степени за 30 мин. Након пуњења Фура{11}}, кератиноцити су пелетирани и ресуспендовани у свежем ДМЕМ-у. Аликвот (2 мЛ) је пребачен у мешану кивету која садржи 1,2 мМ ЦаЦлз. Фура-2- флуоресценција Ца је анализирана на таласним дужинама ексцитације од 340 и 380 нм (таласна дужина емисије, 505 нм) у Перкин{1{Ел9 }} спектрофлуорометар (ПеркинЕлмер Лифе анд Аналитицал Сциенцес). Подаци су снимани у интервалима од 5 с[47].

4.4. Квантитативна полимерна ланчана реакција (кПЦР)

РБЛ{{0}}Х3 ћелије су посађене у посуду за културу од 3,5 цм. Након што су ћелије порасле на 90 процената, ћелије су узгајане у статичком стању 24 сата. Након што су ћелије претходно третиране референцом током 20 минута, оне су стимулисане са ТНФ-а/ИФН-и током 1 или 24 сата, респективно. Ћелије су остругане, центрифугиране (16,000×г,10 мин,4 степена), а супернатант је екстрахован. РНК је пречишћена коришћењем комплета за изолацију укупне РНК (ГенеДирек@, Вегас, НВ, САД). У складу са радном процедуром комплета за синтезу цДНК (БИО-РАД), реагенси су додавани по редоследу и радили у складу са назначеним условима да би се РНК претворила у цДНК. Даље, коришћен је ПоверУпТМ СИБРТМ Греен Мастер Мик (Апплиед БиосистемсТМ). Додато је укупно 7,5 уЛ ддХ20,2 уЛ цДНК, 0,25 μЛоф предњег и реверзног прајмера и 10 уЛ СИБР ГРЕЕН-а и једнолико помешано. Секвенце прајмера су приказане у табелама 1 и 2. Затим је РНК квантификована коришћењем АБИ СтепОнеПлусТМ ПЦР система у реалном времену.

4.5. Вестерн блот тест

Вестерн блоттинг се користи за анализу промена различитих протеина у ћелијама. РБЛ{{0}}Х3 ћелије су засејане у посуду за културу од 3,5 цм. Након што су ћелије нарасле до 90 процената пуне и изгладњеле 24 х, претходно су третиране референтним током 20 минута, а затим стимулисане ТНФ-а или ИФН-и током 30 минута или 1 х, респективно. Након стругања, ултразвуком су уситњени у прах и центрифугирани (13.200 о/мин, 10 мин, 4 степена). Након центрифугирања, супернатант је узет и протеин је квантификован помоћу Пиерцеовог комплета за анализу протеина (Пиерце, Роцкфорд, ИЛ, УСА). Подвргнута је електрофорези на 10% СДС-полиакриламидном гелу, а затим електропорисана са ПВДФ мембраном. Након што је трансфер завршен, ПВДФ мембрана је стављена у ТБС-Т (Трис-пуферовани слани раствор/0,05 процената твеен 20) раствор који садржи 5 процената обраног млека у праху и мућкана 1 х да би се избегло неспецифично везивање. Затим је ТБС-Т коришћен за прање 3 пута, сваки пут по 10 минута. Затим су додата примарна антитела (1:1000 разблажења) и стављена на 4 степена преко ноћи, а затим су испрана 3 пута са ТБС-Т сваких 10 минута. Након додавања секундарних антитела (разблажених 1:1000) током 1 х, ПВДФ мембрана је испрана 3 пута са ТБС-Т по 10 минута сваки пут. На крају је додат развијач, а мембрана је постављена у систем за екстракцију хемијске луминисценције (БИОСТЕП Целвин") за снимање.

4.6. Динитрохлоробензен(2,4-Динитроцхлоробен2ене, ДНЦБ) индукована упала коже налик атопијском дерматитису код мишева

Прво, мишеви су подељени у четири групе: контролна група, ДНЦБ група (негативна група), референтна (3 мг/кг и 10 мг/кг) са ДНЦБ групом и дексаметазон (0,2 мг/кг) са ДНЦБ група (позитивна група). Дексаметазон је кортикостероидни хормон који може смањити оток и алергијске реакције. У овом ин виво експерименту, и референтни и дексаметазон су растворени у ДМСО, док је ДНЦБ растворен у 75 процената етанола ултразвучним шоком. Први је дат интраперитонеалном ињекцијом, а за други, 100 уЛ је нането на кожу леђа, а 20 μЛ је примењено на десно уво. Три дана пре експеримента, мишеви су анестезирани и задња длака је уклоњена, а мали мерни магнет (СЦТ-МАГ-ТФ) је уграђен на задњи део мишјег задњег стопала.Чистанче Џингис канНакон три дана мировања, потврђено је да су мишеви у добром физичком стању и да је кожа на дорзалној депилацији нормална и експеримент је започет. Током експеримента, снимљене су фотографије које су забележиле промене изгледа коже. Прва фаза ({{0}} дана) била је период алергијског атопијског дерматитиса. Након мерења основних вредности мишева у ДНЦБ групи, референтној (3 и 10 мг/кг) и експерименталној групи ДНЦБ и експерименталној групи дексаметазона 0,2 мг/кг и ДНЦБ, 1 проценат ДНЦБ је равномерно нанет на кожу леђа и десно уво. Петог дана интраперитонеално су убризгани референтни лекови и дексаметазон. Друга фаза (од 5. до 14. дана) била је поновна индукција атопијског дерматитиса.цистанцхе продужење животаУ 3 експерименталне групе,0.5% ДНЦБ је равномерно размазано по кожи леђа и десном уху мишева. Следећег дана су снимљене и снимљене физиолошке вредности коже и слике. Након што су мишеви еутаназирани прекомерним угљен-диоксидом (ЦО2) 15. дана, ткиво дорзалне коже је уклоњено за накнадну експерименталну анализу.

4.7. Једињење 48/80-Индуковано гребање код БАЛБ/ц мишева

Длака коже на задњој страни миша је исечена и интракутано је убризгано 20 μЛ раствора једињења 48/80. Уместо тога, контролни мишеви су примили ињекције физиолошког раствора. Непосредно након ињекције, животиња је смештена у кавез за посматрање (пречник 11 цм, МицроАцт, Неуросциенце, Токио, Јапан), а понашање миша при чешању је аутоматски и објективно детектовано и процењено. Понашање огреботине је мерено током 60 мин. МицроАцт користи следеће параметре анализе да детектује таласе који одговарају понашању непрекидног гребања мишева: праг, 0,05 В; размак догађаја, 0,05 с; минимално трајање,0,25 с; максимална фреквенција,30 Хз; минимална фреквенција,5Хз. 4.8.Статистичка анализа

За статистичку анализу коришћен је софтвер Сигма-Плот (верзија 10.0).цистанцхе нзПодаци су изражени као средња вредност ± СЕМ, са (*) и (#) као напомене. Статистичка значајност података је анализирана неупареним, двостраним Студентовим т-тестовима.п вредностима мањим од 0.05 и 0,01 сматрани су значајним.

5. Закључци

У овој студији смо утврдили да референца ефикасно инхибира дегранулацију мастоцита и смањује експресију проинфламаторних цитокина, који могу смањити симптоме сличне атопијском дерматитису, обновити кожну баријеру и смањити гребање коже. Даље смо доказали да референца не може само да делује на кератиноците коже, већ и да утиче на активацију мастоцита. Има већи потенцијал за примену код алергијских и инфламаторних обољења коже.

Овај чланак је преузет из Инт. Ј. Мол. Сци. 2021, 22, 10994. хттпс://дои.орг/10.3390/ијмс222010994 хттпс://ввв.мдпи.цом/јоурнал/ијмс