Метаанализа резултата квантификације НАД(П)(Х) показује варијабилност у ткивима сисара
Jun 01, 2023
Никотинамид аденин динуклеотид (НАД плус) игра важну улогу у енергетском метаболизму и сигналним путевима који контролишу кључне ћелијске функције. Тхеповећано интересовање за НАД плус метаболизамиНАД плус -појачавајуће терапијеје појачао потребу за тачном НАД плус квантификацијом. Да бисмо испитали објављене мере НАД(П)(Х) у ткивима сисара, извршили смометаанализа постојећих података. Претрага базе података Овид МЕДЛИНЕ идентификовала је чланке са НАД(П)(Х) квантификационим резултатима добијеним из ткива сисара објављеним између 1961. и 2021. Прегледали смо 4890 записа и извукли квантитативне податке, као иметоде квантификације, преданалитички услови и карактеристике предмета. Екстраховане физиолошке концентрације НАД(П)(Х) уразна ткивакод мишева, пацова и људи, открили су важну варијабилност међу и унутар метода која се проширила на недавне публикације. Ово наглашава релативно слаб потенцијал за унакрсне експерименталне анализе за квантитативне податке НАД(П)(Х) и важност стандардизације за методе квантитификације НАД(П)(Х) ипреданалитички поступциза будуће претклиничке иклиничке студије.
Кликните овде да бисте добили Цистанцхе својства против оксидације и производе против старења
Никотинамид аденин динуклеотид игра двоструку улогу као аредукција-оксидација (редок)коензим, у свом оксидованом (НАД(П) плус ) иредуковане (НАД(П)Х) форме, и као ако-супстрат (НАД(П) плус ) за ензиме укључене у деацилацију1, моно- и поли-АДП-рибозилација2,3, и стварање секундарних гласника на бази аденина4-7. Однос НАД(П) плус/НАД(П)Х је важан индикатор интрацелуларног редокс стања и игра кључну улогу у регулацији кључних метаболичких путева8,9. На пример, НАД плус је неопходан за гликолизу, заједно са циклусом трикарбоксилне киселине (ТЦА), како би обезбедио редукционе еквиваленте током стварања аденозин трифосфата (АТП), главног извора енергије за ћелију8,9. Када је НАД плус ограничен, он се такође може регенерисати из НАДХ ферментацијом пирувата да би се произвео лактат у ћелијама сисара, чиме се одржава ћелијска редокс равнотежа25. НАД плус и НАДХ такође могу бити фосфорилисани у НАДП и НАДПХ, респективно, помоћу НАД плус киназа (НАДК)10,11. НАДПХ је неопходан за редуктивну биосинтезу, трансдукцију сигнала, ћелијске антиоксидативне одговоре, а посебно редукцију глутатиона12–14. У цитосолу, НАДП плус се редукује у НАДПХ помоћу глукоза-6-фосфат дехидрогеназе и 6-фосфоглуконат дехидрогеназе пентозофосфатног пута (ППП), између осталих реакција13. Док се у митохондријима производња НАДПХ одржава различитим реакцијама, укључујући оне које се ослањају на активност ензима никотинамид нуклеотид трансхидрогеназе (ННТ) и изоцитрат дехидрогеназе (ИДХ2)15. Као резултат тога, показало се да статус НАД(П)(Х) утиче на ћелијску сигнализацију и метаболизам, енергетску хомеостазу, митохондријалну биогенезу, одговоре на оксидативни стрес и одржавање и поправку ДНК16–18. Даље, од прогресије болести повезаних са узрастом, као што су гојазност19, неалкохолна болест масне јетре20,21, неуродегенерација22, митохондријалне23 и кардиоваскуларне24 болести, и мишићна атрофија или дистрофија25, повезују се са променама у метаболитима повезаним са НАД плус-ом, који имају за циљ одржавање НАД плус хомеостазе су тренутно под истрагом.
Осим уобичајених редокс транзиција, НАДП плус се може конзумирати разменом своје никотинамидне групе са никотинском киселином у реакцији катализованој цАДПР синтазама, као што је ЦД38, да би се формирао други гласник НААДП, који је укључен у мобилизацију калцијума, секрецију хормона и имуне ћелије. пролиферација6,7,26. НАД плус се такође може конзумирати када делује као ко-супстрат за формирање никотинамида (НАМ), који се може користити као супстрат за регенерацију НАД плус преко НАМ пута спасавања. НАМ се такође може метиловати да би се формирао 1-метил НАМ (меНАМ), који се може даље оксидовати у продукте разградње Н1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид (2пи) и Н1-метил-4-пиридон-3-карбоксамид (4пи). На крају, метиловани катаболити се могу уклонити из тела путем урина27,28. Пул НАД плус се такође може смањити потрошњом НАДП плус преко реакције размене база за формирање другог гласника НААДП14. Одржавање скупа НАД плус, стога, захтева биосинтезу путем Преисс-Хандлеровог пута (почевши од уобичајеног молекула витамина Б3 ниацина (НА; никотинска киселина)), де ново пута биосинтезе (почевши од аминокиселине триптофана (Трп)) или регенерацију из конверзије НАМ преко спасоносног пута у НМН, а затим у НАД плус. Коначно, пут спасавања је такође важан за биосинтезу НАД плус из никотинамид рибозида (НР), алтернативног облика витамина Б3 који се налази у храни, након његове фосфорилације никотинамид рибозид киназом у НМН и затим конверзије у НАД плус путем спасоносног пута. .
Разумевање динамике НАД плус метаболома је стога постало од суштинског значаја и на крају захтева ригорозну квантификацију метаболита како би се боље разумео фукс НАД плус метаболита током нормалне физиологије, или са прогресијом болести или здравим старењем. Јасна слика ових промена је неопходна за повезивање промена у НАД плус метаболому са низводним ензимским или редокс реакцијама, које држе кључ за промене у фенотиповима ткива. С обзиром на значајну количину претходно пријављених квантитативних података о НАД плус метаболитима код сисара, укључујући све већи број извештаја код људи, неопходно је и благовремено сумирати ове промене током здравља и болести. Бројне студије су испитивале компоненте НАД плус метаболома код глодара и људи под различитим метаболичким стањима, узрастима и болестима, али се ослањају на различите методе за припрему узорака или квантификацију. Припрема узорка је важна за метаболите укључене у редокс реакције због потенцијалне деградације и међуконверзије под одређеним условима29,30. За квантификацију, сматра се да су течна хроматографија у комбинацији са спектрометријом масе (ЛЦ–МС) и спектрометријом магнетне резонанце (МРС) осетљиве и специфичне методе31–33, док су тестови циклирања ензима чешћи. Квантитативне ЛЦ–МС методе захтевају свеобухватно укључивање контрола квалитета за појединачне метаболите који се мере и за укупни матрични ефекат узорака, ефекат који објашњава различите масене спектрометријске одговоре за дати аналит када се мери у различитим растворима. Без ових контрола, ЛЦ–МС је у најбољем случају полуквантитативан. У овој студији смо идентификовали значајну варијабилност у НАД(П)(Х) мерама у студијама на глодарима и људима, наглашавајући потребу за одговарајућим методама извештавања и стандардизованим обрадама узорака и аналитичким протоколима. Све у свему, потребни су упоредиви НАД(П)(Х) скупови података кроз студије за смислено тумачење постојећих и будућих података у области НАД плус биологије.
Резултати
Мета-анализа уобичајених метода квантификације, заједно са проучаваним врстама, полом и ткивима.
Историјски гледано, ране методе коришћене за квантификацију НАД(П)(Х) ослањале су се на спектрофотометријска или флуорометријска својства ових метаболита34,35. У скорије време, методе циклуса ензима повезане са спектрофотометријском или флуорометријском детекцијом се чешће користе за разликовање нивоа НАД(П)(Х) коензима36–38. Растућа потреба за високом осетљивошћу и резолуцијом у квантификацији ових коензима, заједно са неопходношћу мерења других метаболита повезаних са НАД плус, довела је до употребе течне хроматографије високих перформанси (ХПЛЦ) и ЛЦ–МС техника. Од ових приступа, ЛЦ–МС је постао пожељна метода, пошто масена спектрометрија у комбинацији са течном хроматографијом омогућава специфичну идентификацију елуираних једињења, заједно са додатном користи за укључивање метаболита НАД(П)(Х) изотопа као унутрашњег квалитета. контроле. Упркос њиховим предностима у односу на класичне спектрофотометријске или флуорометријске тестове, ХПЛЦ и ЛЦ-МС су и даље скупи и дуготрајни, што објашњава зашто есеји циклуса ензима и даље постоје у недавним студијама.
Користећи систематски приступ, од 241 прихватљиве студије (Допунски материјал 2), 205 студија које су укључивале квантитативну мета-анализу концентрација НАД(П)(Х) у ткивима миша, пацова и људи одабрано је за даљу анализу. Од ових студија, 46,7 процената је користило тестове циклуса ензима, од којих је укључивало колориметријску (40,9 процената) или флуорометријску (5,8 процената) детекцију, док је 17,8 процената користило ХПЛЦ методе (заједно са УВ или флуоресцентним детекторима) и 13,2 процената користило ЛЦ-МС тестове ( Слика 1а). Већина студија није укључивала детаљан опис поступака екстракције метаболита. Међутим, најчешће коришћени поступци екстракције састојали су се од екстракционих пуфера са или без сурфактаната (Тритон®, Трис, Додецил триметил амонијум бромид), или поларних органских растварача као што су ацетонитрил, метанол, етанол или хлороформ. Претходне студије су показале да су инактивација ензима и оптимални пХ и температурни услови били ефикасни у очувању стабилности различитих облика НАД(П)(Х)30,39,40. Када је откривено, узорци су обрађени у условима ниске температуре, а у укљученим студијама нису поменути редокс адитиви. Редокс реакције су ограничене инактивацијом ензима у узорцима пре мерења НАД(П)(Х) метаболита, обично преципитацијом са растварачима као што су етанол, метанол, ацетонитрил или перхлорна киселина (ПЦА). Међутим, употреба ПЦА је била ретка због киселинско-лабилне природе редукованих облика (тј. НАДХ и НАДПХ), као и због неопходности додатног корака неутрализације. Међу студијама које извештавају о употреби ПЦА током екстракције метаболита (5,4 процента), 3,7 процената је пријавило само НАД(П) плус резултате или је користило другу методу екстракције без киселине за исправну квантификацију НАД(П)Х. Само 1,7 процената студија пријавило је НАДХ, укупни НАД(Х) и/или НАД плус/НАДХ резултате користећи само екстракцију ПЦА. Потенцијална пристрасност ових студија није се могла анализирати због ограничених података.
Поређења средњих физиолошких нивоа НАД(П)(Х) у ткивима за глодаре и људе.
Да бисмо помогли у идентификацији очекиваних физиолошких нивоа НАД(П)(Х) за најчешће проучавана ткива миша, пацова и људи, сакупили смо податке из свих контролних и дивљих кохорти из сваке од укључених студија (Допунски материјал 2 ). Конкретно, забележили смо средње вредности НАД(П)(Х) нормализоване на тежину ткива или, у случају крви, запремину. Подаци из студија које су нормализовали нивое метаболита на садржај протеина укључени су у наш скуп података (Допунски материјал 2), али нису коришћени за даљу анализу с обзиром на мали број пријављених резултата. Поред тога, када је то могуће, израчунали смо НАД(П) плус/НАД(П)Х однос, као одраз редокс стања, као и укупне нивое НАД(П)(Х) (НАД(П) плус плус НАД (П)(Х)) који су уобичајени резултати извештавања за НАД(П)(Х) поправке. Екстраховани подаци су такође укључивали врсту, сојеве, старост, пол, методу квантификације, исхрану и распоред храњења, врсту узорка, метод прикупљања узорака и време бербе (пре-мортем).
Мета-анализа НАД(Х) података идентификовала је средње физиолошке концентрације НАД плус и НАДХ у ткивима миша (слика 2а,б, додатна слика 1а,б) и пацова (додатна слика 2а,б) од животиња. млађи од 14 месеци за мишеве и 18 месеци за пацове. Екстраховани опсег физиолошких вредности НАД плус/НАДХ односа и укупних нивоа НАД(Х) (НАД плус плус НАДХ) су уцртани за мишеве (слика 2ц,д) и пацове (допунска слика 2ц,д). За разлику од студија на мишевима, већина пријављених података о пацовима није укључивала старост животиња; међутим, одлучили смо да укључимо ове податке под условом да студија није класификовала њихове кохорте као старије. Од најистакнутијих проучаваних ткива, ова мета-анализа показује да је средњи ниво НАД плус за јетру (596 нмол/г, н=26) већи од свих других ткива код мишева, док је изненађујуће скелетни мишићи (162,8 нмол /г, н=9) показује једну од најнижих средњих вредности по граму ткива (слика 2а). Ови резултати могу да укажу на смањену ефикасност екстракције НАД плус метаболита, због високо влакнасте природе мишића или да постоје важне разлике у НАД плус метаболизму мишића у поређењу са другим високо метаболичким ткивима, као што су јетра и бубрези.
Упркос неколико квантитативних студија старења, нивои НАД плус код старијих мишева су у просеку смањени у пигментираном епителу јетре, мишића и ретине (РПЕ), у поређењу са њиховим младим кохортама, иу поређењу са средњом вредношћу свих студија спроведених на млађим мишевима. од 14 месеци старости (допунска слика 3). Мета-анализа НАДХ и односа НАД плус/НАДХ код старих животиња није била могућа с обзиром да је само једна од ових квантитативних студија извршила ова мерења.
Ови подаци показују недостатак квантитативних података о НАД(Х) код старијих животиња.
За податке добијене из студија које су користиле здраве људе, распони старости су се увелико разликовали у различитим студијама (од 15 до 92,3 године) и у већини случајева подаци нису били стратификовани по овим узрастима. Најчешће мерена људска ткива обухватала су скелетне мишиће и компоненте крви, због њихове мање инвазивне природе сакупљања (сл. 3а–д). Резултати из других људских ткива (н= 1–2) приказани су на додатној слици 4. Ова анализа је показала средњу НАД плус концентрацију од 44,62 нмол/мл (н=23) у пуној крви, са сличним Концентрације НАД плус пријављене за црвена крвна зрнца на 46,96 нмол/мл (н=7) (Слика 3а; Додатна табела 1). Међутим, нивои НАД плус у крвној плазми били су знатно нижи са медијаном од 0.37 нмол/мл (н=8) (слика 3а). Средња вредност НАД плус нивоа пронађена у скелетним мишићима људи била је 191,9 (н=4) нмол/г у влажним мишићним препаратима наспрам 1713 (н=3) нмол/г у препаратима сушеним замрзавањем, ниска температура процес дехидрације који вероватно концентрише метаболите (слика 3а). У ткивима који су најчешће испитивани за НАДХ мерења, средњи нивои у људским црвеним крвним зрнцима, плазми и лиофилизованим скелетним мишићима били су 1,75 нмол/мл (н =7), 0,39 нмол/мл (н=8) и 136,8 нмол/г (н=6), респективно (слика 3б). Одговарајући средњи однос НАД плус/НАДХ био је 23,65 (н=8), 1,57 (н=7) и 12,7 (н=3) (слика 3ц). Занимљиво је да је средњи однос НАД плус/НАДХ за црвена крвна зрнца (23,65) и замрзавањем осушене скелетне мишиће (12,7) (слика 3ц) неколико пута већи од већине ткива миша и пацова (слика 2ц и додатна слика 2ц) , што указује на високо оксидативно редокс стање са обиљем доступног НАД плус у овим људским ткивима. У случају мишићног ткива, ово би могло имати импликације када се узме у обзир транслациони потенцијал студија о глодарима које су идентификовале предности повећања нивоа НАД плус у мишићима. Међутим, повишен однос НАД плус/НАДХ у мишићима такође може бити резултат одложених процедура замрзавања узорака у клиничком окружењу, што може довести до нефизиолошких промена у редокс статусу узорка.
Сакупљени су физиолошки нивои НАДП(Х) у ткивима глодара, при чему је најчешће мерење било у јетри. Мишја јетра је показала средњу вредност од 124,2 нмол/г НАДП плус (н=13) и 140,2 нмол/г НАДПХ (н=4) (Слика 4а,б ), док је јетра пацова показала медијану од 95,11 нмол/г НАДП плус (н=10) и 240,7 нмол/г НАДПХ (н= 9) (допунска слика 5а,б). Средњи однос НАДП плус/НАДПХ, изведен из студија које су мериле оба метаболита, био је нижи од 1 у већини ткива мишева и пацова (слика 4ц, додатна слика 5ц). Средњи укупни нивои НАДП(Х) (НАДП плус плус НАДПХ) у јетри миша и пацова били су 244,4 (н=3) (слика 4д) и 342,1 (н=9) (допунска слика 5д) , редом. Код људи, најчешће мерења НАДП(Х) вршена су у црвеним крвним зрнцима показујући медијану од 33,2 нмол/мл за НАДП плус (н=14) и 22,4 нмол/мл за НАДПХ (н{{30} }) из неподударних студија, са средњим односом НАДП плус/НАДПХ од 1,27 и средњим укупним НАДП(Х) од 52,0 нмол/мл из студија које су мериле оба метаболита (н=11) (Слика 4е– х). Све у свему, количина доступних података за НАДП(Х) је ретка код свих врста што доводи до нижег поверења у средње вредности за свако ткиво.
Анализа пристрасности и варијабилности у методама квантификације НАД(П)(Х).
С обзиром на то да је већина студија укључених у ову мета-анализу испитивала НАД плус нивое у узорцима јетре глодара (Слика 1ц,е), користили смо физиолошке НАД плус нивое јетре миша и пацова да идентификујемо било какву потенцијалну пристрасност у резултатима који одговарају на метод квантификације (слика 5а,б). Просечна старост мишева укључених у ову анализу била је 17,9 недеља (опсег: 2–55 недеља), са 6 студија које нису откриле старост животиња. За пацове, већина студија није открила старост животиња осим три које су се кретале од 2 дана до 8 месеци. Ниједна студија није пријавила употребу старих животиња. У јетри миша, велики опсег пријављених концентрација за НАД плус се кретао од 1,8 до 1132 нмол/г јетре са средњом вредношћу од 596.0 (н=26) (Слика 5а) , док су се концентрације НАДХ кретале од 0.9 до 109 нмол/г ткива са средњом вредношћу од 66.43 (н=6) (додатна слика 6а). Важно је да је коефицијент варијације од 52,5 процената и 76,5 процената израчунат за средње физиолошке резултате НАД плус и НАДХ у јетри миша, респективно, мерено вишеструким методама квантификације, показујући степен варијабилности у студијама. Као што је предвиђено из ових резултата, средњи однос НАД плус /НАДХ у јетри миша (3,41 плус /− 3,16 СД, н=19) показао је једнако велики опсег варијабилности са ЦВ од 92,7 процената (додатна слика 6ц) . Слична варијабилност у НАД плус и НАДХ мерама је такође примећена у јетри пацова (ЦВ=42.6 процената за НАД плус и ЦВ=44.4 процената за НАДХ). Те одговарајуће концентрације за НАД плус и НАДХ у јетри пацова кретале су се од 159 до 796 (н=16) и 65 до 265 (н=12) нмол/г, респективно (слика 5б, додатна слика 6б ), док су односи НАД плус / НАДХ показали ЦВ од 50.1 процената (средња вредност: 3,219 плус /− 1,612 СД, н=23) (додатна слика 6д). Средње вредности и стандардне девијације за НАД плус, НАДХ, укупни НАД(Х) и податке о односу НАД плус/НАДХ у јетри миша и пацова, груписане методом квантификације, приказане су у Додатној табели 2. У вези са нивоима НАДП(Х) и НАДП плус/НАДПХ однос, слична варијабилност је примећена у ткивима јетре. Нивои НАДП плус кретали су се од 50.4 до 247,4 нмол/г ткива за мишеве (додатна слика 8а) и од 45,7 до 171 нмол/г ткива за пацове (додатна слика 8б), док нивои НАДПХ кретао се од 28 до 236,9 нмол/г ткива за мишеве (додатна слика 8ц) и од 90 до 409 нмол/г ткива за пацове (додатна слика 8д). Најзад, однос НАДП плус / НАДПХ кретао се од 0,12 до 0,55 у јетри миша (додатна слика 8е) и од 0,12 до 1,44 у јетри пацова (додатна слика 8ф).
у највећем опсегу резултата (1,8 до 1132,3 нмол/г). Чак и најновије ЛЦ-МС студије које су испитане дале су пример распона ових НАД плус вредности, укључујући вредности од 1,8 нмол/г41 и 33,8 нмол/г42 и много веће вредности од 946,3 нмол/г43 и 1132,3 нмол/г44. Поред тога, чини се да велики опсег ЛЦ–МС НАД плус вредности није у корелацији са студијама које су искључивале унутрашње стандарде обележене изотопом (слика 5а), метод који се користи за побољшање идентификације метаболита и тачности квантитификоване вредности . Међутим, две идентификоване ЛЦ-МС студије које су се ослањале искључиво на екстерну стандардну криву за НАД плус квантификацију, уместо да укључују интерну контролу, биле су у просеку ниже од средње вредности за све мере (Слика 5а). Даље, студије које су користиле нормализацију интерног стандарда користиле су различите врсте интерних стандарда, као што је укључивање једног обележеног референтног метаболита45,46 или обележених екстраката метаболита из квасца43,44 или ћелијских култура41. Занимљиво је да су ове студије које су користиле стандарде добијене из екстракта квасца или ћелијске културе пружиле или највише или најниже мере изведене из ЛЦ-МС за нивое НАД плус у јетри. Ово потенцијално наглашава како ћелијски екстракти стандарда богатих изотопима могу допринети варијабилности у НАД плус мерењима јер матрични ефекат додатог стандардног квасца или ћелијског екстракта може да утиче на ефикасност јонизације и последично на измерене концентрације циљних метаболита.
Ограничења ове анализе пристрасности и варијабилности квантификације укључују потенцијалне разлике у окружењу, генетској позадини, жртвовању, полу и старости. Сви подаци за ову анализу потичу од животиња на исхрани, али се могу разликовати по типу. Приликом жртвовања, пријављене су разлике у нахрањеном или наташтеном стању животиње и доба дана за жртвовање. Поред тога, иако је већина студија на мишевима спроведена на позадини Ц57БЛ/6, постојао је већи опсег позадина коришћених за пацове у свим студијама (Вистар: 38 процената, Албино Вистар: 25 процената и 6 процената за Хоодед Вистар, Спрагуе–Давлеи, Холтзман, АЦИ, Лонг-Еванс и Зуцкер пацови). У студијама јетре на мишу, није било статистичких разлика између вредности за мушкарце и жене за нивое НАД плус, НАДХ или укупног НАД(Х) или за однос НАД плус/НАДХ (додатна слика 7). Међутим, не можемо доносити закључке због ограниченог броја женских кохорти.
Тражи више:
Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com вхатсапп: плус 86 15292862950
