МикроРНА у развоју и болести бубрега Ⅱ

Развој бубрега

Тхебубрег сисара(или метанефрос) је витални орган који игра кључну улогу уизлучивање метаболичких отпадака,регулација запремине екстрацелуларне течности, иодржавање електролитаикисело-базна хомеостаза. Штавише, бубрег производи важне хормоне, као нпреритропоетин, калцитриол,ренин, ипростагландини(48). Функционални капацитет бубрега је у корелацији са бројем функционалних нефрона који се формирају током развоја бубрега пре рођења, који се такође назива нефрон задужбина. Сваки људски бубрег садржи у просеку 1,000,000 нефрона, иако овај број значајно варира, са проценама у распону од 200,000 до 2,000,{{8 }} нефрони (49, 50). Витхстарење,губитак функционалне резерве нефронајавља се током времена (51, 52); стога је низак ниво нефрона при рођењу повезан са повећаним ризиком од развоја хипертензије и хроничне бубрежне болести (ЦКД) касније у животу (53–55). Штавише, ЦАКУТ, који доводи до смањења нефрона и функције нефрона, је водећи узрок бубрежне инсуфицијенције код деце, што доводи до значајног морбидитета и морталитета повезаних са трансплантацијом и дијализом (56, 57). Дакле, боље разумевање ћелијских и молекуларних механизама који су у основи успостављања броја нефрона и нормалног формирања нефрона пружа увид у нове путеве за предвиђање, превенцију и лечење болести бубрега у детињству.

КОЛИКО ЈЕ ТРЕБА ДА ЦИСТАНЦХЕ проради КОД БОЛЕСНИКА БУБРЕГА?

Развој метанефричног бубрегапочиње око ембрионалног дана 10.5 (Е10.5) код мишева и око пете недеље гестације код људи (58). Као одговор на индуктивне сигнале из метанефричног мезенхима, уретерни пупољак се протеже од каудалног краја Волфовог канала и упада у суседни мезенхим (Слика 2). Истовремено, морфогени који излазе из уретерног пупољка индукују кондензацију метанефричног мезенхима да би се формирао мезенхим капице (који се такође назива нефронски прогенитори) око врхова уретерног пупољка. Како нефрогенеза напредује, мокраћоводни пупољак пролази кроз узастопне кругове гранања, издуживања и диференцијације да би створио сабирне канале бубрега. Субпопулација прогенитора нефрона пролази кроз мезенхимско-епителну транзицију да би се формирале бубрежне везикуле, које након поларизације и елонгације постају структуре тела у облику зареза и С. Коначно, дистални део тела у облику слова С спаја се са сабирним каналом и формира функционални нефрон (59–61). Тело у облику слова С пролази кроз даљу диференцијацију да би се формирали зрели типови ћелија нефрона, осим сабирног канала. Фокд1+ стромалне прогениторне ћелије су суседне прогениторима нефрона у спољашњој кортикалној или нефрогеној зони бубрега у развоју (Слика 2) (62). Сматра се да сигнали из кортикалне строме инхибирају експанзију прогениторних ћелија нефрона и стимулишу њихову диференцијацију, пошто аблација бубрежне строме доводи до поремећене диференцијације прогенитора нефрона (63). Фокд1+ прогениторске ћелије стварају све стромалне ћелије у метанефричном бубрегу, укључујући интерстицијалне ћелије бубрежне коре и медуле, периците, периваскуларне фибробласте, мезангијалне ћелије и васкуларне глатке мишићне ћелије (64, 65). Пертурбације у било ком кораку овог процеса могу довести до ЦАКУТ-а, главног узрока ЦКД-а у детињству (66, 67).

Зрели нефрон се састоји од гломерула који делује као филтрациона јединица и цевастог задњег сорпционог одељка који је подељен на проксимални увијени тубул, Хенлеову петљу, дистални увијени тубул и сабирни канал (слика 2). Филтрациона баријера гломерула (која се састоји од фенестрираног ендотела, гломеруларне базалне мембране, стопала и прорезаних дијафрагми подоцита) омогућава филтрацију плазме и малих раствора, док селективно задржава протеине као што су албумин и имуноглобулини у крви (68, 69). У међувремену, тубуларни одељак за реапсорпцију је одговоран за одржавање хомеостазе воде, реапсорпцију растворених материја (укључујући натријум, калијум, калцијум, фосфор, магнезијум, глукозу и многе друге) и излучивање киселине и других отпада.

МиРНА у бубрегу у развоју

У студијама на условним трансгеним мишевима, миРНА су се појавиле као критични регулатори морфогенезе бубрега у више ћелијских линија. Иницијалне студије које су процениле функционалну улогу миРНА у развоју бубрега користиле су условну делецију Дицера (70) у различитим реналним линијама. Међутим, познато је да Дицер има улоге независне од миРНА (71), што је закомпликовало тумачење ових модела. Условна делеција Дицер-а у раном метанефричком мезенхиму или прогениторима нефрона доводи до повећане апоптозе нефронских прогенитора, повишених нивоа проапоптотичког протеина Бим и превременог престанка нефрогенезе (72–75) (Табела 1). Занимљиво је да губитак Бим експресије у прогениторима нефрона са недостатком Дицер-а смањује апоптозу и делимично обнавља формирање нефрона. Две миРНК експримиране у прогениторима нефрона, миР-17 и миР-106, идентификоване су као супресори БИМ експресије (76). Заједно, ови налази указују на то да миРНА контролишу равнотежу између преживљавања и апоптозе у прогениторима нефрона како би се осигурало формирање тачног броја нефрона током нефрогенезе.

Слика 2. Шематски приказ фаза развоја метанефричног бубрега. Сигнали из уретерног пупољка покрећу кондензацију метанефричног мезенхима да би се формирала капа од прогенитора нефрона (цап мезенхим) око врхова пупољака уретера. Мезенхим капице пролази кроз мезенхимско-епителну транзицију да би се формирале бубрежне везикуле, које се узастопно развијају у тела у облику зареза и С. Ове структуре се повезују са стабљиком пупољка уретера, што доводи до сабирног канала. Ћелије у проксималном домену тела у облику слова С диференцирају се у специјализоване епителне ћелије зрелог бубрежног тела (тј., подоците и ћелије Бовманове капсуле), док се ћелије у средњем и дисталном делу диференцирају у тубуларне сегменте нефрона (проксимални тубули , Хенлеове петље и дисталне тубуле). Креирано са БиоРендер.цом.

Условно брисање Дицера у линији пупољака уретера доводи до спектра абнормалности које јако подсећају на ЦАКУТ, укључујући дисплазију бубрега и развој циста сабирних канала (73, 77, 78). Превремени прекид морфогенезе гранања (као одговор на смањену експресију Внт11 и ц-Рет из уретерног пупољка) је вероватно главни фактор који доприноси дисплазији бубрега (73). Почетак формирања цисте се јавља на око Е15.5 и повезан је са дефектима у дужини примарних цилија, повећаном смрћу ћелија апоптозе и прекомерном пролиферацијом ћелија (73). Пошто Дицер има важне улоге независне од миРНА у ћелији, условно брисање Дгцр8 је коришћено да се потврди да су фенотипови примећени у моделима условних Дицер-нокаут-а заиста резултат губитка миРНА. Животиње са делецијом Дгцр8 у дисталном нефрону и дериватима сабирног канала развијају хидронефрозу и цисте сабирних канала (79), фенотип сличан ЦАКУТ-у који подсећа на губитак активности Дицера у линији пупољака уретера.

Студије две независне групе показале су да аблација Дицера из линије реналне строме Фокд1+ и њених деривата доводи до спектра бубрежних аномалија, са доследним налазима у вези са хипопластичним бубрезима, смањеним бројем гломерула, абнормалним сазревањем гломерула и дефектним васкуларним шаренило (80, 81). Иако су обе групе описале углавном подударне фенотипове користећи сличне моделе миша, примећене су две различите разлике. Накагава ет ал. приметио недостатак унутрашње мождине и папиле, као и смањење нефрогене зоне (80). Насупрот томе, Пхуа ет ал. показала експанзију популације прогенитор нефрона и очувану бубрежну папилу (81). Накагава ет ал. предложио је да су ови дефекти повезани са поремећајем сигнализације Внт пута, што доводи до промена у миграцији и пролиферацији стромалних ћелија, услед смањења регулације миРНА стромалних ћелија, миР-214, миР-199а{{7 }}п и миР-199а-3п (80). Студија Пхуа ет ал. сугерише да промене у апоптотичким програмима (укључујући повећану експресију Бим и п53 ефекторских гена) доприносе фенотипским дефектима (81). Могуће је да генетске позадинске разлике и/или ефикасност рекомбинације посредоване Цре-ом могу бити одговорне за разлике које ове студије описују. Ипак, описани фенотипови су у складу са познатим вишеструким улогама бубрежне строме у развоју бубрега, а механизми који леже у основи ових фенотипова су вероватно сложени с обзиром на природу делеције Дицер-а. Потребне су даље студије које испитују специфичне миРНА у различитим стромалним субпопулацијама да би се боље дефинисали регулаторни механизми у игри.

Новији рад бавио се питањем функције специфичних миРНК у развоју бубрега и нефрона. Користећи модел људских ембрионалних матичних ћелија, Бантоунас ет ал. показали су да инхибиција кластера миР-199а~214 доводи до дисморфних гломерула, аберантних проксималних тубула, смањене експресије ВТ1 и повећања интерстицијалних капилара у органоидима сличним бубрезима (82). Занимљиво је да глобална делеција миР-210 која реагује на хипоксију доводи до дефицита нефрона специфичних за мушкарце (83). На пример, условно брисање кластера миР-17~92 у прогениторима нефрона и њиховим дериватима код мишева нарушава пролиферацију прогениторних ћелија и смањује број нефрона у развоју. Као резултат тога, мутантни мишеви развијају протеинурију, бубрежну фиброзу и оштећену функцију бубрега (84). Дисрегулисани нивои циљног гена миР-17~92, ЦФТР, умешани су у дефектну пролиферацију прогениторних ћелија и смањену количину нефрона у овом моделу миша (85).

Мало секвенцирање РНК (смРНА-Сек) се све више користи за профилисање образаца експресије миРНА и за откривање нових врста миРНА. смРНА-Сек Е15.5 нефрогених мезенхимских ћелија идентификовала је 162 означене миРНК које су различито експримиране у овој ћелијској популацији у поређењу са целим бубрезима и 49 нових врста миРНА (86). Занимљиво је да су нивои миРНК породице миР-200 значајно смањени у прогениторима нефрона. С обзиром на то да су чланови породице миР-200 кључни регулатори мезенхимско-епителне транзиције у сабирном каналу (87), спекулишемо да би њихова експресија могла бити строго регулисана како би се обезбедила нормална епителна диференцијација прогенитора нефрона током развоја бубрега.

МиРНА функција у зрелом нефрону

Поред њиховог захтева током развоја бубрега, миРНА регулишу бројне биолошке процесе у главним ћелијским линијама које формирају зрели нефрон (69, 88–91). У складу са овим, описана је специфична експресија миРНА дуж нефрона, укључујући миР-143 и миР-195а у гломерулу, миР-107 и миР{{7} }а у проксималном тубулу, миР-193 и миР-378а у дебелом узлазном екстремитету, миР-874 и миР-155 у дисталном завијеном тубулу и миР{{ 12}}ц у сабирном каналу (87). Штавише, функционалне студије у одељцима зрелог нефрона подржавају различите улоге миРНА.

Мишеви којима недостаје било Дицер или Дросха у подоцитима показују изражену протеинурију, гломерулосклерозу и брзу прогресију до отказивања бубрега, што је последица нарушавања баријере гломеруларне филтрације (90–93). Ин силицо анализе су откриле да различити транскрипти са повећаном регулацијом у мутантним гломерулима садрже циљне секвенце за чланове породице миР-30. Као сва четири члана породице миР-30 (миР-30ц-1, миР-30б, миР-30д и миР-30ц{ {9}}) су нормално високо експримирани у подоцитима, ове миРНА могу бити одговорне за абнормалности подоцита и поремећај баријере гломеруларне филтрације код мутантних мишева (91).

Помало изненађујуће, брисање Дицера из постнаталних проксималних тубула сисара не утиче на развој бубрега, хистологију или функцију, али штити од исхемије бубрега/реперфузије. Мутантни мишеви показују бољу функцију бубрега, смањену повреду бубрега, нижу тубуларну апоптозу и побољшано преживљавање у поређењу са својим племенима из легла ВТ (94). Ово вероватно одражава „збир“ ефекта делеције вишеструких миРНК у проксималном тубулу, пошто су други радови од тада показали да експресија специфичних миРНК делује заштитно код исхемије/реперфузије бубрега (нпр. миР-16 и миР-21; док су други штетни (нпр. миР-182; реф. 97).

Иако се чини да су миРНК неопходне за функцију проксималних тубула, оне су неопходне за дисталне нефроне и хомеостазу сабирних канала (79, 88, 98). Инактивација Дицер-а и других критичних гена повезаних са биогенезом миРНА (укључујући Дгцр8, Аго1, 2, 3 и 4) узрокује инсуфицијенцију бубрега код одраслих мишева због прогресивне тубулоинтерстицијалне фиброзе и интерстицијске инфламације (88). Овоме претходи делимична епително-мезенхимална транзиција (ЕМТ) ћелија сабирних канала и смањење регулације чланова породице миР-200, који инхибирају ЕМТ (88). Слично, аблација или Дицер или Дгцр8 из деривата дисталног нефрона и уретерног пупољка, респективно, доводи до абнормалности бубрега и отказивања бубрега (78, 98), који су на крају повезани са смањењем регулације миР-200 чланова породице (98). Повећана експресија миР-200 циљног гена Пкд1 код ових мутантних мишева ремети тубулогенезу и производи структуре сличне цистама (98). Ове разлике у захтевима за функционалним миРНА у проксималним тубулима и дисталном нефрону/сабирном каналу могу се објаснити сегменталном дистрибуцијом миРНК дуж дужине нефрона и сабирног канала у бубрезима ВТ (88).

Брисање Дицера у ћелијама које луче ренин у јукстагломеруларном апарату резултира дефицитом јукстагломеруларних ћелија, смањеним нивоом циркулационог ренина са последичним смањењем артеријског крвног притиска, смањеном функцијом бубрега, пругастим узорком интерстицијалне фиброзе и васкуларним абнормалностима (89). Смањење јукстагломеруларних ћелија указује на потребу за зрелим миРНА у одржавању њиховог фенотипа. Касније су миР-330 и миР-125б-5п идентификовани као потенцијални кандидати који или инхибирају или промовишу фенотип глатких мишића јукстагломеруларних ћелија (99).

Друге активне области истраживања миРНК код акутне повреде бубрега (8–10), полицистичне болести бубрега (11) и трансплантације бубрега (10), свеобухватно су обрађене у другим недавним прегледима.

МиРНА у педијатријским бубрежним болестима У овом одељку дајемо преглед улоге миРНА у развојним болестима бубрега, укључујући ЦАКУТ и Вилмс туморе. ЦАКУТ су међу најчешћим облицима малформација при рођењу, који погађају отприлике 3–7 од 1000 живорођених (100). Поремећај развоја бубрега и доњег уринарног тракта доводи до широког спектра клиничких манифестација уочених код ЦАКУТ-а, укључујући аномалије бубрега (тј. бубрежну агенезу, бубрежну хипоплазију и дисплазију и мултицистичне диспластичне бубреге), аномалије уретеропелвице (тј. опструкцију уретеропелвице), дуплекс сабирни систем и аномалије мокраћне бешике и уретре (101–103). Ова фенотипска хетерогеност је вероватно последица сложених интеракција између генетских, епигенетских и/или пренаталних фактора животне средине који утичу на развој бубрега и доњег уринарног тракта, што резултира ЦАКУТ-ом (101). Већина нашег тренутног знања о патогенези ЦАКУТ-а произилази из модела миша и синдромских облика ЦАКУТ-а. Ове студије су довеле до идентификације неколико ЦАКУТ гена, од којих су многи укључени у рани развој бубрега, укључујући ПАКС2, САЛЛ1, ХНФ1Б, ЕИА1, ГАТА3, РЕТ, ВНТ4, ГДНФ, СИКС1, СИКС2 и друге (101, 104, 105). Међутим, појединачне мутације или варијанте броја копија у генима који кодирају протеин не објашњавају већину случајева ЦАКУТ-а (~80%) (101, 106).

Као што је горе поменуто, исцрпљивање зрелих миРНА из различитих ћелијских линија бубрега у развоју у моделима миша доводи до абнормалности бубрега које имитирају људски ЦАКУТ (73, 74, 78, 79). Поред тога, делеције заметне линије МИР17ХГ, који кодира миР-17~92 кластер, узрокују Феинголдов синдром типа 2 код људи (107). Иако фенотип бубрега код пацијената са Феинголдовим синдромом типа 2 са мутацијама МИР17ХГ остаје недефинисан, пријављена је инциденца ЦАКУТ-а од 18% у случајевима Феинголдовог синдрома повезаним са МИЦН мутацијама (108, 109). Заједно, ова запажања сугеришу да мутације у миРНК изражене током развоја бубрега могу изазвати ЦАКУТ код људи, посебно зато што су многе миРНА високо конзервиране између мишева и људи.

Да би се тестирала ова хипотеза, једна студија је истраживала 1248 пацијената са несиндромским ЦАКУТ-ом из 980 породица и тражила мутације у 96 региона петље стабла 73 миРНА гена за развој бубрега (106). Унутар ове кохорте идентификована је 31 особа са 17 различитих појединачних варијанти нуклеотида које утичу на 16 различитих гена миРНА. Међу њима, откривено је да су две нове варијанте миРНА потенцијално патогене. МИР19Б1 (члан кластера миР-17~92) је био повезан са присуством агенезе десног бубрега, а МИР99А је био повезан са тешким везикоуретералним рефлуксом и птозом бубрега. Овај изненађујуће мали број кандидата за патогене варијанте делимично је последица ограничења ове студије, пошто је анализа обухватила само мутације у генима миРНА које су биле укључене у приступ гена кандидата и нису откриле варијације у броју копија и велике преуређење ДНК (106) .

У алтернативном приступу, сегменти уретера пацијената са различитим ЦАКУТ-ом су анализирани на диференцијалну експресију транскрипта путем микромрежа, на присуство биоинформатички предвиђених миРНА циљева и зрелих миРНА путем кПЦР (110). Користећи овај вишеструки приступ, идентификовано је седам миРНА са потенцијалном улогом у ЦАКУТ-у, а међу њима, хас-миР-144 је значајно повећан код пацијената са ЦАКУТ-ом. Анализа онтологије гена је показала да предвиђени циљни гени хас-миР-144 доприносе биолошким процесима укљученим у развој ЦАКУТ-а, укључујући развој цеви (22 циљна гена), развој урогениталног система (18 циљних гена), развој бубрега (14 циљних гена) и развој ембрионалних органа (18 циљних гена) (110).

Потребне су даље студије да би се дефинисали молекуларни механизми који леже у основи патогених улога миРНА у ЦАКУТ-у. Налази оваквих студија биће критични у побољшању неге пацијената са ЦАКУТ-ом и спречавању њихове прогресије у ЦКД, обезбеђивању одговарајућег генетског саветовања за пацијенте и њихове породице и развоју нових терапијских стратегија.