Молекуларно клонирање и биохемијска карактеризација нове кумарин гликозилтрансферазе ЦтУГТ1 из Цистанцхе Тубулоса

за више информација:ali.ma@wecistanche.com

Ксипинг Ксу, ет ал

АПСТРАКТАН

УДП-гликозилтрансферазе (УГТ) су важна и функционално разнолика породица ензима укључених у биосинтезу секундарних метаболита. Кумарин је један од најчешћих скелета природних производа са кандидатским фармаколошким активностима. Међутим, до данас, многи су пријавили да ГТ из биљака углавном препознају флавоноиде као акцепторе шећера. Само ограничени ГТ могу катализирати гликозилацију кумарина. У овој студији, нови УГТ је клониранЦистанцхе тубулоса, вредна традиционална тоник кинеска биљка, која обилује различитим гликозидима као што су фенилетаноидни гликозиди, лигнан гликозиди и иридоидни гликозиди. Усклађивање секвенци и филогенетска анализа су то показалеЦтУГТ1је филогенетски удаљен од већине пријављених флавоноидних УГТ-а и у близини фенилпропаноидних УГТ-а. Опсежни ин витро тестови ензима су открили да јеЦтУГТ1нису били укључени у биосинтезу биоактивних гликозида уЦистанцхе тубулоса, могао би катализирати глукозилацију кумарина умбеллиферона 1, ескулетина 2 и химекромона 3 у значајном приносу. Гликозиловани производи су идентификовани упоређивањем са референтним стандардима или НМР спектроскопијом, а резултати су показали даЦтУГТ1може региоспецифично катализовати глукозилацију хидроксил кумарина на позицији Ц7- ОХ. Кључни остаци који су утврдилиЦтУГТ1Даље се расправљало о његовој активности на основу моделирања хомологије и анализа молекуларног спајања. У комбинацији са резултатима мутагенезе усмерене на место, откривено је да је Х19 играо незаменљиву улогу као кључна основа катализе.ЦтУГТ1може се користити у ензимском препарату биоактивних кумаринских гликозида.

Кључне речи:Биљне гликозилтрансферазе, кумарински гликозиди,Цистанцхе тубулоса, Моделирање хомологије, Мутагенеза усмерена на место

Цлицк то Цистанцхе екстракт користи производи

Увод

Гликозилација је један од најчешћих типова модификације структуре секундарних природних производа. Гликозилација би могла да промени стабилност и/или растворљивост агликона и много допринесе разноликости природних/неприродних производа због вишеструких типова коњугације. У биљкама, ове реакције су обично спроведене помоћу гликозилтрансфераза (УГТ) зависних од уридин дифосфата (УГТ), врста ензима који катализују трансфер моносахаридних делова са активираног нуклеотидног шећера на молекул акцептора гликозила који може бити угљени хидрат, лигокозид, или или полисахарид [1,2]

До данас су многи гени који кодирају УГТ изоловани из неколико биљака [3]. Гликозилација се углавном дешава на хидроксилним групама или карбоксилним групама широког спектра секундарних производа, као што су флавоноиди [4], фенилпропаноиди [5], терпеноиди [6], стероиди [7], алкалоиди [8] и тако даље. Кумарини су метаболити фенилпропаноида који су широко распрострањени у многим биљним врстама. Природни кумарини често постоје као гликокоњугати, а ови деривати су показали широк спектар фармаколошких активности, укључујући антиоксиданс [9], антивирусни [10,11], хепатопротективни [12], антиинфламаторни [13], антиканцерогени [14] ], антимутагени [15] и инхибиторне активности холинестеразе (ЦхЕ) и моноамин оксидазе (МАО) [14,15], итд. Међутим, до данас, у поређењу са најчешће пријављеним и опсежно истраживаним флавоноидима УГТ, само су ограничени УГТ били пријављени су способни да пренесу део шећера у кумарине [16–18].

Биљке богате различитим гликозидима могле би послужити као идеалан генски фонд УГТ-а са новим активностима катализе. Штавише, пријављено је да бројни УГТ поседују значајан акцепторски промискуитет да катализују гликозилацију више супстрата, од којих неки чак нису били раздвојени у биљкама [19]. У овом чланку, нова гликозилтрансферазаЦтУГТ1идентификован је изЦистанцхе тубулоса, традиционална лековита биљка која обилује различитим гликозидима као што су фенилетаноидни гликозиди (ПхГ), лигнан гликозиди и иридоидни гликозиди. Хетеролошка експресија и карактеризација функције су показали да иако рекомбинантноЦтУГТ1није био укључен у биосинтезу ових гликозида уЦистанцхе тубулоса, може катализовати глукозилацију хидроксил кумарина, а реакција се региоспецифично догодила на 7- ОХ позицији кумарина умбеллиферона 1, ескалирајући 2, и химекромона 3 да би се произвела три фармаколошки активна једињења скимминг (1а), цихориин (2а) , и 4-метилумбелиферил глукозид (3а) са значајним приносом, респективно. Поред тога, бензофенон супстрат 4,4′-дихидрокси бензофенон (4), изофлавонски супстрат генистеин (5) и антрахинон супстрат алое-емодин (6) такође могу бити прихваћени од странеЦтУГТ1. Каталитичка својства и кључни остаци који наглашавају способност катализеЦтУГТ1су такође процењени на основу хомолошког моделирања, АутоДоцк анализе и мутагенезе усмерене на место.

2. Експериментални

2.1. Биљни материјал и хемикалије

Цистанцхе тубулосакоришћена у овој студији прикупљена је из пустињских области у Хетиан, Ксињианг аутономним регионима. Њихов ботанички идентитет потврдио је професор Пенгфеи Ту са Универзитета у Пекингу. Тестирани кумарини и други супстрати у овој студији су купљени од Сигма-Алдрицх (Сент Луис, САД), Цхенгду Пусх Биотецхнологи Цо., Лтд. (Ченгду, Кина) и Цхенгду Биопурифи Пхитоцхемицалс Цо., Лтд. (Ченгду, Кина ) Уколико није другачије назначено. Референтни стандарди за скимминг (1а) и цицхориин (2а) су набављени од Вухан Цхем Фацес Биоцхемицал Цо., Лтд. (Вухан, Кина).

2.2. Молекуларно клонирање ЦтУГТ1 из Цистанцхе тубулоса

Укупна РНК одЦистанцхе тубулосаје екстрахован из меснате стабљике коришћењем комплета ОМЕГА Плант РНА (ГА, САД) и реверзно транскрибован на цДНК помоћу ПримеСцрипт™ РТ комплета реагенса (ТаКаРа, Јапан) према упутствима произвођача. Дегенерисани прајмер је дизајниран за 3′РАЦЕ на основу секвенци аминокиселина у конзервираној ПСПГ (Гликозилтрансферазе биљног секундарног производа) кутији биљних гликозилтрансфераза. Појачања на 3′-крају и 5′-крајуЦтУГТ1су спроведене коришћењем Смарт РАЦЕ цДНА Амплифицатион Кит (Цлонтецх, САД) према протоколу произвођача коришћењем прајмера (Табела С1). цДНК пуне дужинеЦтУГТ1је амплификован ПЦР-ом коришћењем КОД-Плус Нео ДНК полимеразе (ТОИОБО, Јапан) са паровима прајмера специфичним за ген (Табела С1) под следећим условима: почетни корак денатурације на 94 ◦Ц током 2 минута, након чега следи 35 циклуса денатурације на 98 ◦Ц током 15 с, жарење на 55 ◦Ц током 30 с, и продужавање на 68 ◦Ц током 55 с, са завршним кораком проширења на 68 ◦Ц током 7 мин. Сви добијени фрагменти ДНК су клонирани у пЕАСИ-Блунт вектор (ТрансГен Биотецх, Кина) и секвенционирани.

2.3. Поравнање секвенци и филогенетска анализа

Поравнање секвенцеЦтУГТ1са пријављеним гликозилтрансферазама (Табела С2) извршено је коришћењем софтверског пакета ДНАМАН 4.0 (Линнон Биософт, Канада). Мотиви и домени су анализирани коришћењем алата за очуване домене (хттп://ввв.нцби.нлм.них.Гов/Струцтуре/цдд/врпсб. цги). Филогенетско стабло је конструисано покретањем софтвера МЕГА 7.0.14 коришћењем методе спајања суседа са 1000 реплика за покретање [20]. Преведена секвенца протеина одЦтУГТ1је усклађен са познатим биљним гликозилтрансферазама депонованим у бази података НЦБИ ГенБанк (Табела С3) са ЦлусталВ.

2.4. Хетеролошка експресија и пречишћавање протеина ЦтУГТ1 у Есцхерицхиа цоли

Регион кодирања одЦтУГТ1је амплификован са БамХ И и Нот И као рестрикцијским местима коришћењем прајмера приказаних у Табели С1. ПЦР реакције су спроведене коришћењем КОД-Плус-Нео ДНК полимеразе (ТОИОБО, Осака, Јапан). Добијене секвенце су верификоване клонирањем у пЕАСИ-Блунт вектор (ТрансГен Биотецх, Кина). Потврђени производ амплификације одЦтУГТ1је затим дигестиран и субклониран у експресиони вектор пЕТ-28а( плус ) (Новаген, САД). Верификовани конструкт је затим трансформисан у Е. цоли Трансетта (ДЕ3) да би се добио рекомбинантни сој. Култура рекомбинантног соја преко ноћи је инокулисана у Луриа-Бертани (ЛБ) медијум који садржи 50 уг⋅мЛ− 1 канамицина и 40 уг⋅мЛ− 1 хлоромицетина у односу 1:1{{ 19}}0. Културе су узгајане на 37 ◦Ц, 200 рпм све док вредност ОД600 није достигла 0,4–0,6. Изопропил- -Д-тиогалактопиранозид (ИПТГ) је затим додат до коначне концентрације од 0,5 мМ и ћелије су узгајане 16 х на 18 ◦Ц, 180 рпм. Затим су ћелијске пелете сакупљене центрифугирањем (7600 × г, 10 мин, 4 °Ц) и поново суспендоване у 3 мЛ/г охлађеног пуфера за лизу (Напомена са додатним подацима 1) и поремећене соникацијом на леду. Остаци ћелија су уклоњени центрифугирањем на 7600 × г, 4 ◦Ц током око 30 мин. Пре-еквилибрисана Хистрап колона (ГЕ Хеалтхцаре, Уппсала, Шведска) је коришћена за афинитетну хроматографију према упутствима произвођача. Рекомбинантни протеин је елуиран са 10 запремина колоне пуфера за елуирање (Напомена са додатним подацима 1) који садржи 250 мМ имидазола. Чистоћа протеина је анализирана помоћу 10% СДС-ПАГЕ. Пречишћени протеин је концентрован у епрувети за ултрафилтрацију од 30 кДа (Сигма-Алдрицх, САД) и одсољен помоћу ПД-10 колоне (ГЕ Хеалтхцаре, Упсала, Шведска) са пуфером за одслађивање (Напомена са додатним подацима 1). Концентрација протеина је одређена Брадфордовом методом коришћењем БСА као стандарда.

2.5. Тестови ензимске активности и специфичност супстрата ЦтУГТ1

Да се ​​испита активност гликозилацијеЦтУГТ1, ензимски тестови су изведени у реакционој смеши (150 μЛ) састављеној од 0.4 мМ агликона, 0,8 мМ УДП-глукозе (УДПГ) и 50 уг пречишћеногЦтУГТ1протеина у пуферу за одсољавање. Све реакције су инкубиране на 30 ◦Ц током 12 х и прекинуте додавањем 300 μЛ хладног метанола. Смеше су центрифугиране на 15,000 × г током 30 минута да би се прикупио супернатант за ХПЛЦ-УВ/ЕСИ-МС анализе. Три паралелна теста су рутински спроведена за сваку реакцију. ХПЛЦ (Агилент 1260, САД) је опремљен детектором диодног низа и колоном ЦАПЦЕЛЛ ПАК Ц18 (250 мм × 4,6 мм, 5 μм; Схисеидо, Јапан) при брзини протока од 1 мЛ⋅мин−1 и температури колоне одржавана на 30 ◦Ц. Мобилна фаза се састојала од А (тј. 0,1% воденог раствора мравље киселине) и Б (тј. ацетонитрила). Градијент програми су наведени у табели С4. ХРЕСИ-МС подаци су снимљени на ЛЦМС-ИТ-ТОФ систему, опремљеним ЕСИ интерфејсом (Схимадзу, Кјото, Јапан) са Хе као колизиони гас ултра високе чистоће и Н2 као гасом за распршивање. Оптимизовани параметри извора ЕСИ били су следећи: брзина протока гаса у омотачу, 1,5 мЛ⋅мин−1; проток помоћног гаса, 1,5 мЛ⋅мин− 1; напон прскања, 4,5 кВ; температура капилара, 200 ◦Ц. Спектри су снимљени у опсегу 100–1500 м/з за МС анализу потпуног скенирања.

2.6. Ефекти времена реакције, пХ вредности и температуре на активност ензима и кинетичке студије ЦтУГТ1

Ефекти времена реакције, пХ вредности и температуре на активност ензимаЦтУГТ1су тестирани коришћењем УДПГ као донатора шећера и 3 као акцептора шећера у реакционим условима као што је горе описано. За одређивање оптималног пХ, активност ензима је упоређена у 1{{3}0 мМ пуферу (лимунска киселина-натријум цитрат) са пХ вредностима у распону од 3.0 до 6.{{ 14}}, 10{{20}} мМ пуфер (КХ2ПО4-К2ХПО4) са пХ вредностима у распону од 6.{28}} до 8.{29} }, 100 мМ пуфер (Трис-ХЦл) са пХ вредностима у распону од 7,0 до 9,0, 100 мМ пуфер (На2ЦО3-НаХЦО3) са пХ вредностима у распону од 9,0 до 11,0. Да би се одредила оптимална температура реакције, реакције су инкубиране на различитим температурама у распону од 0 до 65 ◦Ц. Временски токови реакције су процењени у 12 различитих временских тачака између 0 и 24 х. Сви експерименти су изведени у три примерка. Реакционе смеше су анализиране помоћу ХПЛЦ-МС као што је горе описано. За кинетичка проучавањаЦтУГТ1, ензимски тестови су изведени у коначној запремини од 100 μЛ која садржи 100 мМ КХ2ПО4-К2ХПО4 пуфера (пХ 8,0), 25 уг пречишћеногЦтУГТ1, 3 мМ УДПГ, и различите концентрације (50–3000 μМ) од 3. Реакције су спроведене на 37 ◦Ц током 30 мин, а затим прекинуте са 100 μЛ ледено хладног метанола. Све ове реакције су изведене у три примерка, а активност ензима је процењена квантификацијом одговарајућих глукозилованих деривата. Кинетички параметри, укључујући Мицхаелис–Ментен константу (Км) и Вмак, израчунати су нелинеарном регресионом анализом коришћењем софтвера ГрапхПад Присм 5.

2.7. Селективност донора супстрата и шећера ЦтУГТ1

Да бисте истражили преференције супстрата заЦтУГТ1, укупно 27 супстрата који припадају различитим структурним типовима тестирано је коришћењем УДПГ као донатора. Њихове хемијске информације су наведене у табели С5, а њихове структуре су приказане на сл. С1 и С2. Да се ​​испита селективност донатора шећераЦтУГТ1, анализе су спроведене коришћењем умбеллиферона (1), ескулетина (2), химекромона (3), 4,4′-дихидрокси бензофенона (4), генистеина (5) и алое-емодина (6) као супстрата са УДПГ, УДП- Н ацетил галактозамин, УДП-галактоза, ГДП-маноза, ГДП-фукоза, УДП галактуронска киселина, УДП-рамноза као донатори шећера, респективно. Сви експерименти су изведени у три примерка. Реакционе смеше су анализиране помоћу ХПЛЦ-МС као што је горе описано.

2.8. Припрема 4-метилумбелиферил глукозида (једињење 3а) од стране ЦтУГТ1

Препаративна реакциона смеша се састојала од {{0}}.034 ммол супстратног једињења 3, 0,04 ммол УДПГ, 5 мг пречишћеногЦтУГТ1у 50 мЛ реакционог пуфера. Реакције су лагано мешане при оптималним условима (100 мМ КХ2ПО4-К2ХПО4 са пХ 8,0; 37 ◦Ц). После инкубације на 37 ◦Ц током 24 х, реакциони супернатант је одвојен хроматографијом на колони са макропорозном смолом (МЦИ ГЕЛ ЦХП) након центрифугирања на 12,000 × г током 30 минута. Мобилна фаза је била градијент елуирања од 100 процената воде до 100 процената метанола. Свака фракција је анализирана помоћу ХПЛЦ-УВ. Фракције које су садржале само циљане производе су упарене до сува под сниженим притиском и окарактерисане 1Х спектроскопијом нуклеарне магнетне резонанце (НМР) и 13Ц НМР спектроскопијом.

2.9. Молекуларно спајање и мутагенеза ЦтУГТ1 усмерена на место

Протеински модел заЦтУГТ1установљен је коришћењем СВИСС-МОДЕЛА [21–25]. Кристална структура Медицаго трунцатула гликозил трансферазе УГТ85Х2 (ПДБ ИД 2ПК6) је изабрана као шаблонска структура [26]. Установљени модел је проценио ВЕРИФИ-3Д [27,28]. Ауто-Доцк Вина је коришћен за студије молекуларног спајања [29]. Кристална структура УГТ74Ф2 [30], гликозилтрансферазе из Арабидопсис тхалиана, у комплексу са лигандом УДП и салицилном киселином (ПДБ ИД 5У6М) коришћена је као контролна структура за анализу џепова донатора шећера и џепа акцептора шећера, респективно. . Ауто-Доцк-Тоолс 1.5.6 из МГЛТоолс (алата Лабораторије за молекуларну графику) коришћени су за припрему УДПГ донатора шећера и супстрата 1, 2 за молекуларно спајање. Бочни ланци остатака око шупљине активног места су постављени флексибилно, а ротирајуће везе лиганада су остављене да се ротирају. Најбоље рангирана поза према Вина доцкинг моделу са највећим (кцат/мол) афинитетом је подвргнута визуелној анализи помоћу софтвера ПиМОЛ 2.0.

За испитивања мутагенезе, ген оптимизован за секвенцуЦтУГТ1(Напомена са додатним подацима 2) је синтетизован и тестиран као дивљи тип. Мутагенеза усмерена на местоЦтУГТ1је спроведен коришћењем система брзе мутагенезе (ТрансГен Биотецх). Мутанти су амплификовани из шаблона оптимизованог гена који је конструисан у пЕТ-28вектор коришћењем специфичних прајмера приказаних у табели С1. Конструисани мутанти су верификовани ПЦР-ом и секвенцирањем пре него што су трансформисани у Е. цоли (ДЕ3) за хетерологну експресију. Пречишћавање протеина и ензимске реакције су изведене и анализиране као што је горе описано.

3. Резултати и дискусија

3.1. ЦДНК клонирање ЦтУГТ1 гена пуне дужине изЦистанцхе тубулоса

Цистанцхе тубулоса(Л.) (РоуЦонгРонг) је традиционална кинеска лековита биљка која производи широк спектар биоактивних природних гликозида. Требало би да постоји значајан број нових гена за гликозилтрансферазе који су постојали у његовом геному. Да би се пронашле нове гликозилтрансферазе са интересантним активностима катализе, дизајниран је дегенерисани прајмер за 3′-РАЦЕ на основу очуваног ПСПГ мотива за клонирање пермисивних УГТ изЦистанцхе тубулоса. Добијена 3′ крајња секвенца је даље анализирана НЦБИ бластом и специфичан прајмер за 5′-РАЦЕ је дизајниран на основу добијене секвенце. Амплифицирани 5' цДНК крајеви и 3' цДНК крајеви су спојени и пуна дужинаЦтУГТ1секвенца, укључујући 1739 нуклеотида, је добијена (слика С3) и наведена у напомени са додатним подацима 3. Након тога, отворени оквир за читање (ОРФ) одЦтУГТ1је пронађен помоћу алата НЦБИ ОРФ Финдер и кодирајућа секвенца од 1482 бп је успешно клонирана РТ-ПЦР амплификацијом коришћењем специфичних прајмера у табели С1. цДНК секвенца ЦтУГТ1 је достављена НЦБИ (приступни број МВ629113).

3.2. Анализа секвенце и хетерологна експресија ЦтУГТ1

ТхеЦтУГТ1очекивало се да ген кодира протеин од 493 аминокиселинске остатке са процењеном молекулском масом од 55,78 кДа. НЦБИ експлозија је открила да је изведена протеинска секвенцаЦтУГТ1дели највећи идентитет (76,39 процената) са ензимима сличним УГТ86А1-. Биохемијске функције ове врсте ензима нису у потпуности окарактерисане. Предвиђено је да они могу бити укључени у адаптацију биљака на абиотске стресове. Поравнање аминокиселинских секвенци ЦтУГТ1 и других биљних гликозилтрансфераза је приказано на слици С4.

Високо очувана 44 остатка ПСПГ мотива пронађена су на Ц-терминалуЦтУГТ1. Унутар ПСПГ-кутије, пептидна секвенца ХЦГВНС налази се на 373. аминокиселини, која је откривена у 95 процената свих гликозилтрансфераза [31]. Коначни остатак ПСПГ мотива био је глутамин, што указује да овај ензим има тенденцију да користи УДПГ као свог донатора шећера [32] (слика С4). Филогенетско стабло је конструисано на основу предвиђених полипептидних секвенциЦтУГТ1и различите врсте гликозилтрансфераза биљног порекла које су биле укључене у биосинтезу различитих секундарних метаболита. До сада је већина пријављених гликозилтрансфераза из биљака препознала флавоноиде као своје супстрате, као што су флавон 7-О-гликозилтрансферазе, флавоноид 3-О-глукозилтрансферазе, изофлавон 7-О-гликозилтрансферазе и халкон гликозилтрансферазе. Резултати филогенетских анализа су то показалиЦтУГТ1није груписано у кладу флавоноидних ГТ. Уместо тога, налази се поред УГТ74Т1 и УГТ74С1 (лигнан гликозилтрансферазе из Линум уситатиссимум) и НтГТ2 (кумарин гликозилтрансфераза из Ницотиана табацум), што указује даЦтУГТ1може имати неке нове активности катализе према фенилпропаноидним супстратима (слика 1), посебно ако се узме у обзир да су само ограничени чланови функционално идентификовани који припадају овим кладама.

Да би се даље открила његова активност катализе,ЦтУГТ1секвенца је експримирана под контролом Т7 лац промотера у Е. цоли Трансетта (ДЕ3) ћелијама као Хис6-означени фузиони протеин. Хис-означени рекомбинантЦтУГТ1је ефикасно пречишћен до хомогености Ни-НТА афинитетном хроматографијом. Молекуларна тежина пречишћеног рекомбинантног ЦтУГТ1 била је приближно 55 кДа (слика С5), што је у складу са предвиђеном молекулском масом.

3.3. Ин витро специфичност супстрата акцептора ЦтУГТ1

Да би се тестирала активност гликозилацијеЦтУГТ1, извршени су ин витро ензимски тестови. УДПГ је коришћен као донатор шећера. Акцептори шећера су одабрани на основу различитих брига. Прво,ЦтУГТ1ген је клониран изЦистанцхе тубулосачије су главне хемијске компоненте ПхГс. Да бисте проверили да лиЦтУГТ1је укључен у биосинтезу ПхГс, уобичајених агликона ПхГс инЦистанцхе тубулосакао што су тирозол (НП1, слика С2) и салидрозид (НП2, слика С2) прво су одабрани као супстрати. Нажалост, ХПЛЦ и ХРЕСИ-МС анализе нису пронашле никакве гликозиловане производе, што указује даЦтУГТ1можда неће бити укључени у биосинтезу ПхГс.

Друго, на основу поравнања секвенци и резултата филогенетске анализе (слика 1),ЦтУГТ1био је филогенетски повезан са лигнаноидним и кумарин гликозилтрансферазама, што сугерише даЦтУГТ1је вероватно фенилпропаноид гликозилтрансфераза. Да би се потврдило ово предвиђање, три супстрата кумарина 1, 2 и 3 заједно са једним лигнаноидним супстратом магнололом НП17 су тестирани као акцептори шећера, респективно. Као негативна контрола коришћени су ензими инактивирани топлотом (100 ◦Ц, 10 мин). ХПЛЦ-ХРЕСИ-МС анализа реакција коришћењем НП17 као супстрата није пронашла никакав производ. За разлику од тога,ЦтУГТ1показала очигледну способност глукозилације у односу на тестиране кумаринске супстрате (1,2,3). Користећи супстрат 1 као пример, као што је приказано на слици 2А, нови пик (1а) са смањеним временом задржавања (11,46 мин) у поређењу са супстратом 1 (19,75 мин) је произведен од странеЦтУГТ1са приносом од 37,78 одсто . Његов УВ апсорпциони спектар одговара 1. ХРЕСИ-МС спектар је показао да пик 1а показује [М плус Х] плус на м/з 325,1029, и [М плус На] плус при м/з 347,0710 (израчунато 347,0737 за ЦНа8О8 ) са предвиђеном формулом Ц15Х16О8, која је била за 162 аму већа од оне од 1 и у складу је са теоретском формулом глукозилованог производа (слика 2А). Слично, глукозиловани производ супстрата 2 (14,21 мин, слика 2Б) и 3 (21,92 мин, слика 2Ц) је такође пронађен у времену задржавања од 10,85 мин и 13,80 мин, са стопом конверзије од 22,03 процената и 68,67 процената. , редом. Молекуларна маса производа тачно се поклапала са израчунатом масом глукозилованих производа, што је то и потврдилоЦтУГТ1могао да катализује глукозилацију кумаринских једињења 1–3 (Табела 1).

Након тога, имајући у виду да је већина недавно пријављених ензима показала промискуитет катализе ин витро, да би се даље истражио спектар супстратаЦтУГТ1, експанзивни тестови ензима су спроведени према различитим једињењима која припадају различитим врстама природних производа, укључујући флавоноиде, фенолна једињења, кумарине, стилбене, антрахиноне, бензофенон, нафтален и иридоид (слике С1-С2), користећи УДПГ као донатор шећера. Утврђено је да бензофенон супстрат 4,4′-дихидрокси бензофенон (4), изофлавонски супстрат генистеин (5) и антрахинон супстрат алое-емодин (6) такође могу бити катализованиЦтУГТ1да би се формирао одговарајући глукозиловани производ 4а, 5а, 6а већег поларитета (слика 3). ХРЕСИ-МС анализа је показала да су пикови јона свих производа за 162 аму већи од оних супстрата, што сугерише даЦтУГТ1може катализовати глукозилацију ових једињења да би се формирао њихов одговарајући моноглукозидни производ. Стопе конверзије од 4, 5 и 6 биле су 4,12 одсто, 14,14 одсто и 23,33 одсто, респективно (Табела 1).

Селективност донатора шећераЦтУГТ1такође је истражен. Поред УДПГ, шест других донатора, укључујући УДП-Н-ацетил галактозамин, УДП галактозу, ГДП-манозу, ГДП-фукозу, УДП-галактуронску киселину и УДП рамнозу, тестирано је коришћењем супстрата 1-6 као акцептора. Резултати су то показалиЦтУГТ1искључиво изабран УДПГ као донатор шећера. Није примећен производ када су тестирани други активирани шећери (подаци нису приказани).

3.4. Биохемијска својства и кинетички параметри ЦтУГТ1

Биохемијске особинеЦтУГТ1су истраживани коришћењем 3 као акцептора шећера и УДПГ као донатора шећера као што је приказано на слици 4. Активност катализеЦтУГТ1је тестиран у температурном опсегу од 4–60 ◦Ц, оптимална активност је откривена на 37 ◦Ц (слика 4А). Анализа активности ензима између пХ 3.0 и 9.0 показала је да је оптимална пХ вредност примећена при пХ 8,0 (100 мМ пуфер КХ2ПО4-К2ХПО4, слика 4Ц). Принос производа глукозилације 3а се линеарно повећао у року од 1 х, а стопа раста се изједначила након 5 х (Слика 4Б). Привидна вредност км одЦтУГТ1за 3 је био 218,7 ± 7,176 μМ, а Вмак је био 0.02255 ± 0,0001796 нмол⋅мин− 1⋅уг− 1.

3.5. Ензимска припрема и структурна идентификација глукозилованих производа

На основу резултата ензимске анализе,ЦтУГТ1има тенденцију да буде специфична глукозилтрансфераза која би могла да катализује глукозилацију различитих врста природних производа. ХПЛЦ-ХР-МС информације о производима су сумиране у табели 1. Међу њима, супстрати кумарина су показали значајну стопу конверзије. Даље је анализирана активност ензима против кумарина. Треба напоменути да су сва три тестирана кумаринска супстрата прихваћена одЦтУГТ1имају хидроксилну групу на позицији Ц-7, док ескулетин (2) има додатну хидроксилну групу на позицији Ц-6. ХПЛЦ профил глукозилираног производа ескулетина је приказан на слици 2. Примећен је само један производ, што сугерише да се реакција глукозилације региоспецифично десила на Ц-6 или Ц-7 позицији. Да би се потврдило место гликозилације, производ 2а је идентификован поређењем са аутентичним глукозидима помоћу ХПЛЦ-УВ/ХРЕСИ-МС анализе. Приликом додавања аутентичног глукозида цихориина (глукозилованог на 7-ОХ позицији 2) у реакциони систем, пик се преклапао са 2а, ко-ХПЛЦ профил је даље потврдио да је гликозиловани производ 2 катализован од странеЦтУГТ1је цихориин [33], што је доказало да је глукозилни део специфично пренет на Ц7- ОХ позицију. Производ 1а је такође идентификован поређењем са референтним стандардом. УВ-ХПЛЦ спектри заједно са ко-ХПЛЦ анализом (слика 2) открили су да је хемијска структура 1а приписана као скиминг [34], што је глукозиловани производ 1 на позицији Ц7-ОХ.

Производ 3а је припремљен из повећане реакције и структурно окарактерисан ХРЕСИ-МС, 1Х НМР и 13Ц НМР спектроскопијом (слике С13, С14 и белешка 4). У 1Х НМР сигналу, у поређењу са супстратом 3, фенол хидроксил сигнал на позицији Ц{{10}} је нестао, а сигнал угљеника Ц-7 се померио за δ 1.{{25} } ппм у високо поље, док су се сигнали Ц-6 и Ц-8 померили у ниско поље у 13Ц НМР. Ови налази су потврдили да је глукопиранозилни остатак везан за фенолну хидроксилну групу на Ц-7 позицији 3 [35]. Осим тога, 1Х НМР спектар је показао аномерне протонске сигнале на δХ 5.00 (1Х, д, Ј=7.0 Хз); компонента шећера је назначена као -Д-глукопираноза. Овај резултат је показаоЦтУГТ1је кумарин О-глукозилтрансфераза која је катализовала глукозилацију хидроксил кумарина на 7- ОХ позицији.

3.6. Моделирање хомологије, молекуларно спајање и мутагенеза ЦтУГТ1 протеина усмерена на место

То су откриле опсежне ензимске реакцијеЦтУГТ1могао да катализује глукозилацију три кумарина у њихов одговарајући глукозиловани производ, а глукозиловани положај се посебно догодио на 7- ОХ позицији. Да се ​​идентификују кључни остаци који су одредили активности катализеЦтУГТ1, хомолошко моделирање, молекуларно спајање и испитивање мутагенезе усмерене на место ЦтУГТ1. Хомологно молекуларно моделирање за ЦтУГТ1 је успостављено коришћењем СВИСС-МОДЕЛ-а [21–25]. Кристална структура Медицаго трунцатула гликозил трансферазе УГТ85Х2 (ПДБ ИД 2ПК6), одређена у резолуцији од 2,1 А, показала је највећи укупни резултат са максималном хомологијом секвенце и ниском Е-вредношћу, изабрана је као шаблонска структура [26]. Процена рационалности успостављеног модела приказана је на дијаграму Рамацхандран (слика С6), 88,5 процената остатака у успостављеном моделу је у најповољнијем региону. Хомолошки модел ЦтУГТ1 састоји се од два слична мотива набора Россмановог типа на Н- и Ц-терминалном делу, респективно (слика 5А). Н-терминални домен има седам ланаца паралелних листова око десет спирала. Ц-терминални домен садржи шестоланчане листове окружене са девет спирала (слика 5А, С7).

Да додатно разјаснимо активни џеп одЦтУГТ1, извршено је молекуларно пристајање. Пошто УГТ85Х2 има само структуру апо форме, други хомолог УГТ74Ф2 са УДП и салицилном киселином као два лиганда изабран је као контролни шаблон. УДПГ је припремљен као донатор шећера. Два кумаринска супстрата 1 и 2 су припремљена као акцептори шећера. Места везивања донора и акцептора гликозила су израчуната и спојена одвојено као што је приказано на слици 5. Резултати су показали да се оба џепа за везивање налазе унутар дубоког расцепа у области интеракције чврсто упакованог Н-терминус домена и Ц -терминус домен офЦтУГТ1и просторно близу једна другој (сл. 5А). Ц-терминус офЦтУГТ1је углавном укључен у контакт са донором гликозила као што је описано у УГТ других биљака, а већина околних остатака је хидрофилна и високо конзервирана. Као што је типична ПСПГ кутија, остатак В377 у овом мотиву могао би да формира водоничне везе са глукозном групом УДПГ (слика 5Б); Н378 и С379 у овом мотиву могу да формирају водоничне везе са дифосфатном групом УДПГ (слика 5Б). Поред тога, према резултатима пристајања, остаци В356 и К359 могу да ступе у интеракцију са уридин групом кроз интеракцију водоничне везе како би стабилизовали донора у активном џепу. Да би се потврдила функција ових предвиђених кључних остатака, одабрано је укупно 16 места и подвргнуто мутагенези скенирања аланина. Активности катализе ових мутаната су тестиране коришћењем свих шест горе наведених позитивних супстрата. ХПЛЦ анализе су показале да, када су остаци Г18, Х19, С295, Ф296, В356, Ц357, К359, Х374, Г376, В377, Н378, С379, Е382, И397 и Д398 мутирани у гликослациона активност протеина, активност аланина потпуно изгубљен према свим тестираним подлогама. Ови резултати сугеришу да су горњих 16 остатака кључни остаци који су одредили везивање донора УДПГ и активност гликозилацијеЦтУГТ1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 процента) као што су В14, В132, Е153, Т212 и И209 (слика С8). Предвиђа се да би ови хидрофобни остаци који окружују ароматични прстен могли да формирају ван дер Валсове интеракције са супстратом у џепу за везивање.

4. Дискусија

Гликозилација је један од најважнијих корака модификације у путевима биосинтезе многих секундарних метаболита. Гликозилација би могла повећати биодоступност природних производа побољшањем њихове растворљивости у води и смањењем њихове токсичности. Кумарин се сматра најједноставнијим обликом у огромној класи фенолних супстанци које се јављају у природи, конструисаних од -пиронског прстена спојеног са бензенским прстеном. И природна и синтетичка једињења на бази кумарина привукла су велику пажњу медицинских хемичара и научника који дизајнирају лекове као последица њихових разноврсних фармаколошких и биолошких својстава [36]. Даља гликозилована модификација кумарина могла би помоћи да се обогати структурна разноликост ових једињења и такође побољша њихова растворљивост и биодоступност. У биљкама, такав процес гликозилације је катализован УДП-гликозилтрансферазом. Иако је вишеструко УГТ идентификовано из различитих биљака, до данас је већина пријављених УГТ била укључена у гликозиловану модификацију флавоноида. Пријављено је да само ограничени УГТ могу прихватити кумарине као супстрате. У овој студији, нови ген за гликозилтрансферазуЦтУГТ1је клониран из традиционалне кинеске биљкеЦистанцхе тубулоса. Усклађивање секвенци и резултати филогенетске анализе су то показалиЦтУГТ1је филогенетски удаљен од већине пријављених флавоноидних УГТ-а и много близак фенилпропаноидним УГТ-има. Опсежни тестови ензима открили су да ЦтУГТ1 не може катализовати гликозилацију једињења фенил етанола у формирање ПхГс, што је главна хемијска компонентаЦистанцхе тубулоса. Уместо тога, могао би препознати кумарине као своје супстрате и спровести реакцију гликозилације. Разјашњавање структуре производа показало је да место гликозилације катализованоЦтУГТ1региоспецифично се десило на Ц7-ОХ позицији кумарина. Користећи ЦтУГТ1, три кумаринска гликозида укључујући скиминг (1а), цихориин (2а) и 4-метилумбелиферил глукозид (3а) су успешно ензимски синтетизована и структурно идентификована. Сва ова три једињења су пријављена као фармацеутски активни молекули. На пример, сматра се да 1а поседује различите фармаколошке активности, укључујући ренопротективну активност, антиинфламаторна, антиканцерогена и антиамебна својства [37]. 2а је показао високу антибактеријску активност против неких Грам-позитивних бактерија као што су Бациллус цереус и Стапхилоцоццус ауреус [38]. 3а може помоћи биљкама да побољшају своје способности реаговања на хемикалије и токсине [39].

Поред кумарина, опсежни тестови ензима су то открилиЦтУГТ1такође је показао уочљиву активност глукозилације према супстрату 4 бензофенона, супстрату изофлавона 5 и супстрату антрахинона 6, што указује да ЦтУГТ1 има одређену толеранцију супстрата. ипак,ЦтУГТ1није могао да катализује биосинтезу компоненти гликозида уЦистанцхе тубулосакао што су фенилетаноидни гликозиди (ПхГ), лигнаноидни гликозиди и иридоидни гликозиди. Осим тога, према досадашњим истраживањима, нису изоловани кумарински гликозидиЦистанцхе тубулоса. Дакле, ин виво функција одЦтУГТ1тек треба даље истражити. Глукозилациона активност ЦтУГТ1 према кумаринским супстратима чини овај ензим корисним алатом за ензимску гликозилациону модификацију кумарина и такође указује да би секундарни метаболички ензими биљака могли да обављају непроцењиве активности катализе које су далеко изван њихових природних функција.

Изјава о конкурентским интересима

Аутори изјављују да нема сукоба интереса.

Признање

Овај рад је финансијски подржала Пекиншка фондација за природне науке (грант бр. 7192112); Програм спонзорисања младих елитних научника ЦАСТ-а (Грант бр. ЦАЦМ− 2018− КНРЦ1− 02); Национална фондација за природне науке Кине (грант бр. 81402809); Државни фонд за стипендије Кинеског савета за стипендије (бр. гранта 201906555010) и Научна фондација за елитне младе стипендисте Пекиншког универзитета кинеске медицине (грант бр. 2018-ЈИБ-КСЈК006).

Додатак А. Додатни подаци

Додатни подаци за овај чланак могу се наћи на мрежи на хттпс://дои. орг/10.1016/ј.фитоте.2021.104995.

Из: 'Молекуларно клонирање и биохемијска карактеризација нове кумарин гликозилтрансферазеЦтУГТ1изЦистанцхе тубулоса' од странеКсипинг Ксу, ет ал

---Фитотерапиа 153 (2021) 104995 хттпс://дои.орг/10.1016/ј.фитоте.2021.104995

Референце

[1] И. Ли, С. Балдауф, ЕК Лим, ДЈ Бовлес, Филогенетичка анализа мултигенске породице УДПгликозилтрансферазе Арабидопсис тхалиана, Ј. Биол. Цхем. 276 (2001) 4338–4343, хттпс://дои.орг/10.1074/јбц.М007447200.
[2] ЛФ Мацкензие, К. Ванг, РАЈ Варрен, СГ Витхерс, Глицосинтхасес: мутант глицосидасес фор олигосаццхариде синтхесис, Ј. Ам. Цхем. Соц. 120 (1998) 5583–5584, хттпс://дои.орг/10.1021/ја980833д.
[3] ЦЈ Тхибодеаук, ЦЕ Меланцон, ХВ Лиу, Необична биосинтеза шећера и гликодиверзификација природних производа, Натуре 446 (2007) 1008–1016, хттпс://дои.орг/ 10.1038/натуре05814.
[4] И. Ји, Б. Ли, М. Киао, Ј. Ли, Х. Ксу, Л. Зханг, Кс. Зханг, Адванцес он ин виво и ин витро гликозилације флавоноида, Аппл. Мицробиол. Биотецхнол. 104 (2020) 6587–6600, хттпс://дои.орг/10.1007/с00253-020-10667-з.
[5] Т. Коедука, И. Уеиама, С. Китајима, Т. Охнисхи, К. Матсуи, Молекуларно клонирање и карактеризација УДП-глукозе: испарљива бензеноид/фенилпропаноид глукозилтрансфераза у цветовима петуније, Ј. Плант Пхисиол. 252 (2020) 153245, хттпс://дои.орг/10.1016/ј.јплпх.2020.153245.
[6] С. Рахими, Ј. Ким, И. Мијаковић, КХ Јунг, Г. Цхои, СЦ Ким, ИЈ Ким, Тритерпеноид-биосинтхетиц УДП-глицосилтрансферасес фром плант, Биотецхнол. Адв. 37 (2019) 107394, хттпс://дои.орг/10.1016/ј.биотецхадв.2019.04.016.
[7] Г. Сингх, ИВ Дхар, МХ Асиф, П. Мисра, Истраживање функционалног значаја ензима стерол гликозилтрансферазе, Прог. Липид Рес. 69 (2018) 1–10, хттпс://дои. орг/10.1016/ј.плипрес.2017.11.001.
[8] КФ МцЦуе, ПВ Аллен, ЛВ Схепхерд, А. Блаке, Ј. Вхитвортх, ММ Маццрее, ДР Роцкхолд, Д. Стеварт, ХВ Давиес, ВР Белкнап, Примарна ин виво стероидна алкалоид глукозилтрансфераза из кромпира, Пхитоцхемистри. 67 (2006) 1590–1597, хттпс://дои.орг/10.1016/ј.пхитоцхем.
[9] Ј. Иу, Л. Ванг, РЛ Валзем, ЕГ Миллер, ЛМ Пике, БС Патил, Антиоксидативна активност цитрусних лимоноида, флавоноида и кумарина, Ј. Агриц. Фоод Цхем. 53 (2005) 2009–2014, хттпс://дои.орг/10.1021/јф0484632.
[10] ХЈ Цхо, СГ Јеонг, ЈЕ Парк, ЈА Хан, ХР Канг, Д. Лее, МЈ Сонг, Антивирусна активност ангелицина против гамахерпес вируса, Антивир. Рес. 100 (2013) 75–83, хттпс://дои.орг/10.1016/ј.антивирал.2013.07.009.
[11] З. Ксу, К. Цхен, И. Зханг, Ц. Лианг, Деривати на бази кумарина са снажном анти-ХИВ активношћу, Фитотерапиа. 150 (2021) 104863, хттпс://дои.орг/10.1016/ј. фитоте.2021.104863.
[12] АТ Мосса, ТМ Хеикал, М. Белаиба, ЕГ Раоелисон, Х. Ферхоут, Ј. Боуајила, Антиоксидативна активност и хепатопротективни потенцијал Цедрелопсис гревеи на оксидативни стрес изазван циперметрином и оштећење јетре код мужјака мишева, БМЦ Цомплемент. Алтерн. Мед. 15 (2015) 251, хттпс://дои.орг/10.1186/с12906-015-0740-2.
[13] И. Бансал, П. Сетхи, Г. Бансал, Цоумарин: потенцијално језгро за антиинфламаторне молекуле, Мед. Цхем. Рес. 22 (2013) 3049–3060, хттпс://дои.орг/10.1007/с00044-012-0321-6.
[14] М. Кумар, Р. Сингла, Ј. Дандрииал, В. Јаитак, Деривати кумарина као антиканцерогена средства за терапију рака плућа: преглед, Анти Цанцер Агентс Мед. Цхем. 18 (2018) 964–984, хттпс://дои.орг/10.2174/1871520618666171229185926.
[15] А. Стефанацхи, Ф. Леонетти, Л. Писани, М. Цатто, А. Царотти, Цоумарин: природна, привилегована и свестрана скела за биоактивна једињења, Молецулес 23 (2018) 250, хттпс://дои.орг /10.3390/молецулес23020250.
[16] Т. Тагуцхи, Н. Убуката, Х. Хаиасхида, М. Иамамото, Оказаки, клонирање и карактеризација глукозилтрансферазе која реагује на 7-хидроксил групу флавонола и 3-хидроксил групу кумарина из ћелије дувана, арх. Биоцхем. Биопхис. 420 (2003) 95–102, хттпс://дои.орг/10.1016/ј.абб.2003.09.027.
[17] Л. Зхоу, Т. Тиан, Б. Ксуе, Л. Сонг, Л. Лиу, Р. Иу, Биосинтеза кумаринских гликозида трансгеним длакавим коренима Полигонум мултифлорум, Биосци. Биотецхнол. Биоцхем. 76 (2012) 1008–1010, хттпс://дои.орг/10.1271/ббб.110347.
[18] Х. Канох, М. Кавауцхи, М. Куроианаги, Т. Арима, Молекуларно клонирање и карактеризација кумарин глукозилтрансферазе у длакавим коренима Пхарбитис нил (Ипомоеа нил), Плант Тиссуе Цулт. Летт. 31 (2014) 21–28, хттпс://дои.орг/10.5511/плантбиотецхнологи.13.1203а.
[19] ЈБ Хе, П. Зхао, ЗМ Ху, С. Лиу, И. Куанг, М. Зханг, Б. Ли, ЦХ Иун, Кс. Киао, М. Ие, Молекуларна и структурна карактеризација промискуитетне Цгликозилтрансферазе из Троллиуса Цхиненсис, Ангев. Цхем. Инт. Ед. инж. 58 (2019) 11513–11520, хттпс://дои.орг/10.1002/ание.201905505.
[20] С. Кумар, Г. Стецхер, К. Тамура, МЕГА7: анализа молекуларне еволуционе генетике верзија 7.0 за веће скупове података, Мол. Биол. Евол. 33 (2016) 1870–1874, хттпс://дои. орг/10.1093/молбев/мсв054.
[21] А. Ватерхоусе, М. Бертони, С. Биенерт, Г. Студер, Г. Тауриелло, Р. Гумиенни, ФТ Хеер, ТАП де Беер, Ц. Ремпфер, Л. Бордоли, Р. Лепоре, Т. Сцхведе, СВИСС-МОДЕЛ: моделирање хомологије протеинских структура и комплекса, Нуклеинске киселине Рес. 46 (2018) В296–В303, хттпс://дои.орг/10.1093/нар/гки427.
[22] Н. Гуек, МЦ Пеитсцх, Т. Сцхведе, Аутоматско упоредно моделирање структуре протеина са СВИСС-МОДЕЛ и Свисс-Пдб прегледником: историјска перспектива, Елецтропхоресис 30 (2009) С162–С173, хттпс://дои.орг/ 10.1002/елпс.200900140.
[23] С. Биенерт, А. Ватерхоусе, ТАП де Беер, Г. Тауриелло, Г. Студер, Л. Бордоли, Т. Сцхведе, СВИСС-МОДЕЛ репозиторијум-нове карактеристике и функционалност, Нуцлеиц Ацидс Рес. 45 (2017) Д313–Д319, хттпс://дои.орг/10.1093/нар/гкв1132.
[24] Г. Студер, Ц. Ремпфер, АМ Ватерхоусе, Г. Гумиенни, Ј. Хаас, Т. Сцхведе, КМЕАНДисЦо ограничења удаљености примењена на процену квалитета модела, Биоинформатика. 36 (2020) 1765–1771, хттпс://дои.орг/10.1093/биоинформатицс/бтз828.
[25] М. Бертони, Ф. Киефер, М. Биасини, Л. Бордоли, Т. Сцхведе, Моделирање протеинске кватернарне структуре хомо- и хетеро-олигомера изван бинарних интеракција помоћу хомологије, Сци. Реп. 7 (2017) 10480, хттпс://дои.орг/10.1038/с41598-017-09654-8.
[26] Л. Ли, ЛВ Модоло, ЛЛ Есцамилла-Тревино, Л. Ацхнине, РА Дикон, Кс. Ванг, Кристална структура Медицаго трунцатула УГТ85Х2-увид у структурну основу мултифункционалног (изо)флавоноида гликозилтрансфераза, Ј. Мол. Биол. 370 (2007) 951–963, хттпс://дои.орг/10.1016/ј.јмб.2007.05.036.
[27] Р. Лутхи, ЈУ Бовие, Д. Еисенберг, Процена модела протеина са тродимензионалним профилима, Натуре 356 (1992) 83–85, хттпс://дои.орг/10.1038/ 356083а0.
[28] РА Ласковски, МВ МацАртхур, ДС Мосс, ЈМ Тхорнтон, ПРОЦХЕЦК: програм за проверу стереохемијског квалитета протеинских структура, Ј. Аппл. Цристаллогр. 26 (1993) 283–291, хттпс://дои.орг/10.1107/С0907444998006684.
[29] О. Тротт, АЈ Олсон, АутоДоцк Вина: побољшање брзине и тачности спајања са новом функцијом бодовања, ефикасном оптимизацијом и вишенитношћу, Ј. Цомпут. Цхем. 31 (2010) 455–461, хттпс://дои.орг/10.1002/јцц.21334.
[30] АМ Георге Тхомпсон, ЦВ Ианцу, КЕ Неет, ЈВ Деан, ЈИ Цхое, Разлике у коњугацији глукозе салицилне киселине од стране УГТ74Ф1 и УГТ74Ф2 из Арабидопсис тхалиана, Сци. Реп. 7 (2017) 46629, хттпс://дои.орг/10.1038/среп46629.
[31] Т. Вогт, П. Јонес, Гликозилтрансферазе у синтези биљних природних производа: карактеризација породице супергена, Трендс Плант Сци. 5 (2000) 380–386, хттпс://дои.орг/10.1016/с1360-1385(00)01720-9.
[32] А. Кубо, И. Араи, С. Нагасхима, Т. Иосхикава, Промена специфичности донатора шећера биљних гликозилтрансфераза мутацијом у једној тачки, Арцх. Биоцхем. Биопхис. 429 (2004) 198–203, хттпс://дои.орг/10.1016/ј. абб.2004.06.021.
[33] Х. Канхо, С. Иаоиа, Т. Итани, Т. Накане, Н. Кавахара, И. Такасе, К. Масуда, М. Куроианаги, Глукозилација фенолних једињења помоћу длакавог корена Пхарбитис нил: И. Глукозилација кумарина и деривати флавона, Биосци. Биотецхнол. Биоцхем. 68 (2004) 2032–2039, хттпс://дои.орг/10.1271/ббб.68.2032.
[34] Ј. Бјерре, ЕХ Ниелсен, М. Болс, Хидролиза токсичних природних глукозида катализована циклодекстрин дицијанохидринима, Еур. Ј. Орг. Цхем. 2008 (2010) 745–752, ХТТПС:// дои.орг/10.1002/ејоц.200700954.
[35] Б. Ксуе, ЛБ Зхоу, ЈВ Лиу, РМ Иу, Биотрансформација деривата хидроксикумарина култивисаним ћелијама суспензије Цатхарантхус росеус, Пхармазие 67 (2012) 467–471, хттпс://дои.орг/10.1691/пх.1741 .
[36] Т. Ал-Вархи, А. Сабт, ЕБ Елкаеед, ВМ Елдехна, Недавна достигнућа средстава против рака на бази кумарина: најновији преглед, Биоорг. Цхем. 103 (2020) 104163, хттпс://дои.орг/10.1016/ј.биоорг.2020.104163.
[37] Кс. Ли, МИ Грубер, ДД Хегедус, ДЈ Лидиате, МЈ Гао, Ефекти деривата кумарина, 4-метхилумбеллифероне, на клијање семена и успостављање садница у Арабидопсис, Ј. Цхем. Ецол. 37 (2011) 880–890, хттпс://дои.орг/10.1007/с10886-011-9987-3.
[38] К. Ксу, ЗМ Фенг, ИН Ианг, ЈС Јианг, ПЦ Зханг, Осам нових сесквитерпеноида типа еудесмане и еремофилана из Атрацтилодес ланцеа, Фитотерапиа. 114 (2016) 115–121, хттпс://дои.орг/10.1016/ј.фитоте.2016.08.017.
[39] И. Лоу, Х. Ву, Ј. Зхенг, Кс. Хе, З. Ву, Кс. Лу, И. Киу, Одређивање и фармакокинетичка студија скимминга помоћу УХПЛЦ-МС/МС у плазми пацова, Ј. Пхарм . Биомед. Анал. 179 (2020) 112969, хттпс://дои.орг/10.1016/ј.јпба.2019.112969.