Морфолошке анализе експресије нефрина у прогресивној гломерулонефропатији

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Апстрактан:

У овој студији, фокусирали смо се на нефрин, један од кључних молекула унутар прорезане дијафрагме подоцита, јер иако је било извештаја о његовој експресији код људи и пацова, њихово присуство код обичних мармозета није пријављено. Испитивали смо експресију нефрина и промене у гломерулима, у зависности од развоја спонтане прогресивне гломерулонефропатије код обичних мармозета. Процењено је деветнаест обичних мармозета у доби од две до десет година. Бубрег је прегледан микроскопски са хематоксилином и еозином и имунохистохемијским бојењем на нефрин. Лезије су класификоване у три степена према претходно објављеном систему оцењивања бубрежних лезија. Морфометријском анализом је измерена нефрин-позитивна површина и израчунат је нефрин-позитивни однос. Експресија нефрина је примећена дуж капиларне петље гломерула у континуираном линеарном обрасцу у степену бубрежне лезије од 0 до 2 и било дисконтинуираном линеарном или грубом грануларном узорку у степену 3. Експресија нефрина је имала тенденцију значајног смањења у зависности од степена бубрежних лезија . Претпоставља се да промена у експресији нефрина игра важну улогу у прогресији бубрежних лезија.

Кључне речи:нефрин, мармозет,гломерулонефропатија, бубрега, патологија

бенефиције пустињске чистоћеиЦистанцхе биљкаје добро забубрега

Увод

Познато је да се спонтана прогресивна гломерулонефропатија код обичних мармозета (Цаллитхрик јаццхус) јавља често почевши од две године, са тежином лезије која напредује са годинама. Раније смо пријавили примарне и прогресивне лезије нефропатије код обичних мармозета1. Примарне гломеруларне промене нефропатије у раном стадијуму карактерише уклањање процеса стопала подоцита и делимично задебљање базалне мембране гломерула, за које се претпоставља да изазивају цурење протеина из гломерула, и могу се уочити ултрамикроскопијом, али не и светлосном микроскопијом1–3. Штавише, имуноглобулин игра важну улогу у прогресији нефропатије1, 2. ИгМ се депонује на мезангијум у раној фази гломерулонефропатије, а након првог таложења ИгМ, подручје депозита се шири на цео гломерул, а ИгА и ИгГ се депонован са прогресијом2. Хијалински завоји који сугеришу цурење протеина из гломерула могу се посматрати светлосном микроскопијом са прогресијом гломерулонефропатије4. Протеинурија погоршава прогресију тубулоинтерстицијалних лезија код обичних мармозета4, као код људи5, 6, и, у недавној студији гломерула, протеинурија би могла бити изазвана поремећајима дијафрагме прореза, чиме се повезују суседни ножни процеси (педицеле) подоцита. Прорезана дијафрагма је међућелијски спојни комплекс присутан између суседних стопала, а идентификовани су и неки молекули повезани са њеним формирањем3. Сматрало се да је смањење експресије ових молекула или дисфункција прорезане дијафрагме повезано са прогресијом протеинурије3. Нефрин, један од кључних молекула експримираних у прорезаној дијафрагми подоцита, је гликопротеин који се састоји од 1241 аминокиселине и добро је познати биомаркер који се користи за праћење поремећаја дијафрагме прореза7–10. Молекули који се односе на дијафрагме са прорезима нису проучавани у нефропатији обичних мармозета, иако је познато да се код њих јављају промене процеса стопала подоцита и прогресија протеинурије. Штавише, било је извештаја о експресији нефрина код људи и пацова7–12, али не и код мармозета. Због тога смо имунохистохемијским анализама истраживали експресију нефрина у гломерулима и промене у експресији нефрина у зависности од прогресије лезије.

цистанцхе тцм

Материјали и методе

Животиње

Ову студију је одобрио Институционални комитет за негу и употребу животиња Централне институције за експерименталне животиње (ЦИЕА; Кавасаки, Јапан) и спроведена је у строгом складу са Правилником о експериментисању на животињама ЦИЕА-е на основу Смерница за правилно понашање Експерименти на животињама (Научни савет Јапана, 2006). Процењено је деветнаест обичних мармозета (11 мужјака и 8 женки) из ЦЛЕА Јапан Инц. (Токио, Јапан). Њихова старост се кретала од 2 до 10 година у време обдукције. Животиње су биле смештене у кавезима у просторији за животиње која је одржавана на температури од 26 ± 3 степена и влажности од 55 ± 20 процената. Хранили су се ЛЦМС-1М (ЦЛЕА Јапан Инц., Токио, Јапан) и водом из чесме. Животиње су хумано жртвоване под анестезијом пентобарбитал натријумом због различитих узрока умирања (као што су синтекса, закривљеност лумбалних пршљенова, ишчашење мандибуларног зглоба итд.). Анализа урина није урађена јер није било могуће узети узорак урина.

Хистопатологија

Тхебубрезиперфузирани физиолошким раствором, затим 4 процента параформалдехида, а затим фиксирани у 10 процената неутрално пуферованог формалина за микроскопско испитивање. Узорци су уграђени у парафин, исечени на 5 μм дебљине и обојени хематоксилином и еозином (ХЕ). Лезије су класификоване као гломеруларне, тубуларне и интерстицијске лезије на основу објављених критеријума1. Оцене нефропатије су подељене у четири групе: степен 1 ​​(3 мушкарца и 1 жена), степен 2 (3 мушкарца и 5 жена), степен 3 (1 мушкарац и 3 жене) и степен 4 (3 мушкарца) (Табела 1).

За имунохистохемију, моноклонско антитело против екстрацелуларног домена људског порекланефрин(1:1,000, Непхринг{{0}}, Санта Цруз Биотецхнологи, Инц., Далас, Тексас, САД) је коришћено као примарно антитело. Секције 5- μм су депарафинизоване, рехидриране, третиране са 3 процента водоник пероксида на собној температури током 5 минута, а затим загрејане у аутоклаву на 121 степен током 20 минута у циљном раствору за извлачење (пХ 6,0, Дако, Глоструп, Данска). Након хлађења, секције су инкубиране са примарним антителом на 4 степена преко ноћи. Анти-мишји и анти-зечји ИгГ полимер коњуговани са пероксидазом (Хистофин Симпле Стаин Рат МАКС-ПО(МУЛТИ), Ницхиреи Биосциенце Инц., Токио, Јапан) коришћен је као секундарно антитело за метод базиран на полимеру13. Секције су инкубиране са секундарним полимерним антителом на собној температури током 30 минута, а производи реакције су визуелизовани коришћењем 3,3'-диаминобензидина као хромогена. Контрабојење је изведено хематоксилином. За негативну контролу, примарно антитело је изостављено.

Морфолошка анализа

За морфолошке анализе, гломерули са гломеруларним хилумом су предати на преглед, а 16 до 28 гломерула је снимљено на сваком предмету (Табела 1) коришћењем скенера целог слајда (Аперио АТ2, Леица Мицросистемс Инц., Буффало Грове, ИЛ, САД) и одговарајући софтвер за преглед слајдова патологије (Аперио ИмагеСцопе, Леица Мицросистемс Инц.) у истој резолуцији и величини слике.Непхрин-позитивне и целе гломеруларне области су израчунате помоћу софтвера за анализу слике (Имаге-Про В10, Медиацибенетицс Инц., Роцквилле МД, САД) цртањем области од интереса око гломерула, према претходном извештају14. Цело подручје гломерула је дефинисано као подручје које се може разликовати од беле позадине. Прагови боја за израчунавањенефрин-позитивне области су одређене према сваком стању бојења. Прагови за црвену, зелену и плаву били су 37–67, 31–77 и 32–88, респективно. Нефрин-позитивни однос је израчунат дељењем мерењанефрин-позитивно подручје изнад гломеруларног подручја. Статистичка анализа је обављена коришћењем Јонцкхеере теста (ниво значајности: 5 процената, једнострани тест) да би се проценио тренд између степена нефропатије и експресијенефрин.

цостанцхе

Резултати

Патолошки резултати и степени појединачних лезија бубрега приказани су у табели 1. Исто као што је наведено у нашем првом извештају1, степен лезије је имао тенденцију повећања са годинама и није било очигледне полне разлике. Резултати имунохистохемијског бојењанефринсу приказане на слици 1, анефрин-позитивни однос је приказан на Слици 2 и Табели 1. Међу оценама и оценама у Табели 1, степен бубрежне лезије, изведен из укупног скора сваке бубрежне лезије, и резултат хијалина коришћени су за поређење санефрин-позитивни однос (сл. 2 и 3). Појединачни случајеви у табели 1 приказани су узлазним редоследом степена лезије бубрега. Експресија нефрина је примећена заједно са гломеруларном капиларном петљом у континуираном линеарном узорку у степенима од 0 до 2 (Слика 1А–Ц) и дисконтинуираном линеарном или грубом грануларном шаром у степену 3 (Слика 1Д). У узорку негативне контроле, нема позитивне реакције занефринје примећено на било ком месту.

Поређење нанефрин-позитиван однос према степену бубрежне лезије је приказан на слици 2. У случајевима степена бубрежне лезије 0, средња ± стандардна девијација (СД)нефрин-позитивни однос је био 5,66 ± 1,18 процената, а максималне, минималне и средње вредности су биле 6,84 процената, 4,27 процената и 5,76 процената, респективно. У случајевима степена 1, средња вредност ± СД била је 3,99 ± 1,61 процената, а максималне, минималне и средње вредности биле су 5,69 процената, 1,19 процената и 4,35 процената, респективно. У случајевима степена 2, средња вредност ± СД била је 3,82 ± 2,25 процената, а максималне, минималне и средње вредности биле су 6,71 проценат, 1,58 процената и 3,49 процената, респективно. У случајевима степена 3, средња вредност ± СД била је 2,52 ± 1.02 процента, а максималне, минималне и средње вредности биле су 3,67 процената, 2,17 процената и 2,17 процената, респективно. Колективно, индивидуалне разлике у експресији нефрина биле су мале у случајевима степена 0, али велике у случајевима степена 1 или више, а спорадично је откривена ниска позитивна експресија.Непхринекспресија је имала тенденцију смањења у зависности од степена бубрежних лезија (слика 2). Постојао је значајно нижи тренд између степена лезије бубрега инефрин-позитиван однос према Јонцкхеере тесту (п=0.0166). Оцена хијалинског гипса у поређењу са степеном бубрежне лезије је приказана на слици 3. У случајевима са оценом хијалинског гипса од 0, средња вредност ± СД позитивног односа на нефрин била је 5,40 ± 1,32 процената, у случајевима 1 скор 4,10 ± 1,70 процената, ау скор 2 случаја био је 3,37 ± 1,98 процената. Према Јонцкхеере тесту (п=0.0654) постојао је значајно нижи тренд између резултата хијалинског гипса и нефрина позитивног односа.

Дискусија

Смањење нефрина је у корелацији са прогресијом бубрежних лезија током развоја гломерулонефропатије мармозета. Анти-нефринско антитело коришћено у овој студији препознало је екстрацелуларни домен на Н-терминалној страни. Овај екстрацелуларни домен је у интеракцији са НЕПХ1 молекулима и формира структуру налик патент затварачу унутар дијафрагме15. Локализација нефрина у нормалним гломерулима је дуж капиларне петље гломерула, а образац бојења је линеарни узорак континуираних финих гранула и код пацова и код људи11, 12, 16–18. Бојење изведено у овој студији је одговарајуће; што потврђује и запажање да зидови капилара у контакту са мезангијалном регијом нису обојени, док су они у контакту са подоцитима били обојени. У абнормалним условима, као што је нефротски синдром код људи или пуромицин аминонуклеозидна нефроза код пацова, образац бојења нефрина у гломерулима је дисконтинуиран и грубо гранулисан, а интензитет имунохистохемијског бојења је слабији него код нормалних гломерула11, 16. У овој студији, , образац експресије нефрина у оценама 0 до 2 је био нормалан; међутим, образац бојења у степену 3 био је упоредив са оним код абнормалних стања. У претходном истраживању експресије гломеруларног нефрина код Црл: ЦД(СД) пацова са болешћу минималних промена, експресија нефрина је била нетакнута, иако су процеси стопала подоцита показали брисање под електронском микроскопијом без очигледних морфолошких промена уочених под светлосном микроскопијом18. Код уобичајене бубрежне болести пацова, хроничне прогресивне нефропатије (ЦПН), показано је да албуминурија праћена ЦПН у раном стадијуму може довести до мање промена у гломеруларној пермеабилности због неуспеха да се албумин реапсорбује из проксималних тубула19. Код људи, било је неких истраживања о смањењу експресије нефрина под мањим променама10 или под другим болестима бубрега14, 16. С друге стране, постојао је извештај о интактној експресији нефрина у нефрози са минималним променама20. Присуство или одсуство промене у експресији нефрина код минималне промене нефротске болести се још увек расправља. У ствари, било је тешко потврдити повећање или смањење реакције антитела нефрина визуелним посматрањем код нефропатије мармозета, али је било могуће открити промену у целом бубрегу анализом слике. Наше истраживање сугерише да абнормалност прорезаних дијафрагми гломерула може бити укључена у прогресију нефропатије код обичних мармозета због смањења нефрина. Трансформација позитивног обрасца бојења нефрина, од линеарног до грануларног узорка, пријављена је на животињском моделу нефротске болести пацова током развоја лезије11, 16, 21. Повезаност између абнормалности мембране прореза и протеинурије је често пријављен22, 23; стога се спекулише да протеинурија може бити узрокована дисфункцијом дијафрагме. У нашој студији о нефропатији мармозета, прогресија гломеруларне пропустљивости протеина због дисфункције дијафрагме прореза је могла да се деси јер су морфолошке карактеристике хијалинских гипса уочене само у случајевима без тубулоинтерстицијалних промена. У овој студији није уочена статистички значајна разлика између скора морфолошких промена хијалинских гипса и смањења експресије нефрина. Међутим, експресија нефрина има тенденцију да се смањи у зависности од резултата хијалинског гипса, што је индикатор цурења протеина из гломерула.

У нашем претходном истраживању уочено је брисање процеса стопала у раној фази нефропатије мармозета, а захваћено подручје стопала је проширено у зависности од степена бубрежне лезије1. Табела 2 показује однос између стопе смањења нефрина у овој студији и налаза електронске микроскопије за сваки степен лезије бубрега из претходне студије. Сматра се да је брисање узроковано сломом актинског цитоскелета наставцима стопала24. Нефрин је дефосфорилисан када је прорезана мембрана конструисана, и везује се за актин преко ЦД2АП и подоцина25, 26. Када је прорезана дијафрагма повређена, молекули нефрина се групишу, изазивајући фосфорилацију нефрина, полимеризацију актина и еффагацију процеса26. Фосфорилација нефрина се такође дешава брзо након индукције брисања процеса стопала у моделу протамин сулфата код мишева27. Нефрин је гломеруларни адхезиони протеин повезан са сазревањем подоцита, диференцијацијом, формирањем процеса и сигнализацијом24. Наше истраживање је показало да постоји корелација између смањења експресије нефрина, како је утврђено имунохистохемијом, и прогресије степена бубрежне лезије, што указује на експанзију уклањања процеса стопала подоцита. Међутим, нејасно је да ли абнормалности у комплексу протеина дијафрагме прореза узрокују оштећење процеса стопала подоцита или ако оштећење подоцита изазива промене у дијафрагми прореза и смањење нефрина. Пошто је нефрин такође укључен у диференцијацију подоцита, сматра се да ће овај однос бити додатно разјашњен подацима о регенерацији и диференцијацији подоцита.

У закључку, наши резултати пружају информације онефринекспресија у прогресивној гломерулонефропатији код обичних мармозета. Морфолошка анализа открила је нижи тренд однефринекспресија у подоцитима у прогресивној гломерулонефропатији обичних мармозета, и променанефринсугерисано је да експресија игра важну улогу у прогресији бубрежних лезија.

Откривање потенцијалног сукоба интереса:

Аутори изјављују да немају сукоб интереса.

Признање:

Аутори би желели да се захвале господину Такаиосхи Итоу на одличној техничкој помоћи коју су пружили. Аутори се такође захваљују госпођи Канае Таматсукури и господину Џејмсу Харади на језичком уређивању рукописа.

систанцх

Референце
1. Иамада Н, Сато Ј, Канно Т, Вако И и Тсуцхитани М. Морфолошка студија прогресивне гломерулонефропатије код обичних мармозета (Цаллитхрик јаццхус). Токицол Патхол. 41: 1106–1115. 2013.
2. Иамада Н, Хасхимото Н, Камиие Ј, Дои Т, Сато Ј, Иноуе Т, Схирота К и Тсуцхитани М. Однос између депозиције имуноглобулина и раних лезија прогресивне гломерулонефропатије код младих обичних мармозета. Вет Патхол. 55: 173–176. 2018.
3. Цара-Фуентес Г, Цлапп ВЛ, Јохнсон РЈ и Гарин ЕХ. Патогенеза протеинурије код идиопатске болести минималних промена: молекуларни механизми. Педиатр Непхрол. 31: 2179–2189. 2016.
4. Исобе К, Адацхи К, Хаиасхи С, Ито Т, Мииосхи А, Като А и Сузуки М. Спонтане гломеруларне и тубулоинтерстицијалне лезије код обичних мармозета (Цаллитхрик јаццхус). Вет Патхол. 49: 839–845. 2012.
5. Едди АА. Протеинурија и интерстицијална повреда. Трансплантација Непхрол Диал. 19: 277–281. 2004.
6. Хингорани С, Гоолеи Т, Пао Е, Сандмаиер Б и МцДоналд Г. Уринарни цитокини након ХЦТ: докази за упалу бубрега у патогенези протеинурије ибубрегаболест. Трансплантација коштане сржи. 49: 403–409. 2014.
7. Кестила М, Ленккери У, Манникко М, Ламердин Ј, МцЦреади П, Путаала Х, Руотсалаинен В, Морита Т, Ниссинен М, Херва Р, Касхтан ЦЕ, Пелтонен Л, Холмберг Ц, Олсен
А и Триггвасон К. Позитивно клонирани ген за нови гломеруларни протеин--нефрин-- је мутиран у конгениталном нефротском синдрому. Мол Целл. 1: 575–582. 1998.
8. Лангхам РГ, Келли ДЈ, Цок АЈ, Тхомсон НМ, Холтхофер Х, Заоуи П, Пинел Н, Цордонниер ДЈ и Гилберт РЕ. Протеинурија и експресија протеина дијафрагме подоцита, нефрина, у дијабетичкој нефропатији: ефекти инхибиције ензима који конвертује ангиотензин. Диабетологиа. 45: 572–1576. 2002.
9. Велсх ГИ и Салеем МА. Молекул гломеруларног подоцита са потписом нефрина? Ј Патхол. 220: 328–337. 2010.
10. ван де Лест НА, Зандберген М, ИЈпелаар ДХТ, Волтербеек Р, Бруијн ЈА, Бајема ИМ и Сцхарпфенецкер М. Губитак нефрина може се користити за предвиђање ремисије и дуготрајног бубрежног исхода код пацијената са болешћу минималних промена.БубрегИнт Реп. 3: 168–177. 2017.
11. Кавацхи Х, Коике Х, Курихара Х, Иаоита Е, Орикаса М, Схиа МА, Сакаи Т, Иамамото Т, Салант ДЈ и Схимизу Ф. Клонирање нефрина пацова: експресија у развоју гломерула и у протеинурским стањима.БубрегИнт. 57: 1949–1961. 2000.
12. Луимула П, Ахола Х, Ванг СКС, Солин МЛ, Аалтонен П, Тикканен И, Керјасцхки Д, и Холтхофер Х. Непхрин у експерименталној гломеруларној болести.БубрегИнт. 58: 1461–1468. 2000.
13. Јанардхан КС, Јенсен Х, Цлаитон НП и Херберт РА. Имунохистохемија у истраживачкој и токсиколошкој патологији. Токицол Патхол. 46: 488–510. 2018.
14. Кооп К, Еикманс М, Баелде ХЈ, Кавацхи Х, Де Хеер Е, Паул ЛЦ и Бруијн ЈА. Експресија молекула повезаних са подоцитима код стеченог човекабубрегаболести. Ј Ам Соц Непхрол. 14: 2063–2071. 2003.
15. Герке П, Хубер ТБ, Селлин Л, Бензинг Т и Валз Г. Хомодимеризација и хетеродимеризација гломеруларних подоцитних протеина нефрина и НЕПХ1. Ј Ам Соц Непхрол. 14: 918–926. 2003.
16. Доублиер С, Руотсалаинен В, Салвидио Г, Лупиа Е, Бианцоне Л, Цоналди ПГ, Репонен П, Триггвасон К и Цамусси Г. Редистрибуција нефрина на подоцитима је потенцијални механизам за протеинурију код пацијената са примарно стеченим нефротским синдромом. Ам Ј Патхол. 158: 1723–1731. 2001.
17. Каваками Х, Камиие Ј, Иасуно К, Кобаиасхи Р, Аихара Н и Схирота К. Динамика апсолутне количине нефрина у једном подоциту код пацова са пуромицин аминонуклеозидном нефрозом израчуната квантитативним приступом гломеруларне протеомике са одабраним начином праћења реакције. Трансплантација Непхрол Диал. 27: 1324–1330. 2012.
18. Иасуно К, Хонда К, Хакамата С, Каи К и Мори К. Болест минималних променабубрегакод младог пацова Спрагуе Давлеи. Ј Токицол Патхол. 31: 55–59. 2018.
19. Оберт ЛА и Фразиер КС. Учешће интрареналног ренин-ангиотензин система у патогенези хроничне прогресивне нефропатије - премошћивање информационог јаза између дисциплина. Токицол Патхол. 47: 799–816. 2019.
20. Патракка Ј, Руотсалаинен В, Кетола И, Холмберг Ц, Хеикинхеимо М, Триггвасон К и Јаланко Х. Експресија нефрина у педијатријибубрегаболести. Ј Ам Соц Непхрол. 12: 289–296. 2001.
21. Саран АМ, Иуан Х, Такеуцхи Е, МцЛаугхлин М и Салант ДЈ. Комплемент посредује у редистрибуцији нефрина и дисоцијацији актина у експерименталној мембранској нефропатији.БубрегИнт. 64: 2072–2078. 2003.
22. Гаглиардини Е, Бенигни А, Томасони С, Аббате М, Каллури Р и Ремуззи Г. Циљана регулација екстрацелуларног нефрина у хуманој ИгА нефропатији. Ам Ј Непхрол. 23: 277–286. 2003.
23. Вакаматсу А, Фукусуми И, Хасегава Е, Томита М, Ватанабе Т, Нарита И и Кавацхи Х. Улога калцинеурина (ЦН) убубрегагломеруларни подоцит: ЦН инхибитор је побољшао протеинурију инхибирајући редистрибуцију ЦН на дијафрагми са прорезом. Пхисиол Реп. 4: е12679. 2016.
24. Гарг П. Преглед биологије подоцита. Ам Ј Непхрол. 47 (Суппл 1): 3–13. 2018.
25. Ицхимура К, Курихара Х и Сакаи Т. Организација актинских филамента процеса стопала у подоцитима пацова. Ј Хистоцхем Цитоцхем. 51: 1589–1600. 2003.
26. Ронцо П. Протеинурија: да ли је све у стопалу? Ј Цлин Инвест. 117: 2079–2082. 2007.
27. Верма Р, Ковари И, Соофи А, Нихалани Д, Патрие К и Холзман ЛБ. Ангажовање ектодомена нефрина доводи до активације Срц киназе, фосфорилације нефрина, регрутовања Нцк-а и полимеризације актина. Ј Цлин Инвест. 116: 1346–1359. 2006.