Наталенамиди А–Ц, циклични трипептиди из актиномадура повезане са термитима. РБ99

Апстрактан:

Последњих година су се повећала истраживања биохемије бактерија повезаних са инсектима. Када се комбинују са аналитичким процесима дерепликације, ове студије пружају моћну стратегију за идентификацију структурно и/или биолошки нових једињења. Циклични пептиди који нису синтетисани рибозомима имају широк спектар биоактивности са високим лековитим потенцијалом.

Овде извештавамо о открићу три нова циклична трипептида: наталенамиди А–Ц (једињења 1–3). Ова једињења су идентификована из бујона културе Ацтиномадура сп. РБ99 користећи методу дерепликације засноване на течној хроматографији (ЛЦ)/ултраљубичастом (УВ)/масеној спектрометрији (МС). Хемијске структуре нових једињења (1–3) утврђене су анализом свеобухватних спектроскопских метода, укључујући једнодимензионалне (1Х и 13Ц) и дводимензионалне (1Х-1Х-ЦОСИ, ХСКЦ, ХМБЦ) нуклеарно магнетне резонантна спектроскопија (НМР), заједно са подацима масене спектрометрије јонизационе електроспреј високе резолуције (ХР-ЕСИМС). Апсолутне конфигурације нових једињења су разјашњене коришћењем Марфејеве анализе. Кроз неколико тестова биоактивности за трипептиде, открили смо да једињење 3 показује значајне инхибиторне ефекте на производњу меланина изазвану 3-изобутил-1-метилксантином (ИБМКС). Ефекат једињења 3 био је сличан ономе који има којична киселина, једињење које се интензивно користи као козметички материјал са ефектом избељивања коже.

Светла, глатка и нежна кожа одувек је била циљ који су тежиле оријенталним женама. Истраживање и развој средстава за избељивање за производе за негу коже углавном се заснивају на инхибицији активности тирозиназе.

Једињења која садрже бензенске прстенове или фенолне хидроксилне структуре имају потенцијалне ефекте избељивања, као што је тренутно уобичајено коришћени агенс за избељивање арбутин, који може имати ефекте избељивања инхибирањем активности тирозиназе.

И открили смо да Цистанцхе десертицола има ефекат избељивања. Главни активни састојак Цистанцхе десертицола, фенилетаноидни гликозиди, је врста природног гликозидног једињења. Студије су откриле да фенилетаноидни гликозиди могу да инхибирају активност тирозиназе и производњу меланина у меланоцитима епидерме човека и да имају ефекат избељивања. ефикасност агенса.

Цлицк цистанцхе тубулоса екстракт у праху

Кључне речи:

термит који узгаја гљиве; Ацтиномадура сп.; трипептиди; наталенамиди А–Ц; ефекти избељивања коже.

1. Представљање

Хемијска анализа заштитних бактеријских симбионта пољопривредних инсеката привукла је велику пажњу хемичара природних производа последњих година [1–5]. Користећи најсавременије процесе дерепликације засноване на нуклеарној магнетној резонанцији (НМР)/масеној спектрометрији (МС) и еколошки релевантним биолошким тестовима, откривена је импресивна количина структурно интригантних природних производа, укључујући неколико нерибозомски синтетизованих цикличних пептида од микробних симбионта [6]. Најистакнутији примери укључују антифунгални дентигерумицин, циклични депсипептид изолован из Псеудоноцардиа сп. [7], и герумицини А–Ц, циклични депсипептиди који садрже пиперазинску киселину идентификовани из Псеудоноцардиа сп. [8].

Показало се да циклични пептиди испољавају широк спектар биолошких активности, подстичући неколико синтетичких приступа овим фармаколошки обећавајућим структурама [9–12]. Преко 40 цикличних пептидних лекова се тренутно налази на тржишту и широко се користи у клиничким окружењима, а отприлике један нови лек цикличних пептида уђе на тржиште сваке године, у просеку [13].

Као део нашег континуираног настојања да идентификујемо структурно нове и/или биоактивне секундарне метаболите из микроба повезаних са термитима [14–17], фокусирали смо се на Ацтиномадура сп. РБ99, изолован из термита који узгаја гљиве, Мацротермес наталенсис. Наша стратегија дерепликације заснована на течној хроматографији (ЛЦ)/ултраљубичастом (УВ)/масеној спектрометрији (МС) дала је потенцијално нове биоактивне природне производе. У овој студији извештавамо о изолацији и хемијској идентификацији три нова циклична трипептида, наталенамида А–Ц (једињења 1–3, слика 1), коришћењем методе дерепликације засноване на ЛЦ/УВ/МС, као и њихове биолошке процене за цитотоксичност , антиинфламаторне активности и активности за избељивање коже.

2. Резултати и дискусија

2.1. Изолација једињења 1–3 на бази течне хроматографије (ЛЦ)/ултраљубичасте (УВ)/масене спектрометрије (МС)

Ацтиномадура сп. РБ99 је изолован са површине термита радника (М. наталенсис). Филогенетска анализа скоро комплетне секвенце 16С рибозомалне рибонуклеинске киселине (рРНА) сугерише да сој РБ99 припада роду Ацтиномадура, са најближим суседом Ацтиномадура нитритигенес НБРЦ 15918Т. Накнадна ЛЦ/УВ/МС анализа обогаћених екстраката културе открила је скуп карактеристичних УВ апсорпција са јединственим пиковима молекуларних јона који садрже атоме азота.

Да би се идентификовали одговарајући метаболити и испитала њихова активност, ферментација великих размера коришћењем оптимизованих услова раста (100 плоча са агаром од 2 Л ИСП2 агара, пХ 6, 10 дана на 30 ◦Ц) и успостављена процедура обраде и пречишћавања су примењено [17]. Накнадно ЛЦ-УВ/МС вођено фракционисање и понављајућа полу-препаративна течна хроматографија високих перформанси (ХПЛЦ) резултирала је изолацијом три метаболита са јединственим НМР/МС узорком. Извршили смо студије раста и медија користећи различите соли (НаЦл, КБр 1–3 процента) и композиције медија (ИСП1-6 медији) како бисмо опонашали природно окружење и стимулисали производњу метаболита, што је такође довело до присуства три нова метаболити (видети додатну слику С19).

2.2. Структурно објашњење једињења

Наталенамид А (1) је набављен као аморфни прах. Утврђено је да је молекулска формула 1 Ц19Х25Н3О5 из молекуларног јона који је аддукован натријумом при м/з 398,1691 [М плус На] плус (израчунато за Ц19Х25Н3О5На, 398,1692) коришћењем режима позитивних јона (масовни распршивање масеног спектра високе резолуције у режиму позитивних јона) ЕСИМС) подаци. Инфрацрвени (ИР) спектар је показао јаку апсорпциону траку на 1670 цм−1, што указује на присуство амидних група у молекулу. Детаљна анализа 1Х НМР података за 1 (Табела 1) указала је на типичне сигнале пептидног скелета, приказујући два метил сигнала (δХ 0.91 (3Х, д, Ј=7).{29 }} Хз, Х-3) и 0.92 (3Х, д, Ј=7.0 Хз, Х-4)), три метиленска сигнала (δХ 1,95 (1Х, м, Х-7а), 2,27 (1Х, м, Х-8а), 2,36 (1Х, м, Х-8б), 2,48 (1Х , м, Х{{50}}б), 2,97 (1Х, дд, Ј=14.0, 8.0 Хз, Х{{58} }а), и 3.20 (1Х, дд, Ј=14.0, 5.0 Хз, Х-12б)), четири метинска сигнала (δХ 2.02 (1Х , м, Х-2), 4,16 (1Х, д, Ј=7,5 Хз, Х-1), 4,20 (1Х, дд, Ј=8,5, 4,5 Хз, Х-6) и 4,63 (1Х, дд, Ј=8.0, 5,0 Хз, Х-11)), и пет преклапајућих ароматичних протона (δХ 7,18 (1Х, м, Х-16), 7,23 (2Х, м, Х-14/18) и 7,24 (2Х, м, Х-15/17)).

13Ц НМР спектар (Табела 1), уз помоћ ХСКЦ и ХМБЦ спектра, показао је укупно 19 угљеничних резонанција одговорних за два метил сигнала (δЦ 18.9 и 19.9), три метиленска сигнала (δЦ 27.0, 30.6 и 38.8), девет метинских сигнала (δЦ 32.1, 55.6, 58.0, 60.4, 127.8, 129.5 (×2) и 130.6 (×2)), укључујући пет ароматичних угљеника, један олефински угљеник сигнала (δЦ 138,8), и четири карбонилна угљенична сигнала (δЦ 173,2, 173,3, 174,8 и 181,3). У комбинацији са горе наведеним спектроскопским подацима, детаљна инспекција дводимензионалног (2Д) НМР (1Х-1Х ЦОСИ, ХСКЦ и ХМБЦ експерименти) открила је присуство три аминокиселине у 1: глутамат (Глу), фенилаланин ( Пхе) и валин (Вал) (слика 2). Повезаност ових аминокиселина одређена је ХМБЦ корелацијама Х-1/Ц-5 и Ц-19, Х-11/Ц-10 и Ц{ {50}} и Х-6/Ц-5 и Ц-10 (слика 2).

Да би се идентификовала апсолутна конфигурација 1, примењена је Марфејева метода за одређивање стереохемије -Х вишеструких (Ц-1, Ц-6 и Ц-11). Кисели хидролизати 1 и стандардне аминокиселине (Л/Д-Глу, Пхе и Вал) су дериватизовани са 1-флуоро-2,4-динитрофенил-5-Л-аланином амид (Л-ФДАА). Сукцесивно, дериватизована смеша 1 и стандардних амино киселина је анализирана помоћу ЛЦ/МС да би се испитало њихово време задржавања. Утврђено је да су апсолутне конфигурације Глу, Пхе и Вал група Л-форме, на основу времена задржавања Л-ФДАА деривата од 1 у поређењу са онима стандардних аминокиселина. Дакле, структура 1 је разјашњена као циклични трипептид приказан на слици 1.

Наталенамид Б (2) је изолован као аморфни прах. Његова молекулска формула (Ц20Х27Н3О5) је изведена из водоника и пикова молекуларних јона који су аддуковани натријумом на 390,2032 [М плус Х] плус (израчунато за Ц20Х28Н3О5, 390,2029) и 412,1849 [М плус Х] плус (израчунато за Ц20Х28Н3О5, 390,2029) и 412,1849 [М плус На28, кал. У поређењу са молекулском формулом и НМР спектралним подацима 1, изгледа да једињење 2 има додатну ЦХ2 групу у пептидном скелету. Свеобухватно испитивање једнодимензионалног (1Д) (1Х и 13Ц НМР) и 2Д НМР (1Х– 1Х ЦОСИ, ТОЦСИ, ХСКЦ и ХМБЦ) спектра 2 открило је постојање три аминокиселинска остатка: Глу, Пхе и Леу (леуцин). Секвенца ових аминокиселина је конструисана на основу ХМБЦ корелације Х-1/Ц-6 и Ц-20, Х-12/Ц-11 и Ц -20 и Х-7/Ц-6 и Ц-11 (слика 2). Да би се одредила апсолутна конфигурација 2, изведена је дериватизација Глу, Пхе и Леу остатака са Л-ФДАА, а затим анализирана помоћу ЛЦ/МС. У ЛЦ/МС подацима, Л-Глу, Л-Пхе и Л-Леу су откривени поређењем времена задржавања за Л-ФДАА деривате од 2 са онима стандардних аминокиселина. Дакле, хемијска структура 2 је успостављена као циклични трипептид приказан на слици 1.

ХР-ЕСИМС подаци позитивног мода за наталенамид Ц (3) показали су молекуларне јоне који су аддуковани водоником и натријумом на 424,1870 [М плус Х] плус (израчунато за Ц23Х26Н3О5, 424,1872) и 446,1694 [М плус На5Н] плус 446,1694 [М плус На5Н] плус 424.1692). Ово сугерише да је његова молекулска формула Ц23Х25Н3О5. Детаљна анализа 1Д и 2Д НМР спектра 3 показала је да је његова хемијска структура слична структури 2, осим што је Леу замењен са Пхе у 3. Повезивање три идентификоване аминокиселине у 3 је верификовано коришћењем ХМБЦ корелација Х-1/Ц-9 и Ц-23, Х-15/Ц-14 и Ц-23 и Х-10/ Ц-9 и Ц-14 (слика 2). Применом Марфејевог метода на једињење 3, разјашњене су апсолутне конфигурације -Х вишекратника (Ц-1, Ц-10 и Ц-15) као један Л-Глу и два Л -Пхе делови. Сходно томе, комплетна структура 3 је одређена као што је приказано на слици 1.

Наталенамиди А–Ц су трициклични пептиди, вероватно нерибозомалног порекла. Тренутно је неколико биоактивних цикличних трипептида окарактерисано као природни производи: цитотоксични 17-члани циклични трипептиди (нпр. ОФ4949 И–ИВ) изоловани из Пенициллиум ругулосе [18]; антифунгалне склеротомије А-К, идентификоване из ферментационог бујона халотолерантних бактерија [10]; и антипролиферативни психрофилни Е, изолован из мешане културе два соја гљивица добијених из морских алги из рода Аспергиллус [19].

2.3. Биолошке активности једињења 1-3

Пошто је пријављено да циклични пептиди испољавају широк спектар биолошких активности, биолошки ефекти изолованих цикличних трипептида ({{0}}) су процењени коришћењем три биолошке активности. Цитотоксичност једињења 1-3 је испитана против четири ћелијске линије рака (МЦЕ7 ћелије рака дојке, ХеЛа ћелије рака грлића материце, А549 ћелије рака плућа код људи и ХепГ2 ћелије рака јетре) у различитим концентрацијама (0, 6,25 , 12,5, 25, 50 и 100 уМ). Једињење 1 није утицало на виталност ћелија МЦФ-7, ХеЛа или А549 ћелија. Међутим, третман ХепГ2 ћелија са 100 М једињења 1 смањио је виталност ћелија на 78,5 плус 3,2 процента (Слика 3). Једињење 2 смањило је виталност ћелија ХеЛа и А549 на 82.9  2.1 процента и 73.5=3.0 процента, респективно, али није утицало на одрживост МЦФ-7 или ХепГ2 ћелије (слика 3). Једињење 3 није утицало на одрживост ниједне ћелијске линије (Слика 3).

Затим су коришћени макрофаги РАВ264.7 за испитивање антиинфламаторних ефеката изолованих једињења. Да би се елиминисале грешке у производњи НО изазване променом стопе преживљавања ћелија, испитиване су нетоксичне концентрације сваког једињења. Као што је приказано на слици 4, једињења 1-3 су имала мало цитотоксичних ефеката у ћелијама РАВ264.7 (Слика 4А-Ц) и нису имала инхибиторне ефекте на производњу НО у ћелијама РАВ264.7 стимулисаним липополисахаридом (ЛПС) (Слика 4Д-Ф) .

Инхибицијски ефекти једињења 1–3 на садржај меланина у Б16Ф10 ћелијама испитани су као доказ њихове активности избељивања коже (Слика 5). Пошто промене у виталности ћелија узрокују грешке у производњи и мерењу меланина, прво смо испитали ефекте једињења 1–3 на преживљавање ћелија Б16Ф10. Једињења 1-3 нису испољила цитотоксичне ефекте у Б16Ф10 ћелијама ни у једној од коришћених концентрација (Слика 5А-Ц). Затим смо проценили инхибиторне ефекте једињења на производњу меланина изазвану 3-изобутил-1-метилксантином (ИБМКС) у ћелијама Б16Ф10 (Слика 5Д-Ф). ИБМКС, добро познати стимулатор меланогенезе, изазива значајно повећање производње меланина након једног третмана у ћелијама меланома. Међу процењеним једињењима, једињење 3 (на 5-100 µМ) је показало значајне инхибиторне ефекте на ИБМКС посредовану синтезу меланина на начин зависан од дозе. Којична киселина, наша позитивна контрола, је у великој мери коришћена као козметички материјал са ефектом избељивања коже [20]. Инхибицијски ефекат једињења 3 на производњу меланина изазвану ИБМКС-ом био је сличан ономе код којичне киселине (Слика 5Ф), што сугерише да једињење 3 функционише као снажан инхибитор производње меланина изазване ИБМКС-ом у ћелијама меланома Б16Ф10.

Штавише, једињење 3 је контаминирано малим бројем нечистоћа, за које је утврђено да су аналози масних киселина интерпретацијом НМР спектроскопских података и ЛЦ/МС анализом (додатни материјали, слике С11–С15 и С23). Да би се идентификовала активност нечистоћа, спроведени су додатни експерименти са аналозима масних киселина за њихове инхибиторне ефекте на ИБМКС-индуковану производњу меланина у Б16Ф10 ћелијама, што је открило да тестирана једињења немају ефекат бељења (додатни материјали, слика С24). Стога, иако не можемо искључити да су нечистоће у једињењу 3 одговорне за инхибиторни ефекат на ИБМКС-индуковану производњу меланина, ово се чини мало вероватним.

3. Материјали и методе

3.1. Опште експерименталне процедуре

Инфрацрвени спектри су добијени на Брукер ИФС-66/С ФТ-ИР спектрометру (Брукер, Биллерица, МА, САД). Спектри јонизације електроспрејом и ХР-ЕСИМС мерени су на СИ-2/ЛЦК ДецаКСП масеном спектрометру за течну хроматографију (ЛЦ) (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, САД). НМР спектри, укључујући експерименте 1Х–1Х ЦОСИ, ХСКЦ и ХМБЦ, изведени су коришћењем Вариан УНИТИ ИНОВА 800 НМР спектрометра (Вариан, Пало Алто, Калифорнија, САД) који ради на 800 МХз (1Х) и 200 МХз (13Ц), са хемијски помаци дати у ппм (δ). Препаративна ХПЛЦ користила је Ватерс 1525 бинарну ХПЛЦ пумпу са Ватерс 996 фотодиодним детектором (Ватерс Цорпоратион, Милфорд, ЦТ, САД). Силика гел 60 (230–400 месх, Мерцк, Кенилвортх, Њ, САД) и РП-Ц18 силика гел (230–400 месх, Мерцк, коришћени су за колонску хроматографију. Полупрепаративни ХПЛЦ користи Схимадзу Проминенце ХПЛЦ систем са СПД{ {22}}А/20АВ серија Проминенце ХПЛЦ ултраљубичасто-видљиви (УВ-Вис) детектори (Схимадзу, Токио, Јапан). ЛЦ/МС анализе су спроведене на Агилент ХПЛЦ систему серије 1200 (Агилент Тецхнологиес, ​​Санта Цлара, ЦА, САД) опремљен детектором диодног низа и ЕСИ масеним спектрометром серије 6130 са аналитичким Кинетеком (4,6 × 100 мм, 3,5 µм). Мерцк плоче са претходно обложеним силика гелом Ф254 и РП-18 Ф254с плоче су коришћене за танке -слојна хроматографија (ТЛЦ) Тачке су детектоване на ТЛЦ под УВ светлом или загревањем након прскања раствором анисалдехид-сумпорне киселине.

3.2. Микробни материјал

Ацтиномадура сп. РБ99 је изолован са површине термита радника рода, М. наталенсис, (колонија Мн103, ГПС С25 43 45.9 Е28 14 08.9) 2. јануара {13}}10. Биоматеријал је стављен у чисте пластичне кесе и обрађен у року од једног дана од сакупљања. Термити су испрани у стерилној дејонизованој води, а бактерије су изоловане постављањем добијених суспензија на подлоге са мало хранљивих материја са хитином (по литру: 4 г хитина, 0.7 г К2ХПО4, 0.3 г КХ2ПО4, 0,5 г МгСО4·5Х2О, 0,01 г ФеСО4·7Х2О, 0,001 г ЗнСО4, 0,001 г МнЦл2 и 20 г агара) [21]. Изолати са морфологијом налик на актинобактерије пребачени су на ИСП2 агар (по литру: 10 г екстракта слада, 4 г екстракта квасца, 4 г глукозе и 20 г агара) и субкултивисани док се не добију чисти изолати.

3.3. Екстракција ДНК и амплификација ланчане реакције полимеразом

Ацтиномадура сп. РБ99 је узгајан у течним медијумима богатим хранљивим материјама ИСП2 пет до седам дана на 30 ◦Ц. Ћелије су сакупљене, а геномска ДНК је екстрахована коришћењем ГенЈет комплета за пречишћавање геномске ДНК (#К0721, Тхермо Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА) према упутствима произвођача са следећим променама: (а) третман лизозимом је продужен на 40 минута, и (б) третман протеиназом К је продужен на 40 мин. ДНК је квантификована фотометријски коришћењем Нанодроп Лите спектрометра (Тхермо Сциентифиц).

За филогенетске студије, 16С рРНА ген је амплификован коришћењем сета прајмера, 1492Р/27Ф. Свака реакција амплификације је припремљена у финалној реакционој запремини од 25 µЛ која садржи 7,25 µЛ дестиловане воде, 5 µЛ ХФ пуфера, 5 µЛ сваког прајмера (2,5 µМ), {{10}}}.5 µЛ дНТПс (10 µМ), 0,25 µЛ Пхусион Хигх-Фиделити ДНК полимеразе (Нев Енгланд Биолабс, Ипсвицх, МА, САД) и 2 µЛ екстраховане ДНК (шаблон). Ланчана реакција полимеразе (ПЦР) је изведена под следећим условима: 98 ◦Ц током 38 с; 32 циклуса од 98 ◦ за 30 с, 52 ◦Ц за 45 с, 72 ◦Ц за 1 мин 20 с; и коначно продужење од 72 ◦Ц током 8 мин. ПЦР производ је визуелизован електрофорезом у агарозном гелу, а ПЦР реакције су пречишћене коришћењем комплета за пречишћавање ПЦР (Тхермо Сциентифиц). ДНК фрагменти су секвенционирани у ГАТЦ (Констанз, Немачка).

3.4. Секвенцирање и идентификација врста

Чистоћа и неподударања секвенци су процењене коришћењем БиоЕдит [22]. Предње и реверзне секвенце добијене за сваки сој су састављене помоћу БиоЕдит-а и тестиране на химере помоћу ДЕЦИПХЕР-а (хттп://деципхер.цее.висц.еду/ФиндЦхимерасОутпутс.хтмл). Добијене секвенце су депоноване у ГенБанк (приступни број: КИ558684). Бласт анализе са скоро потпуним секвенцама 16С рРНА (1368 бп) изведене су коришћењем базе података Националног центра за биотехнолошке информације (НЦБИ) (референтне РНК секвенце). Резултати су показали да је сој РБ99 члан рода Ацтиномадура. Секвенце првих 10 погодака преузете су из НЦБИ базе података и усклађене са 16С рРНА секвенцом Ацтиномадура сп. РБ99 користећи Сина сервис за поравнање секвенци [23]. Два различита филогенетска стабла су реконструисана са алгоритмима спајања суседа или алгоритама максималне вероватноће коришћењем софтвера МЕГА верзије 7.0.26 [24–26]. Модел еволуционог растојања Тамура и Неи је коришћен за генерисање еволуционих матрица удаљености за алгоритме максималне вероватноће и спајања суседа, уз брисање потпуних празнина и података који недостају [27]. За алгоритам максималне вероватноће, коришћена је дискретна гама дистрибуција ( плус Г), а модел варијације брзине је омогућио да нека места буду еволутивно непроменљива ( плус И). За алгоритам за спајање суседа, варијација стопе између локација је моделована гама дистрибуцијом ( плус Г). Вредности поверења чворова процењене су боотстрап анализама на основу 1000 корака поновног узорковања [28].

3.5. Екстракција и изолација

Ацтиномадура сп. РБ99 је узгајан у 50 мЛ ИСП2 бујона седам дана на 30 ◦Ц (пре-култура) и коришћен за инокулацију 100 ИСП2 агар плоча. Плоче су инкубиране 10 дана на 30 ◦Ц, исечене на мале комаде, консолидоване и потопљене преко ноћи у МеОХ. МеОХ фаза је филтрирана и упарена под сниженим притиском. Екстракт МеОХ (20 г) је растворен у дестилованој води (700 мЛ) и затим подељен у растварачу са ЕтОАц (700 мЛ) три пута, дајући 1,1 г остатка. ЕтОАц растворљива фракција (1,1 г) из МеОХ екстракта је стављена на колону силика гела (230–400 месх) за хроматографију и елуирана са градијентним системом растварача ЦХ2Цл2-МеОХ (100:1 до 1: 1, в/в). Ово је обезбедило шест фракција (А-Ф), које су подвргнуте анализи заснованој на ЛЦ-УВ/МС. Анализа дерепликације користећи интерну УВ спектралну библиотеку сугерисала је постојање мањих аналога пептида у фракцији Е. Они су показали једноставан УВ образац на око 220 нм и јединствене пикове јона молекуларне формуле који садрже атоме азота. Поларна фракција Е (233 мг) је фракционисана препаративном ХПЛЦ реверзне фазе (Пхеноменек Луна Ц18, 250 × 21,2 мм ид, 5 µм, Торранце, Калифорнија, САД) коришћењем ЦХ3ЦН/Х2О (1:9 до 9:1, в /в, систем градијента, брзина протока: 5 мЛ/мин) да би се добило пет подфракција (Е1–Е5). Подфракција Е2 (27 мг) је пречишћена помоћу полу-препаративне ХПЛЦ реверзне фазе (Пхеноменек Луна Ц18, 250 × 10,0 мм ид, 5 µм) са 33 процента МеОХ/Х2О (изократски систем, брзина протока: 2 мЛ/мин ) да би се добило једињење 1 (5,8 мг, тР=57.0 мин). Једињења 2 (1,6 мг, тР=42,0 мин) и 3 (1,5 мг, тР=55,0 мин) су изолована из подфракције Е3 (15 мг) полупрепаративном реверзном фазом ХПЛЦ елуирањем 43 процента МеОХ/Х2О (изократски систем, брзина протока: 2 мЛ/мин).

3.5.1. наталенамид А (1)

3.5.2. наталенамид Б (2)

3.5.3. наталенамид Ц (3)

3.6. Кисела хидролиза једињења 1–3

Количина од укупно 0.4 мг сваког једињења (1–3) је хидролизована са 6 Н ХЦл (500 µЛ) током 1 х на 110 ◦Ц. После хлађења на собну температуру, хидролизати 1-3 су упарени да би се уклонили трагови ХЦл. Дестилована вода (500 уЛ) је додата у смеше хидролизата и затим упарена да би се уклонили трагови ХЦл; овај процес је обављен три пута.

3.7. Одређивање апсолутне конфигурације аминокиселина у 1–3

Смеше хидролизата (1–3), као и стандардне аминокиселине (Л/Д-Леу, Глу, Пхе и Вал), растворене су у 1 Н НаХЦО3 (100 µЛ) и затим третиране са 50 µЛ Л-ФДАА (10 мг/мЛ у ацетону). Узастопно, сваки хидролизат је загреван 10 мин на 80 ◦Ц. Свака смеша је угашена са 2 Н ХЦл (50 уЛ) и концентрована у вакууму. Остатак је растворен у 300 уЛ МеОХ. Сваки аликвот (5 µЛ) добијен из смеша хидролизата је директно убризган у ЛЦ/МС (Пхеноменек Луна Ц18, 4,6 × 100 мм, 3,5 µм, брзина протока од 0,3 мЛ/мин), и потпуно скенирање у позитивном и негативном јонски модови (опсег скенирања од м/з 100 до 1000) примењен је да се идентификују времена задржавања аминокиселина дериватизованих Л-ФДАА.

Мобилна фаза, која се састоји од мравље киселине у дестилованој води ({{0}}.1 процента в/в) (А) и ацетонитрила (Б), носила је са градијентним системом растварача како следи: 20–40 проценат (Б) током 10 минута, 100 процената (Б) изократичан током 5 минута, а затим 20 процената (Б) изократичан током 5 минута, да би се спровела процедура испирања колоне после рада. Времена задржавања Л-ФДАА дериватизованих амино киселина коришћених као стандарда била су 16,7 мин (Л-Глу, м/з 400 [М плус Х] плус), 18,2 мин (Д-Глу, м/з 400 [М плус Х] плус ), 22,1 мин (Л-Вал, м/з 370 [М плус Х] плус ), 25,1 мин (Д-Вал, м/з 370 [М плус Х] плус ), 25,6 мин (Л-Пхе, м/ з 418 [М плус Х] плус ), 27,0 мин (Д-Пхе, м/з 418 [М плус Х] плус ), 25,5 мин (Л-Леу, м/з 384 [М плус Х] плус ), и 28,2 мин (Д-Леу, м/з 384 [М плус Х] плус). Времена задржавања дериватизованих хидролизата од 1–3 била су Л-Глу (16,9 мин), Л-Пхе (25,7 мин) и Л-Вал (22,5 мин) од 1; Л-Глу (16,7 мин), Л-Пхе (25,7 мин) и Л-Леу (25,6 мин) од 2; и Л-Глу (16,9 мин) и Л-Пхе (25,7 мин) од 3.

3.8. Цитотоксични тестови помоћу ћелија рака

МЦФ7, ХеЛа и А549 ћелије су купљене од Америчке колекције типских култура (Роцквилле, МД, САД). ХепГ2 ћелије су купљене од Кореан Целл Лине Банк (Сеул, Кореја). МЦФ7 ћелије су узгајане у медијуму 1640 Росвелл Парк Меморијалног института (РПМИ) са додатком 10 процената феталног говеђег серума. ХеЛа и А549 ћелије су култивисане у Дулбеццовом минималном есенцијалном медијуму (ДМЕМ, Целлгро, Манассас, ВА, САД) са додатком 10 процената феталног говеђег серума. ХепГ2 ћелије су култивисане у минималном есенцијалном медијуму са додатком 10 процената феталног говеђег серума. Услови за узгој одржавани су на 37 ◦Ц у влажној атмосфери која садржи 5 процената ЦО2. Цитотоксичност је тестирана на ове четири људске ћелијске линије (МЦФ7, ХеЛа, А549 и ХепГ2) коришћењем комплета за испитивање виталности ћелија ЕЗ-ЦиТок (Дојиндо Лабораториес, Кумамото, Јапан). Укратко, 5 × 103 ћелија по бунарчићу је засејано у 96- плоче са бунарима. После 24 х ћелије су третиране једињењима у назначеним концентрацијама. После 72 х инкубације, коришћен је комплет за испитивање виталности ћелија ЕЗ-ЦиТок. После 2 х инкубације, мерена је апсорпција на 450 нм са референцом на 620 нм. Вијабилност ћелија је израчуната као проценат контроле.

3.9. Анти-инфламаторна активност

Ћелијска линија мишјег макрофага РАВ264.7 је купљена од Америчке колекције типских култура. Ћелије су култивисане у ДМЕМ са додатком 10% феталног говеђег серума (ФБС), 100 јединица/мЛ пеницилина и 100 µг/мЛ стрептомицина и инкубиране на 37 ◦Ц у влажној атмосфери са 5% ЦО2. Вијабилност ћелија је мерена коришћењем Ез-Циток комплета за детекцију виталности ћелија. Ћелије су инкубиране у 96-плочама у концентрацији од 2500 ћелија по бунарчићу током 24 х и третиране назначеним концентрацијама једињења 1–3 током 24 х. Затим су у сваки бунар додавани Ез-Циток реагенси. Оптичка густина на 450 нм је измерена након 1 х коришћењем читача микроплоча (ПоверВаве КСС; Био-Тек Инструментс, Винооски, ВТ, САД) да би се проценила виталност ћелија. У посебном експерименту, ћелије РАВ264.7 су инкубиране у 96-плочама са бунарима у концентрацији од 30,000 ћелија по бунарчићу током 24 сата. После гладовања у серуму током 12 х, ћелије су претходно третиране једињењима 1-3 током 1 х, а затим стимулисане са 1 µг/мЛ ЛПС-а током 24 х. Апсорбанца медијума за културу у Гриесовој реакцији је мерена на 540 нм коришћењем ПоверВаве КСС читача микроплоче да би се проценио ниво НО.

3.10. Мерење садржаја меланина

Ћелијска линија меланома миша, Б16Ф10, купљена је од Америчке колекције типских култура. Ћелије су култивисане у ДМЕМ са додатком 10% ФБС, 100 јединица/мЛ пеницилина и 100 µг/мЛ стрептомицина и инкубиране на 37 ◦Ц у влажној атмосфери са 5% ЦО2. Ћелије Б16Ф10 су инкубиране у посудама за културу од 6 цм на 250,000 ћелија по бунарчићу у ДМЕМ са додатком 10% ФБС, 100 µг/мЛ стрептомицина и 100 У/мЛ пеницилина током 24 сата. Ћелије су два пута испране физиолошким раствором пуферованим фосфатом (ПБС), а затим стимулисане ИБМКС-ом и инкубиране са различитим концентрацијама једињења 1-3 или којичне киселине (позитивна контрола) у РПМИ медијуму без фенолног црвеног допуњеног са 10 процената ФБС, 100 јединица /мЛ пеницилина и 100 µг/мЛ стрептомицина током 24 х и 48 х. Апсорбанција медијума за културу је мерена на 405 нм коришћењем ПоверВаве КСС читача микроплоче да би се проценио садржај меланина. Резултати су изражени као фолд-промена у поређењу са контролом (ћелије нису стимулисане ИБМКС-ом).

3.11. Статистичка анализа

Сви подаци укључујући виталност ћелија, производњу НО и меланина представљени су као просечна вредност и стандардна девијација (СД). Сви тестови су урађени у три примерка и поновљени су најмање три пута. У ову студију је укључено само неколико понављања сваког ћелијског експеримента, па је за статистичку анализу усвојен метод непараметарске анализе. За статистичку анализу сваке варијабле коришћен је Крускалл–Волисов тест. За све анализе коришћен је СПСС статистички пакет (Интернатионал Бусинесс Мацхинес Цорпоратион (ИБМ) СПСС статистика верзија 21, Бостон, МА, САД). Статистичка значајност је разматрана при п-вредности нижој од 0.05.

4. Закључци

Наш извештај пружа хемијску анализу микробних изолата из термита који расте. Три нова циклична трипептида, наталенамиди А–Ц (1–3), изолована су и структурно окарактерисана из бујона културе Ацтиномадура сп. РБ99 користећи методу дерепликације засноване на ЛЦ-УВ/МС. Сва изолована једињења су процењена на биолошке активности коришћењем тестова заснованих на ћелијама. Једињења 1 и 2 су показала слабу цитотоксичност према ХепГ2 и ХеЛа/А549 ћелијама, респективно. Ниједно од изолованих једињења није показало значајне инхибиторне ефекте на производњу НО у ћелијама РАВ264.7 стимулисаним ЛПС. Једињење 3 је показало значајне инхибиторне ефекте на ИБМКС посредовану синтезу меланина на начин зависан од дозе. Ефекат је био сличан ономе код којичне киселине, која се користи као козметички материјал са ефектом избељивања коже.

Признања:

Дубоко смо захвални Мајклу Томасу-Поулсену (Одсек за биологију, Универзитет у Копенхагену, Данска) за подршку нашем раду на терену.

Сукоби интереса:

Аутори изјављују да нема сукоба интереса.

Референце

1. Невман, ДЈ; Црагг, ГМ Природни производи као извори нових лекова од 1981. до 2014. Ј. Нат. Прод. 2016, 79, 629–661. [ЦроссРеф] [ПубМед]

2. Мишра, ББ; Тивари, ВК Природни производи: Улога у развоју у будућем откривању лекова. ЕУР. Ј. Мед. Цхем. 2011, 46, 4769–4807. [ЦроссРеф] [ПубМед]

3. Беемелманнс, Ц.; Гуо, Х.; Рисцхер, М.; Поулсен, М. Природни производи од микроба повезаних са инсектима. Беилстеин Ј. Орг. Цхем. 2016, 12, 314–327. [ЦроссРеф] [ПубМед]

4. Рамадхар, ТР; Беемелманнс, Ц.; Цуррие, ЦР; Цларди, Ј. Бактеријски симбионти у пољопривредним системима представљају стратешки извор за откривање антибиотика. Ј. Антибиот. 2014, 67, 53–58. [ЦроссРеф] [ПубМед]

5. Харвеи, АЛ; Едрада-Ебел, Р.; Куинн, РЈ Поновна појава природних производа за откривање лекова у ери геномике. Нат. Рев. Друг Дисцов. 2015, 14, 111–129. [ЦроссРеф] [ПубМед]

6. Саттели, ЕС; Фисцхбацхб, МА; Валсх, ЦТ Укупна биосинтеза: Ин витро реконституција поликетидних и нерибозомалних пептидних путева. Нат. Прод. Реп. 2008, 25, 757–793. [ЦроссРеф] [ПубМед]

7. Ох, Д.; Сцотт, ЈЈ; Цуррие, ЦР; Цларди, Ј. Мицангимицин, полиен пероксид из мутуалиста Стрептомицес сп. Орг. Летт. 2009, 11, 633–636. [ЦроссРеф] [ПубМед]

8. Сит, ЦС; Руззини, АЦ; Ван Арнам, ЕБ; Рамадхар, ТР; Цуррие, ЦР; Цларди, Ј. Варијабилне генетске архитектуре производе практично идентичне молекуле у бактеријским симбионтима мрава који расту гљивице. Проц. Натл. Акад. Сци. САД 2015, 112, 13150–13154. [ЦроссРеф] [ПубМед]

9. Ниско, КЕ; Лер, С.; Цхен, КЈ; Цампбелл, РЛ; Хицкеи, ЈЛ; Тан, Ј.; Сцулли, ЦЦГ; Давиес, РЛ; Иудин, АК; Заретски, С. Рационални дизајн инхибитора калпаина на бази калпастатинских пептидомиметика. Ј. Мед. Цхем. 2016, 59, 5403–5415. [ЦроссРеф] [ПубМед]

10. Зхенг, Ј.; Ксу, З.; Ванг, И.; Хонг, К.; Лиу, П.; Зху, В. Циклични трипептиди из халотолерантне гљиве Аспергиллус сцлеротиорум ПТ06-1. Ј. Нат. Прод. 2010, 73, 1133–1137. [ЦроссРеф] [ПубМед]

11. Веераккоди, Д.; Мосхникова, А.; Ел-Саиед, НС; Адоцхите, РЦ; Слаибаугх, Г.; Голијанин, Ј.; Тивари, РК; Андреев, ОА; Паранг, К.; Ресхетниак, ИК Новел пХ-сенситиве цицлиц пептидес. Сци. Реп. 2016, 6, 31322. [ЦроссРеф] [ПубМед]

12. Зхао, М.; Лин, ХЦ; Танг, И. Биосинтеза -нитро-цонтаининг цицлиц трипептиде псицхропхилиц. Ј. Антибиот. 2016, 69, 571–573. [ЦроссРеф] [ПубМед]

13. Зорзи, А.; Деиле, К.; Хеинис, Ц. Цицлиц пептиде тхерапеутицс: Прошлост, садашњост и будућност. Цурр. Опин. Цхем. Биол. 2017, 38, 24–29. [ЦроссРеф] [ПубМед]

14. Ким, КХ; Рамадхар, ТР; Беемелманнс, Ц.; Цао, С.; Поулсен, М.; Цуррие, ЦР; Цларди, Ј. Наталамицин А, ансамицин из Стрептомицес сп. Цхем. Сци. 2014, 5, 4333–4338. [ЦроссРеф] [ПубМед]

15. Канг, ХР; Лее, Д.; Бенндорф, Р.; Јунг, ВХ; Беемелманнс, Ц.; Канг, КС; Ким, КХ Термисофлавони А–Ц, изофлавоноидни гликозиди из Стрептомицес сп. РБ1. Ј. Нат. Прод. 2016, 79, 3072–3078. [ЦроссРеф] [ПубМед]

16. Беемелманнс, Ц.; Рамадхар, ТР; Ким, КХ; Классен, ЈЛ; Цао, С.; Вицхе, ТП; Хоу, И.; Поулсен, М.; Бугни, ТС; Цуррие, ЦР; ет ал. Макротермицини А–Д, гликозиловани макролактами из Амицолатопсис сп. М39. Орг. Летт. 2017, 19, 1000–1003. [ЦроссРеф] [ПубМед]

17. Гуо, Х.; Бенндорф, Р.; Леицхнитз, Д.; Классен, ЈЛ; Воллмерс, Ј.; Горлс, Х.; Стеинацкер, М.; Веигел, Ц.; Дахсе, ХМ; Кастер, АК; де Беер, ЗВ; ет ал. Изолација, биосинтеза и хемијске модификације рубтеролона А–Ф: Ретки трополонски алкалоиди из Ацтиномадура сп. 5–2. Цхем. ЕУР. Ј. 2017, 23, 9338–9345. [ЦроссРеф] [ПубМед]

18. Сано, С.; Икаи, К.; Катаиама, К.; Такесако, К.; Накамура, Т.; Обаиасхи, А.; Езуре, И.; Еномото, Х. ОФ4949, нови инхибитори аминопептидазе Б. ИИ. Елуцидатион оф Струцтуре. Ј. Антибиот. 1986, 39, 1685–1696. [ЦроссРеф] [ПубМед]

19. Циасулло, Л.; Цасапулло, А.; Цутигнано, А.; Бифулцо, Г.; Дебитус, Ц.; Хоопер, Ј.; Гомез-Палома, Л.; Риццио, Р. Рениерамиде, циклични трипептид из Вануату сунђера Рениера н. сп. Ј. Нат. Прод. 2002, 65, 407–410. [ЦроссРеф] [ПубМед]

20. Солано, Ф.; Бриганти, С.; Пицардо, М.; Гханем, ГХ Средства за хипопигментацију: ажурирани преглед биолошких, хемијских и клиничких аспеката. Пигм. Целл Меланома Рес. 2006, 19, 550–571. [ЦроссРеф] [ПубМед]

21. Виссер, АА; Нобре, Т.; Цуррие, ЦР; Аанен, ДК; Поулсен, М. Истраживање потенцијала актинобактерија као одбрамбених симбионта код термита који узгајају гљивице. Мицроб. Ецол. 2012, 63, 975–985. [ЦроссРеф] [ПубМед]

22. Халл, ТА БиоЕдит: Уређивач и програм за анализу биолошких секвенци прилагођен кориснику за Виндовс 95/98/НТ. Нуклеинске киселине Симп. Сер. 1999, 41, 95–98.

23. Пруессе, Е.; Пеплиес, Ј.; Глоцкнер, ФО СИНА: Тачно високо пропусно вишеструко поравнање гена рибосомалне РНК. Биоинформатика 2012, 28, 1823–1829. [ЦроссРеф] [ПубМед].

24. Саитоу, Н.; Неи, М. Метода спајања суседа: нова метода за реконструкцију филогенетских стабала. Мол. Биол. Евол. 1987, 4, 406–425. [ПубМед]

25. Фелсенстеин, Ј. Еволуциона стабла из ДНК секвенци: приступ максималној вероватноћи. Ј. Мол. Евол. 1981, 17, 368–376. [ЦроссРеф] [ПубМед]

26. Кумар, С.; Стецхер, Г.; Тамура, К. МЕГА7: Анализа молекуларне еволуционе генетике, верзија 7.0 за веће скупове података. Мол. Биол. Евол. 2016, 33, 1870–1874. [ЦроссРеф] [ПубМед]

27. Тамура, К.; Неи, М. Процена броја нуклеотидних супституција у контролном региону митохондријалне ДНК код људи и шимпанзи. Мол. Биол. Евол. 1993, 10, 512–526. [ПубМед]

28. Фелсенстеин, Ј. Границе поверења у филогеније: приступ који користи почетну верзију. Еволутион 1985, 39, 783–791. [ЦроссРеф] [ПубМед]

Доступност узорка:

Узорци једињења нису доступни од аутора.

For more information:1950477648nn@gmail.com