Неуропротективне предности вежбања и МитоК-а на меморијску функцију, митохондријалну динамику, оксидативни стрес и неуроинфламацију код пацова изазваних Д-галактозом, 2. део

2.6. Припрема ткива

Након завршетка 8 недеља ТЕ и тестова понашања памћења, сви пацови су еутаназирани инхалацијом ЦО2, а ткива мозга су сакупљена од 7 животиња у свакој групи третмана.

Тест понашања памћења је ефикасан алат за процену памћења. Са све већим друштвеним и радним притиском, памћење људи постаје све важније. Стога нам тестирање понашања памћења може помоћи да разумемо ниво нашег памћења и предузмемо ефикасне мере за побољшање и одржавање памћења према резултатима теста.

Конкретно, тестови понашања меморије могу проценити способност људи да примају, обрађују, складиште и преузимају информације. Тестирањем различитих врста информација као што су језик, бројеви, слике итд., памћење људи се може у потпуности тестирати. Резултати теста ће нам дати различите резултате који ће нам помоћи да разумемо наше слабости и предности и како да ојачамо своје памћење.

У пракси, многи тестови понашања памћења такође пружају професионалне савете и предлоге. На пример, добар сан, уравнотежена исхрана, правилна вежба и редовне вежбе мозга су корисни за побољшање памћења људи. Овим методама можемо побољшати време задржавања памћења, способност репродукције памћења и друге аспекте како бисмо се боље прилагодили свакодневним животним или радним потребама.

Укратко, тест понашања памћења је веома користан за разумевање, процену и побољшање нечијег памћења. Такође треба да усвојимо одговарајуће методе да ојачамо своје памћење у складу са нашом стварном ситуацијом, да поставимо чврсту основу за испуњенији и богатији живот. Види се да морамо побољшати памћење, а Цистанцхе може значајно побољшати памћење јер је Цистанцхе традиционални кинески медицински материјал са много јединствених ефеката, од којих је једно побољшање памћења. Ефекат Цистанцхеа потиче од различитих активних састојака које садржи, укључујући танинску киселину, полисахариде, флавоноидне гликозиде, итд. Ови састојци могу унапредити здравље мозга на различите начине.

Кликните на Знај краткорочну меморију како да побољшате

Након одвајања церебралног кортекса и хипокампуса, мождано ткиво је брзо замрзнуто у течном азоту и чувано на -80 ◦Ц до анализе. Преосталих 5 животиња је коришћено за имунохистохемијску (ИХЦ) анализу.

Након отварања торакалне шупљине, 50 мМ физиолошког раствора пуферованог фосфатом (ПБС) је пропуштено кроз леву комору током 10 минута, а затим је животиња перфундирана са 4% параформалдехида (ПФА) у 100 мМ ПБС.

Након фиксације перфузије, мозак је сакупљен, стављен у 4% ПФА и фиксиран 4 х на 4 ◦Ц. Фиксирано мождано ткиво је потопљено у 30% раствор сахарозе током 2 дана, а затим исечено на кришке дебљине 40 µм помоћу криостата ( Леица Мицросистемс, Нуслоцх, Немачка).

2.7. Изолација митохондрија

Да бисмо изоловали митохондрије, користили смо комплет за екстракцију митохондрија (ИМГЕНЕКС Цорпоратион, Сан Диего, ЦА, УСА) према упутствима произвођача. За сваких 100 мг хипокампалног ткива, додат је 1 мЛ пуфера за хомогенизацију.

Након хомогенизације, ткиво је центрифугирано на 900 × г током 10 минута на 4 ◦ Ц, а супернатант је сакупљен и поново центрифугиран на 15, 000 × г током 30 минута на 4 ◦ Ц.

Узимајући центрифугирану цитосолну фракцију, цитосол је одвојен, а преостала пелета је темељно измешана у 1 мЛ пуфера за суспензију, пре центрифугирања на 15,000×г током 10 минута на 4 ◦Ц.

Супернатант је уклоњен и додат је још 1 мЛ пуфера за суспензију пре него што се темељно меша и поново центрифугира на 15,000×г током 10 минута на 4°Ц.

Супернатант је уклоњен, а преостали пелет је растворен у 1 мЛ потпуног пуфера за лизу митохондрија током 30 минута на 4 °Ц. Екстракт митохондрија је затим центрифугиран на 15,000×г током 5 минута на 4°Ц, а супернатант (митохондријална фракција) је сакупљен.

2.8. Вестерн блоттинг
Укупни протеин добијен изолацијом митохондрија је квантификован коришћењем Брадфордове методе. Једнака количина митохондријалних протеина (30 µг по траци) је стављена на електрофорезу натријум додецил сулфат-полиакриламидног гела (СДС-ПАГЕ) (8% или 12%).

Након електрофорезе, протеини су пребачени на мембрану од поливинилиден флуорида (ПВДФ) (Миллипоре, Бостон, МА, САД).

Блокирање је изведено 1 х на собној температури коришћењем 1×Трис пуферованог физиолошког раствора који садржи Твеен-20 (ТБС-Т) раствор са 5% БСА, а затим је мембрана реаговала са примарним антителима преко ноћи на 4 ◦Ц.

Коришћена су следећа примарна антитела: Мфн1, Мфн2, Опа1, Дрп1, Фис1, п22 пхок, п47 пхок, гп91пхок, СОД-2, каталаза и -актин (Санта Цруз Биотецхнологи, Даллас, ТКС, САД, разблаживање:1 :1000); и ТНФ- (Абцам, Цамбридге, УК, разблаживање: 1:1000).

Мембране су затим испране пуфером за испирање (ПБС са 0.1% Твеен 20), након чега су инкубиране са козјим анти-зечјим секундарним антителима коњугованим са пероксидазом рена (ХРП) за п22 пхок, гп91 пхок и ТНФ Сериа: Инвитроген, Царлсбад, ЦА, УСА, разблаживање: 1:5000.

ХРП коњугована козја антимишја секундарна антитела коришћена су за Мфн1, Мфн2, Опа1, Дрп1, Фис1, п47 пхок, СОД-2, каталазу и -актин (Санта Цруз Биотецхнологи, разблаживање: 1:5000).

Нивои експресије протеина су детектовани коришћењем ЕЦЛ Вестерн блоттинг система за детекцију (Санта Цруз Биотецхнологи). Густине развијених протеинских трака су анализиране коришћењем ЦхемиДоц КСРС гел система за снимање (Био-Рад Лабораториес, Херцулес, Калифорнија, САД).

2.9. Имунохистохемија (ИХЦ)
За ИХЦ анализу, коришћена је метода слободног плутања за одабрано ткиво у свакој групи третмана. Након прања ткива 3× по 10 мин у 0.01 М ПБС, ткиво је инкубирано на 80 ◦Ц током 60 минута у чаши која садржи 0,01 М натријум цитрата, након чега је уследило блокирање у 10% нормални магарећи серум (Миллипоре Сигма, Бурлингтон, МА, САД).

Узорак ткива је затим реаговао са примарним антителима анти-п22 пхок (Санта Цруз Биотецхнологи, разблаживање: 1:500) и анти-Глиал фибриларним киселим протеином (ГФАП) (Абцам, разблаживање:1:500) током 12 х на 4 ◦Ц. Следећег дана, ткиво је испрано 3× током 5 минута сваки у 0,01 М ПБС, а затим је реаговало са ХРП-коњугованим козјим анти-мишјим секундарним антителом (Санта Цруз Биотецхнологи, разблажење: 1: 5000) на собној температури током 2 х.

Коначно, ткиво је инкубирано на собној температури коришћењем Вецтастаин-Елите АБЦ комплета (Вецтор Лабораториес, Бурлингаме, ЦА, УСА), а резултати су визуелизовани коришћењем ДАБПерокидасе супстратног комплета (Вецтор Лабораториес).

Сваки комад ткива је постављен на клизач коришћењем медијума за монтирање (Вецтор Лабораториес) и прегледан помоћу светлосног микроскопа (Леица Мицросистемс).

2.10. Статистичке анализе

Подаци су анализирани коришћењем СПСС-а за Виндовс верзију 18.0 (СПСС Инц., Чикаго, ИЛ, САД). Све вредности су изражене као средња вредност ± СЕМ. Статистичка значајност је одређена коришћењем једносмерне АНОВА. Бонферони пост хоц тестови су коришћени за вишеструка поређења. Разлике су сматране статистички значајним при п < 0.05.

3. Резултати

3.1. Ефекти вежбе на траци за трчање и МитоК-а на експресију протеина повезаних са митохондријском динамиком у хипокампусу пацова који старење изазвано Д-Гал-ом

Проверили смо да ТЕ и МитоК утичу на факторе везане за митохондријску фузију (Мфн1, Мфн2, Опа1) и факторе везане за фисију (Дрп1, Фис1) у хипокампусу пацова који старе (Слика 1).

Нивои експресије фактора повезаних са митохондријском фузијом значајно су се разликовали између група третмана (Мфн1, Ф4,34=134.750, п < 0.001; Мфн2, Ф4,34=80. 816, п < 0,001; Опа1, Ф4, 34=51.456, п=0.001).

Нивои експресије фактора везаних за митохондријску фисију такође су се значајно разликовали између група третмана (Дрп1, Ф4,34=53.448, п < 0.001; Фис1,Ф4,34=116 .313, п < 0,001). Резултати пост хоц теста приказани су на слици 1.

У поређењу са И-ЦОН групом, експресија фактора везаних за митохондријску фузију је смањена у Д-ЦОН групи и показала растуће трендове у групама Д-ТЕ, Д-МИ и Д-ЦОМБИ.

С друге стране, експресија фактора Дрп1 везаног за фисију митохондрија повећана је у Д-ЦОН групи у поређењу са И-ЦОН групом. Док су сигнали митохондријалне фисије смањени комбинованим третманом са ТЕ, сам третман МитоК није изазвао значајну промену.

Други фактор везан за фисију митохондрија, Фис1, показао је исте трендове смањења као Дрп1, али је такође смањен само третманом МитоК.

Слика 1. Ефекат вежбања на траци за трчање и митохинона (МитоК) на експресију протеина повезаних са митохондријском динамиком у хипокампусу пацова изазваних старењем Д-галактозом (Д-гал). (А) Репрезентативни Вестерн блотови митохондријалне фузије и протеина повезаних са фисијом. (Б–Ф) Дензитометријска анализа Вестерн блот трака нормализованих на -Ацтин. Подаци приказани у Вестерн блот-у су средства из мозга седам пацова.

-Актин је испитан као интерна контрола. Бонферони пост хоц тест је коришћен након АНОВА. Вредности су средње вредности ± СЕМ.

а Означава статистичку разлику у односу на групу младе контролне групе (И-ЦОН). б Означава статистичку разлику у односу на групу Д-галактозе (Д-ЦОН). ц Означава статистичку разлику од групе Д-галактозе плус вежбање на траци за трчање (Д-ТЕ).

д Означава статистичку разлику у односу на Д-галактозу плус МитоК (Д-МИ) групу (п < 0.05). Д-ЦОМБИ; Д-галактоза плус ТЕ и МитоК група.

3.2. Ефекти вежбања на траци за трчање и МитоК-а на експресију подјединица НАДПХ оксидазе у церебралном кортексу и хипокампусу пацова који старење изазвано Д-Гал-ом

Приметили смо значајне разлике између третираних група у имунореактивности п22 фокса у можданој кори и хипокампусу старијих пацова (Слика 2) (ЦА3,Ф4,24=18.786, п < 0.{11 }}01; Ф4, 24=12.662, п < 0,001).

У кортексу, Д-ЦОН групе су показале повећану имунореактивност п22 фокса у поређењу са И-ЦОН групом, која је значајно смањена у групама Д-ТЕ, Д-МИ и Д-ЦОМБИ.

Код ЦА3, повећана имунореактивност п22 фокса је смањена у Д-ТЕ и Д-ЦОМБИ групама у поређењу са Д-ЦОН. Нивои експресије протеина подјединица НОКС п22 пхок, гп91 пхок и п47пхок значајно су се разликовали између група (п22 пхок, Ф4,{{10}}.513, п < 0.{{24} }01; гп91 пхок, 34=57.282, п < 0,001; п47 пхок, 34=69, п < 0,001);

Резултати пост хоктеста су показали значајно повећање нивоа НОКС подјединица у Д-ЦОН у поређењу са И-ЦОН. Међутим, нивои НОКС подјединица били су нижи у свим интервентним групама у поређењу са Д-ЦОН групом.

Конкретно, експресија п22 пхок и гк91 пхок је значајно смањена у Д-ТЕ у поређењу са Д-МИ групом. Ови налази указују на то да вежбање и МитоК појединачно спречавају оксидативни стрес у мозгу изазван старењем, али њихова комбинација не доводи до додатних ефеката.

Слика 2. Ефекти вежбања на траци за трчање и МитоК на експресију подјединица НАДПХ оксидазе у церебралном кортексу и хипокампусу пацова старења изазваног Д-гал. (А1) Микрографије које показују имунореактивност НАПДХ п22 фокса у можданој кори и хипокампусу Д-гал-индукованих агинграта у свакој групи. Црни правоугаоници у А1 означавају део слика као што је приказано на ф–и ип–т. (А2, А3) Квантификација оптичке густине НАДПХ п22 фокс бојења у можданој кори и хипокампусу.

Бонферони пост хоц тест након АНОВА. Вредности су представљене као средња вредност ± СЕМ. (н=5 животиња). (а–е и к–о) Скала бар=100 µм, (ф–ј и п–т) Скала трака=50 µм. (Б) Репрезентативне Вестерн блот слике за подјединице НАДПХ оксидазе у хипокампусу.

(Ц–Е) Квантификација подјединица НАДПХ оксидазе у хипокампусу. Подаци приказани у вестерн блот-у били су средства из мозгова седам пацова. -Актин је испитан као интерна контрола. Бонферони пост хоц тест је коришћен након АНОВА. Вредности су средње вредности ± СЕМ.

а Означава статистичку разлику у односу на И-ЦОН групу. б Означава статистичку разлику од Д-ЦОН групе. ц Означава статистичку разлику у односу на Д-ТЕ групу.(п < 0.05).

3.3. Ефекат вежбе на траци за трчање и МитоК-а на експресију ГФАП-а у церебралном кортексу и хипокампалном зупчастом гирусу пацова који старење изазвано Д-Гал-ом

Приметили смо значајне разлике између група третмана у ГФАП имунореактивности у можданој кори и хипокампалном зупчастом гирусу (ДГ) старијих пацова (Слика 3) (Цортек, Ф4,24=13.524, п < 0.001 ; ДГ, Ф4, 24=30.364).

Резултати пост хоц теста су показали да третман Д-гал значајно повећава имунореактивност ГФАП-а у кортексу и ДГ.

У поређењу са Д-ЦОН групом, нивои ГФАП у кортексу су смањени у свим интервентним групама, а нивои ГФАП у ДГ су смањени у Д-ТЕ и Д-ЦОМБИ групама, док је Д-МИ група показала разлике само у ГФАП имунореактивности у области кортекса.

Стога, иако је третман ТЕ или МитоК смањио неуроинфламацију у кортексу изазвану Д-галом, само је ТЕ интервенција произвела позитивне ефекте у ДГ.

For more information:1950477648nn@gmail.com