Норвогонин ублажава оксидативни стрес и апоптозу изазвану хипоксијом у ћелијама ПЦ12

За више информација:ali.ma@wecistanche.com

Апстрактан

Позадина: Норвогонин је природни флавон са три фенолне хидроксилне групе у скелетној структури и има одличнеантиоксидансактивност. Међутим, неуропротективни ефекат норвогонина остаје нејасан. Овде смо истражили заштитни капацитет норвогонина против оксидативног оштећења изазваног хипоксијом у ПЦ12 ћелијама. Методе: Вијабилност ћелија и апоптоза су испитивани МТТ тестом и Анексин В-ФИТЦ/ПИ бојењем, респективно. Садржај реактивних врста кисеоника (РОС) је мерен коришћењем ДЦФХ-ДА теста. Лактат дехидрогеназа (ЛДХ), малондиалдехид (МДА) иантиоксиданснивои ензима су одређени коришћењем комерцијалних комплета. Експресија сродних гена и протеина мерена је квантитативним ПЦР-ом у реалном времену и Вестерн блоттинг-ом, респективно. Резултати: Открили смо да је норвогонин ублажио повреду изазвану хипоксијом у ПЦ12 ћелијама повећањем виталности ћелије, смањењем ослобађања ЛДХ и побољшањем промена у ћелијској морфологији. Норвогонин је такође деловао каоантиоксидансуклањањем РОС, смањењем производње МДА, одржавањем активности супероксид дисмутазе (СОД), каталазе (ЦАТ) и глутатион пероксидазе (ГПк) и смањењем нивоа експресије ХИФ-1 и ВЕГФ. Поред тога, вогонин је спречио ћелијску апоптозу тако што је инхибирао нивое експресије каспазе-3, цитохрома ц и Бак уз повећање нивоа експресије Бцл-2 и односа Бцл-2/Бак. Закључци: Норвогонин ублажава повреду изазвану хипоксијом у ПЦ12 ћелијама гашењем РОС, одржавајући активностиантиоксидансензима, и инхибирање пута митохондријалне апоптозе.

Кључне речи: Норвогонин,Антиоксидативна активност, Хипоксија, Оксидативни стрес, Апоптоза

Позадина

Аеробним организмима је потребан кисеоник (О2) за производњу енергије. Хипоксија се дефинише као недовољно снабдевање О2 за одржавање ћелијске функције у ткиву и често се јавља у неким физиолошким ситуацијама као што је велика надморска висина [1] и у многим патолошким ситуацијама као што је мождани удар [2]. Мозак је посебно осетљив на повреде изазване хипоксијом због велике потрошње кисеоника, богатог незасићеним масним киселинама и нискеантиоксиданскапацитет [3]. Све већи број доказа указује да хипоксија може изазвати штетне ефекте на мозак [4–6].

Линлин Јинг, Ронгмин Гао, Јие Зханг, Донгмеи Зханг, Јин Схао, Зхенгпинг Јиа и Хуипинг Ма

Одељење за фармацију, 940. болница здружених снага за логистичку подршку ПЛА, Ланџоу 730050, Гансу, Кина

Оксидативни стрес и апоптоза се сматрају као два фактора који доприносе повреди изазваној хипоксијом [7, 8]. Пријављено је да изложеност хипоксији повећава производњу интрацелуларних реактивних врста кисеоника (РОС), што олакшава оксидативни стрес. Прекомерни РОС, као што су супероксидни ањон (О2−˙), водоник пероксид (Х2О2) и хидроксилни радикал (ХО•), доводи до структурних и функционалних промена ћелије нападајући липиде, мембране, протеине и ДНК, и последично узрокује оштећење ћелија [ 9].

Кликните на Цистанцхес за антиоксиданс

Истовремено, прекомерно произведени РОС такође олакшава отварање прелазних пора митохондријалне пермеабилности (мПТП) [10] и пренос протеина про-апоптозе на спољашњу митохондријалну мембрану, што индукује деполаризацију митохондријалних мембрана и ослобађање цитохрома ц [11]. Ове промене на крају изазивају апоптозу зависну од митохондрија [12]. Дакле, верује се даантиоксидансиса способношћу да инхибирају или елиминишу прекомерни РОС, могу да испоље свој заштитни ефекат путем слабљења оксидативног стреса и апоптозе изазване хипоксијом. Многе студије су то доказалеантиоксиданссуплементи попут витамина Ц [13], изофлавона [8] и радикала нитроксида [14], могу ограничити повреду изазвану хипоксијом ин витро и ин виво. Флавоноиди су велика и разнолика класа свеприсутних биљних секундарних метаболита. Увек се сматрају одличним природнимантиоксидансса способношћу уклањања слободних радикала и инхибирања пероксидације липида.

Тренутно се овој класи једињења поклања све више пажње због њиховог благотворног дејства на здравље људи. Показало се да флавоноиди поседују широк спектар фармаколошких деловања, као што су антиинфламаторна, антиноцицептивна и неуропротективна активност, итд., што се све може приписати њиховим антиоксидативним активностима [15]. Многе студије су показале да флавоноиди показују одличне заштитне ефекте на неуспех изазван хипоксијом. На пример, рутин има снажан неуропротективни ефекат против смрти ганглијских ћелија ретине изазване хипоксијом [16]. Недавна студија такође показује да рутин може да ублажи оштећење хипоксије изазвано кобалт хлоридом тако што инхибира оксидативни стрес и апоптозу у ћелијама Х9ц2 [17]. Штавише, Лиу и сарадници сугеришу да нобилетин (3′,4′,5,6, 7,8-хексаметокси флавон) ублажава И/Р повреду миокарда активирањем Акт/ГСК-3 пута у ћелији Х9ц2 [18]. Поред тога, акацетин може заштитити кардиомиоците пацова и кардиомиобласте Х9Ц2 од повреде изазване хипоксијом/реоксигенацијом преко АМПК посредоване активације Нрф2 сигналног пута [19].

Норвогонин (5,7,8-трихидрокси флавон, слика 1) је фармаколошки активан флавон одвојен од корена Сцутеллариа баицаленсис Георги („Хуанг Кин“ на кинеском), традиционалне кинеске биљке која се користи за лечење грипа и рака [20, 21]. Међутим, пријављене су ограничене студије о биолошким активностима норвогонина због његових ниских нивоа у природним биљкама. Да би се решио овај проблем, објављено је неколико метода синтезе норвогонина [22, 23].

Наша претходна студија је такође утврдила једноставну методу за добијање норвогонина из кризина у четири корака [24]. Ова истраживања су позитивно утицала на даљу евалуацију биолошких активности норвогонина. Студије су откриле да норвогонин поседује антиоксидативна [25], антиканцерогена [26, 27], антивирусна [28] и антимикробна активност [29], као и да инхибира производњу РОС стимулисану цијанидом [30]. Међутим, остаје непознато да ли норвогонин има заштитне капацитете против повреда изазваних хипоксијом. Циљ ове студије био је да се испитају заштитни ефекти норвогонина против оксидативног стреса изазваног хипоксијом и апоптозе у ПЦ12 ћелијама.

Методе

Материјали и реагенси

Норвогонин (чистоћа већа или једнака 98 процената) је синтетизован према нашој претходно објављеној методи [24]. Рутин (чистоћа већа или једнака 96 процената) је купљен од Ци Иуан Биотецхнологи Цо., Лтд. (Ксиан, Сханнки, Кина). Норвогонин и рутин су растворени у стерилном диметил сулфоксиду (ДМСО), чувани на -20 степени и разблажени у медијуму ћелијске културе непосредно пре употребе. Дулбеков модификовани орлов медијум (ДМЕМ), фетални говеђи серум (ФБС), стрептомицин и пеницилин су купљени од Соларбио цо., Лтд. (Пекинг, Кина).

Комплети малондиалдехида (МДА), лактат дехидрогеназе (ЛДХ), супероксид дисмутазе (СОД), каталазе (ЦАТ) и глутатион пероксидазе (ГПк) добијени су од Института за биоинжењеринг у Нањинг Јианцхенг (Јиангсу, Кина). 2′,7′-дихлорид-хидрофлуоресцеин диацетат (ДЦФХ-ДА) и (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5- дифенилтетразолијум бромид) тетразолијум (МТТ) је добијен од Сигма-Алдрицх Цо (Сент Луис, МО, САД). Примарна антитела за фактор који изазива хипоксију-1 (ХИФ-1), фактор раста васкуларног ендотела (ВЕГФ), Б ћелијски лимфом-2 (Бцл-2), Бцл{{17 }} повезани Кс протеин (Бак), каспаза-3, цитохром Ц и -актин су сви купљени од Абцам-а (Кембриџ, УК). Секундарна антитела су добијена од компаније ЗсБио (Пекинг, Кина).

Комплет за анализу апоптозе је добијен од Беиотиме Институте оф Биотецхнологи (Јиангсу, Кина). Све хемикалије и растварачи су били аналитичког квалитета и набављени су од комерцијалног добављача у Кини. Ћелијска култура ПЦ12 ћелије су купљене од Банке ћелија Кинеске академије наука (ТЦР 9, Шангај, Кина) и одржаване у ДМЕМ са 10 процената (в/в) ФБС, 100 У/мЛ пеницилина и 100 У/мЛ стрептомицина на 37 степени у влажном инкубатору који садржи 5 процената ЦО2. Да би се проценила цитотоксичност норвогонина, ПЦ12 ћелије (прелаз 4 ~ 6) су претходно инкубиране са различитим концентрацијама (10−8, 10−7, 10−6, 10−5, 10−4 мол/Л) норвогонина за 1 х, а затим култивисан 24 х. Излагање хипоксији Да би се индуковао модел оштећења хипоксије ћелије, ПЦ12 ћелије су биле подвргнуте окружењу хипоксије (1 проценат О2, 5 процената ЦО2 и 94 процената Н2) на 37 степени током 24 сата у влажној комори. Нормоксичне контролне ћелије су култивисане на 37 степени у инкубатору са 5 процената ЦО2 током 24 сата.

Да би се проценио заштитни ефекат норвогонина од повреда изазваних хипоксијом, ПЦ12 ћелије су претходно инкубиране са различитим концентрацијама (10− 8, 10− 7, 10− 6, 10− 5 мол/ Л) норвогонина 1 х пре третмана хипоксије. Вијабилност ћелија Вијабилност ћелија је мерена МТТ тестом као што је претходно описано [31]. Укратко, ПЦ12 ћелије (1 × 105 ћелија/мЛ) су засејане у плоче за културу са 96 јажица. Затим су у бунарчиће додане различите концентрације норвогонина. Једнака запремина ДМСО је додата у контролне бунаре. Коначна концентрација ДМСО у медијуму ћелијске културе је 0,1 проценат. После инкубације у нормоксичним или хипоксичним условима, 10 μЛ МТТ (5,0 мг/мЛ) је додато у сваки бунар, након чега је уследила инкубација на 37 степени током 4 х. Затим је супернатант са МТТ уклоњен и продукт формазана је растворен у 100 μЛ ДМСО. Апсорбанца је мерена на СпецтраМак и3 читачу микроплоча (Молецулар Девицес, Суннивале, ЦА, УСА) на 570 нм. Резултати су изражени као релативни проценат контролне групе. ПЦ12 ћелије које боје хематоксилин и еозин (ХЕ) засејане на стакленим покровима су инкубиране 24 х пре него што су третиране норвогонином на исти начин као што је горе описано.

Медијум је уклоњен и стаклена покровна стакла су испрана хладним ПБС, након чега је уследила фиксација метанолом током 10 мин на собној температури, а затим испрана хладним ПБС три пута по 5 мин. На крају, ћелије су обојене према протоколу бојења ХЕ [32]. Анализе ћелије су вршене коришћењем микроскопа ОЛИМПУС ИКС73 (100×) у циљу верификације морфолошких промена ћелије. Дигиталне слике су добијене коришћењем дигиталног фотоапарата ДКСМ 1200 Ц (Никон) повезаног са микроскопом. Садржај РОС-а Интраћелијски ниво РОС-а у ПЦ12 ћелијама је одређен коришћењем ДЦФХ-ДА теста [33]. Укратко, ПЦ12 ћелије (1 × 105 ћелија/мЛ) су засејане у 6- плоче са бунарима. После третмана хипоксије, ПЦ12 ћелије су испране са ПБС, а затим су инкубиране у медијуму културе који садржи 10 μМ ДЦФХ-ДА током 30 минута у мраку на 37 степени. Ћелије су посматране са Олимпус инвертованим флуоресцентним микроскопом (Токио, Јапан) и анализиране помоћу Бецтон Дицкинсон ФАЦСцан проточног цитометра (БД Биосциенцес, Калифорнија, САД) са таласном дужином ексцитације од 488 нм и таласном дужином емисије од 525 нм. Ниво РОС-а је изражен као релативни проценат контроле. Цурење ЛДХ, садржај МДА и активност антиоксидативног ензима ПЦ12 ћелије (1 × 105 ћелија/мЛ) су засејане у посуду од 90 мм. Након третмана хипоксије као што је горе описано, сакупљено је 50 μЛ супернатанта културе из сваке посуде, а активност ЛДХ у медијуму је откривена коришћењем комерцијалних комплета за анализу (Јианцхенг Институте оф Биотецхнологи, Нањинг, Кина) и изражена је као У/мЛ. ПЦ12 ћелије су сакупљене и хомогенизоване након два пута испирања са хладним ПБС. Концентрација укупног протеина је мерена комплетом за анализу БЦА протеина. Садржај МДА и активност антиоксидативног ензима су одређени коришћењем комерцијалних комплета за анализу (Јианцхенг Институте оф Биотецхнологи, Нањинг, Кина).

Садржај МДА је представљен као нмол/мг протеина. Активности СОД, ЦАТ и ГПк су представљене као У/мг протеина. Апоптоза ћелија (Анексин-В/ПИ бојење) После третмана хипоксије, ПЦ12 ћелије су сакупљене, испране два пута хладним ПБС, а затим суспендоване пуфером за везивање. Ћелије су третиране раствором Аннекин В-ФИТЦ и ПИ према протоколу произвођача (Беиотиме, Шангај, Кина). Прикупљање података је обављено коришћењем Бецтон Дицкинсон ФАЦСцан проточног цитометра (БД Биосциенцес, ЦА, УСА). Квантитативна ПЦР анализа у реалном времену Укупна РНК ћелија ПЦ12 је екстрахована коришћењем Тризол реагенса (Такара, Далиан, Кина) и конвертована у цДНК коришћењем ПримеСцрипт ТМ РТ комплета реагенса (АК4301,

Такара, Далиан, Кина). цДНК који кодира ХИФ-1, ВЕГФ, Бцл-2, Бак, каспазу-3, цитохром Ц и глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназу (ГАПДХ) је појачан квантитативним реалним временски ПЦР коришћењем система за детекцију у реалном времену 7300 (Апплиед Биосистемс, Калифорнија, САД). Коришћени прајмери ​​су приказани у табели 1. Услови ПЦР циклуса били су 95 степени током 30 с, након чега је уследило 40 циклуса од 95 степени током 5 с и 60 степени током 31 с. Нивои мРНА су израчунати коришћењем 2-ΔΔЦт методе и нормализовани на ГАПДХ, који је референтни ген. Вестерн блот ПЦ12 ћелије су сакупљене и хомогенизоване у РИПА агенсима. Концентрација укупних протеина је квантификована коришћењем комплета за анализу БЦА протеина. 30 уг узорака је раздвојено на 12% СДС-ПАГЕ електрофорези и затим пребачено на мембране од поливинилиден флуорида (ПВДФ) (Миллипоре, Биллерица, МА, САД).

Мембране су блокиране са 5% немасног сувог млека у ТБСТ пуферу 1 х на собној температури и инкубиране са примарним антителима: анти-ХИФ-1 (1:300, аб179483, Абцам, УК), анти-ВЕГФ (1:1000, аб46154, Абцам, УК), анти-Бцл-2 (1:1000, аб59348, Абцам, УК), анти-Бак (1:500, аб32503, Абцам, УК), анти каспаза-3 (1:300, аб44976, Абцам, УК), анти цитохром Ц (1:1000, аб13575, Абцам, УК) и анти- -актин (1:2000, аб8227 , Абцам, УК) на 4 степена преко ноћи. Затим су мембране испране и инкубиране са секундарним антителима (1: 2000, ЗсБио, Пекинг, Кина;) 1 х на собној температури. Имунореактивне траке су визуелизоване коришћењем реагенса побољшане хемилуминисценције (ЕЦЛ). Релативни интензитети трака су нормализовани на интерну контролу -актина и анализирани коришћењем Имаге-Про Плус 6.0 (Медиа Цибернетицс, Инц., Бетхесда, МД, УСА).

Статистичка анализа

Резултати су изражени као средња вредност ± СД изведена из најмање три независна експеримента. Разлика између група је анализирана коришћењем једносмерне анализе варијансе (АНОВА) након чега је уследио пост хоц тест Студент–Невман–Кеулс. П-вредност од < 0.05="" сматрана="" је="" статистички="">

Резултати

Норвогонин заштитне ПЦ12 ћелије против повреда изазваних хипоксијом

Прво, да би се спречила пролиферативна активност норвогонина, одређена је његова цитотоксичност на нормалне ПЦ12 ћелије коришћењем МТТ теста. Као што се види на слици 2а, ћелијска пролиферација није значајно промењена након третмана норвогонином у концентрацијама од 1 × 10− 8 -1 × 10− 5 мол/Л (П > 0,05 ). Међутим, виталност ћелија је значајно смањена када је концентрација норвогонина повећана на 1 × 10-4 мол/Л (П < 0,05).="" резултати="" су="" показали="" да="" норвогонин="" није="" показао="" токсичност="" или="" пролиферативну="" активност="" на="" пц12="" ћелијама="" при="" концентрацијама="" од="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="">

Затим смо испитали заштитни ефекат норвогонина против повреде ПЦ12 ћелија изазване хипоксијом. Као што је приказано на слици 2б, у поређењу са контролном групом, виталност ћелија у групи са хипоксијом је смањена на 58,71 процената (П < 0.01).="" у="" поређењу="" са="" третманом="" хипоксије,="" претходно="" третираним="" са="" 1="" ×="" 10−="" 8="" ,="" 1="" ×="" 10−="" 7="" и="" 1="" ×="" 10−="" 6="" мол/л="" норвогонин="" дозно="" заштићен="" пц12="" ћелије="" против="" повреде="" изазване="" хипоксијом,="" обнављајући="" виталност="" ћелија="" са="" 58,71="" на="" 62,79="" процената="" (п="">< 0,05),="" 66,68="" процената="" (п="">< 0,01)="" и="" 69,88="" процената="" (п="">< 0,01),="" респективно.="" предтретман="" са="" 1="" ×="" 10-6="" мол/л="" рутина="" такође="" је="" показао="" заштитни="" ефекат,="" значајно="" повећавајући="" виталност="" ћелија="" на="" 63,78="" процената="" у="" поређењу="" са="" третманом="" хипоксије.="" вијабилност="" претходно="" третирана="" са="" 1="" ×="" 10-5="" мол/л="" норвогонина="" смањена="" је="" на="" 63,43="" процента,="" што="" је="" још="" увек="" значајно="" више="" од="" оне="" у="" групи="" са="" хипоксијом="" (п="">< 0,05).="" ови="" резултати="" су="" показали="" да="" је="" норвогонин="" показао="" значајну="" цитопротекцију="" у="" концентрацијама="" од="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="" мол/л,="" а="" најефикаснија="" концентрација="" је="" 1="" ×="" 10−="" 6="" мол/л.="" затим="" је="" ова="" доза="" коришћена="" као="" оптимална="" доза="" у="" следећим="">

Заштитни капацитет норвогонина је такође верификован морфолошким изменама. Као што је приказано на слици 2ц, ћелије ПЦ12 без третмана хипоксије су добро расле правилних облика (фусиформних), уједначених величина. Након излагања хипоксији, ПЦ12 ћелије су показале скупљање, заобљен облик, десквамацију и смањену густину ћелија. Ћелије које су претходно третиране норвогонином или рутином пре излагања хипоксији су расле боље, број ћелија десквамације се смањио, а облик ћелије се нормално опоравио. Осим тога, заштитна способност норвогонина потврђена је цурењем ЛДХ, што је повезано са губитком интегритета ћелијске мембране. Као што је приказано на слици 2д, активност ЛДХ у медијуму културе је значајно повећана након излагања хипоксији (П <>

Предтретман норвогонином или рутином драматично је смањио цурење ЛДХ, што сугерише да су норвогонин и рутин обновили интегритет ћелијске мембране. Норвогонин инхибира оксидативни стрес изазван хипоксијом у ПЦ12 ћелијама РОС и МДА су два важна индикатора ћелијског оксидативног стреса изазваног хипоксијом. Као што је приказано на сликама 3а и б, примећен је значајно повећан садржај РОС и МДА у ПЦ12 ћелијама након излагања хипоксији. Предтретман норвогонином или рутином значајно је инхибирао производњу РОС и МДА.

Антиоксидативни ензими, као што су СОД, ЦАТ и ГПк, сматрају се главним одбрамбеним системом против оксидативног стреса у ћелијама. Као што је приказано на слици 3ц-е, изложеност хипоксији значајно је инхибирала активности СОД, ЦАТ и ГПк у ПЦ12 ћелијама. Третман норвогонином или рутином преокренуо је ове промене и обновио активности антиоксидативних ензима. Сви ови резултати су показали да норвогонин штити ћелије ПЦ12 од оксидативног стреса изазваног хипоксијом.