Екстракт листова маслине (ОЛЕ) поремети промет аквапорином-2 изазван вазопресином кроз активацију рецептора који осећа калцијум

За више информација. контакт:tina.xiang@wecistanche.com

Васопресин (АВП) повећава пропусност воде убубрежнисабирни канал кроз регулацију трговине аквапорином-2 (АКП2). Неколико поремећаја, укључујући хипертензију и неодговарајућу секрецију антидиуретичког хормона (СИАДХ), повезано је са абнормалностима у хомеостази воде. Показало се да су одређена фито једињења корисна за људско здравље. Овде су ефекти екстракта листова маслине (ОЛЕ) процењени коришћењем ин витро и ин виво модела. Конфокалне студије су показале да ОЛЕ спречава транслокацију АКП2 изазвану вазопресином у плазма мембрану у МЦД4 ћелијама и пацовимабубрези. Инкубација са ОЛЕ смањује АВП-зависно повећање коефицијента осмотске пермеабилности воде (Пф). Да би се разјаснили могући ефектори ОЛЕ, процењен је интрацелуларни калцијум. ОЛЕ повећава интрацелуларни калцијум кроз активацију рецептора за препознавање калцијума (ЦаСР).НПС2143 , селективни ЦаСР инхибитор, укинуо је инхибиторни ефекат ОЛЕ на АВП-зависну пермеабилност воде. Експерименти ин виво су открили да третман са ОЛЕ повећава експресију ЦаСР мРНК и смањује АКП2 мРНА паралелно са повећањем АКП2-циљане миРНА-137. Заједно, ови налази сугеришу да ОЛЕ антагонизује дејство вазопресина кроз стимулацију ЦаСР, што указује да овај екстракт може бити користан за ублажавање поремећаја које карактерише абнормална ЦаСР сигнализација и утиче на реапсорпцију воде у бубрезима.

Листови маслиновог дрвета се широко користе као традиционални лекови за лечење неколико болести, посебно у медитеранским земљама. Листови се обично конзумирају у људској исхрани као екстракт или прах за припрему инфузије или биљног чаја. Анализа хемијске карактеризације открила је да листови маслиновог дрвета садрже неколико биоактивних једињења која могу имати благотворно дејство код одређених болести као што су метаболички синдром, дислипидемија и хипертензија. Код пацијената са есенцијалном хипертензијом, ОЛЕ је смањио крвни притисак и благо смањио гликемију и калцемију. Бројни полифеноли као што су олеуропеин, хидрокситиросол и тиросол су пронађени обогаћени екстрактом листова зелене маслине (ОЛЕ)5, а познато је да су укључени у превенцију одређених болести које карактерише оксидативни стрес. Због тога, последњих неколико година, интересовање за истраживање потенцијалних корисних ефеката екстракта листова маслине расте међу научницима у различитим областима истраживања. ОИЕ је показао значајан антипролиферативни ефекат у ћелијама малигног мезотелиома мењајући интрацелуларну динамику калцијума, вероватно циљајући на Т- типа Ца2 плус канали. Занимљиво је да је откривено да ОЛЕ испољава антихипертензивне ефекте на генетску хипертензију код спонтано хипертензивних пацова (СХР), у вези са побољшањем васкуларне функције*. Прекомерна реапсорпција воде игра важну улогу у патогенези повишеног крвног притиска. Код хипертоничара, лечених екстрактом листова маслине, утврђено је значајно смањење неколико инфламаторних фактора повезано са смањењем крвног притиска. Осим тога, прекомерно задржавање воде карактерише неколико поремећаја као што су цироза јетре, срчана инсуфицијенција и неодговарајуће лучење антидиуретичког хормона (СИАДХ). Хомеостаза воде у телу је строго контролисана антидиуретским хормоном вазопресином (АВП) који се ослобађа у дехидрираном стању. АВП везује свој сродни В2Р рецептор локализован на базолатералној мембранибубрежниглавне ћелије на тај начин активирају цАМП сигнални пут који резултира транслокацијом везикула које носе аквапорин-2(АКП2) из ​​интрацелуларног базена у апикалну плазма мембрану где долази до реапсорпције воде. На молекуларном нивоу, неколико фактора може да модулише равнотежу воде у бубрегу. Повишен ниво луминалног калцијума је смањио краткорочну трговину АОП2 зависну од вазопресина кроз активацију рецептора за сенсинг калцијума (ЦаСР)1,12. С друге стране, активација ЦаСР у условно бесмртним бубрежним проксималним тубуларним епителним ћелијама, изолованим из људског урина, изазвала је значајно повећање цитосолног калцијума и значајно смањила повећање цАМП изазваног форсколином (ФК), директним активатором аденилат цвцласе3. , у МЦД4 ћелијама бубрежних сабирних канала, које стабилно експримирају водени канал АОП2, стимулација ЦаСР је ослабила цАМП-зависно повећање фосфорилације АКП2 на серину 256 што је кључни догађај у каскади трансдукције сигнала активираној вазопресином и који је на крају повећао пропустљивост воде4 ,15 Надаље, убубрегакришке из унутрашње мождине мишјег бубрега, активација ЦаСР са калцимиметиком НПС-Р568 изазвала је значајно повећање АКП2-миРНА која циља на миРНА-137, потврђујући тесну интеракцију између ЦаСР сигналног пута и АКП{ {4}}зависна водопропусност л.17. У овој студији, ефекти екстракта листа маслине, добијеног од локалне сорте Цоратина, процењени су на функцију АКП2 изазвану вазопресином у МЦД4 ћелијама бубрежних сабирних канала које стабилно експримирају АОП2 и у дДАВП третираним пацовима убризганим екстрактом. Пружамо доказе да ОЛЕ третман супротставља одговор вазопресина у бубрежним ћелијама, што би делимично могло објаснити његов диуретички ефекат. Занимљиво је да се чини да је овај ефекат повезан са ОЛЕ-индукованом активацијом ЦаСР, рецептора за који се зна да има негативну интеракцију са рецептором вазопресина12.

Сазнајте више о ефектима цистанцхеа на бубреге

Резултати

Ефекти ОЛЕ на функцију АКП2 изазвану вазопресином у МЦД4 ћелијама. Да би се истражило могуће учешће ОЛЕ у функцији АКП2 зависне од вазопресина,бубрежниМЦД4 ћелије сабирног канала, које стабилно експримирају рецептор вазопресина 2(В2Р) и хумани АКП2, коришћене су као експериментални модел18. Конфокалне студије (Слика 1А) су откриле да је, у поређењу са ћелијама третираним дДАВП, у којима је АКП2 бојење локализовано на апикалној плазма мембрани, третман са ОЛЕ спречио локализацију АОП2 на мембрани изазвану стимулацијом са дДАВП. У складу са овим запажањима, третман ОЛЕ је умањио дДАВП-индуковано повећање временског осмотског одговора (означено као 1/т на Слици 1Б) (ОЛЕ/дДАВП=88.70±1.86 процената, н=292 ћелија у односу на дДАВП=206.8±5,49 процената ,н=186 ћелија;п<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Ефекти ОЛЕ у бубрезима пацова којима је убризган ОЛЕ.

Да би се даље истражило деловање ОЛЕ, спроведене су студије ин виво. Конкретно, пацовима је убризгаван ОЛЕ (250 мг/кг/дан) једном дневно током три дана. Алтернативно, пацови су истовремено третирани са ОЛЕ, током 3 дана, и дДАВП, током 30 мин. Процена ЦаСР мРНА која је изолована из бубрежног сабирног канала пацова и обрађена за ПЦР у реалном времену (слика 6) открила је значајно повећање ЦаСР мРНА у ОЛЕ(ОЛЕ=1.87±0.29, н{{) 10}} пацова у односу на ЦТР=1.02±0.17, н=5 пацова; п<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">бубрега, вестерн блоттинг анализа и конфокалне студије су спроведене (Слика 9). Код пацова којима је убризган ОЛЕ/дДАВП, фосфорилација АКП2 на серину 256 је значајно смањена у поређењу са бубрежним ткивима животиња третираних дДАВП (ОЛЕ/дДАВП=0). 77±0.16, н=5 пацова вс дДАВП=2.16±0.25,н=5 пацова; п<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Дискусија

Калцијум је важан интрацелуларни гласник који модулира мноштво ћелијских функција2. Абнормална сигнализација калцијума може довести до неколико болести укључујући срчану инсуфицијенцију, рак и хипертензију23. Специфична контрола експресије и активности протеина који контролишу вишеструке интрацелуларне калцијумове сигнале се показала успешном у суочавању са бројним поремећајима и стога је привлачна за развој лекова. Ова студија пружа нове увиде у механизам деловања ОЛЕ-а показујући његову способност да модулира интрацелуларну сигнализацију калцијума кроз стимулацију ЦаСР-а који је укључен у фино подешавање промета и експресије АКП2 изазваног вазопресином. У физиолошким условима, АКП2 игра важну улогу у контроли хомеостазе воде у телу25. Стимулација интрацелуларне машинерије, која доводи до локализације АКП2 на апикалној плазма мембрани, доводи до абнормалног задржавања воде и последичне хипонатремије као код синдрома неодговарајућег лучења антидиуретичког хормона (СИАДХ), цирозе јетре и конгестивне срчане инсуфицијенције-. модел СИАДХ, повезан са хаплоинсуфицијенцијом полицистичне болести бубрега 1, базални интрацелуларни ниво калцијума је значајно смањен у поређењу са нивоом измереним у сабирним каналима мишева дивљег типа. Низак интрацелуларни калцијум је смањио активност одређених ензима, укључујући протеин фосфатазу ПП2А, што је резултирало појачаном регулацијом фосфорилације АОП2 код серина 2561. Насупрот томе. активација ЦаСР са калцимиметиком НПС-Р568 повећала је концентрацију интрацелуларног калцијума и смањила ниво цАМП у ћелијама са недостатком ПКД1. Важно је да цитосолни калцијум може да смањи адениловану циклазу 3 која се инхибира калцијумом, чиме се фино подешава интрацелуларни ниво цАМП. У МЦД4 ћелијама, заиста, стимулација ЦаСР са НПС-Р568 смањила је АКП2-пС256 преко инхибилата цицласе4. У овој студији, третман са ОЛЕ је спречио вазопресин-зависно повећање цАМП и АОП2-пС256, вероватно као последица повећања интрацелуларне концентрације калцијума. Треба напоменути да је излагање спољном извору цАМП-а коришћењем пермеабилног 8-Бр-цАМП значајно супротставило инхибиторни ефекат ОЛЕ на В2Р пут.

Повишен ниво цитосолног калцијума може довести до смрти ћелије и апоптозе. Међутим, континуирано повећање интрацелуларног калцијума са 250 нМ на више од 600 нМ је допринело преживљавању неурона4. У МЦД4 ћелијама, третман са ОЛЕ од 0,1 мг/мл не показује цитотоксични ефекат. При овој концентрацији, ОЛЕ (0,1 мг/мл) је благо повећао интрацелуларни ниво калцијума. Снимање калцијума је открило да је акутна стимулација са ОЛЕ изазвала пролазно повећање интрацелуларног калцијума кроз активацију ЦаСР који се поништава када су ћелије претходно инкубиране са селективним антагонистом ЦаСР НПС2143, у ћелијама проксималних тубула бубрега, алостерична активација ЦаСР са И- смањио производњу РОС-а и тиме смањио оксидативни стрес митохондрија који је изазвао апоптозу ћелије356. Штавише, наша претходна студија је показала да експресија варијанти појачања функције ЦаСР смањује ослобађање РОС и С-глутатионилацију АКП237. Инкубација са ОЛЕ је смањила генерисање РОС у МЦД4 ћелијама35 показујући његову антиоксидативну способност. Ипак, тренутно је нејасно да ли ОЛЕ утиче на АОП2-С-глутатионилацију. Бројне студије су откриле да ОЛЕ или олеуропеин, који је главни састојак ОЛЕ, могу имати заштитну улогу инхибирајући смрт ћелија,39 Међутим, ефекти зависни од дозе описани су код пацова који су примали ОЛЕ. Повољни одговори су добијени при дозама од 250 и 500 мг/кг. Насупрот томе, при вишим концентрацијама, третман са ОЛЕ може имати штетне ефекте вероватно због прооксидативног деловања неколико фито једињења. У овој студији, пацовима је убризган ОЛЕ у дози од 250 мг/кг током три дана, показујући повећану регулацију ЦаСР. Ниво експресије ЦаСР повећавају одређена једињења која делују као алостерични активатори рецептора. Калцимиметици су заиста смањили васкуларне калцификације повећањем биосинтезе ЦаСР у ћелијама глатких мишића крвних судова људи0. У овом такмичењу, не може се искључити могућност да одређена једињења у ОЛЕ могу функционисати као алостерични модулатори ЦаСР. С друге стране, стимулација вазопресином може довести до ослобађања ИЛ-6 што може допринети повећању нивоа експресије ЦаСР42.

У бубрезима, стимулација ЦаСР сигнализације је повезана са смањењем експресије АКП2, вероватно кроз миР-137 генерацију. миРНА су кључни посттранскрипциони модулатори. Такође је описано неколико миРНА зависних од вазопресина које циљају експресију АКП243. Трансфекција са миР-32 и миР-137 значајно је смањила ниво експресије АОП2 у ћелијама мпкЦЦДц14. Занимљиво је да ОЛЕ може да умањи инфламаторне сигнале и да испољава заштитне ефекте модулацијом нивоа експресије неколико миРНА". Конкретно, у мултиформним ћелијама глиобластома, ОЛЕ је промовисао експресију различитих миРНА укључујући миР-13745 која је укључена у смањење регулације Акт/мТОР сигнални пут 46. Треба напоменути да третман са олеуропеином спречава Акт/мТОР сигнализацију кроз активацију ЦАМК и АМПК изазване калцијумом". Активација ЦаСР са НПС-Р568 активира АМПК и смањује активност мТОР у људским проксималним тубуларним ћелијама3. У складу са овим налазима, инкубација са ОЛЕ повећава цитосолни калцијум, смањује активност ПКА и смањује величину цисте у моделу 3Д ћелијске културе48. Заједно, ови налази сугеришу да ОЛЕ може бити користан у лечењу поремећаја које карактерише дисрегулација интрацелуларне динамике калцијума у ​​вези са смањењем ЦаСР сигнализације.

Екстракт листова маслине састоји се од неколико биоактивних компоненти, укључујући полифеноле, влакна и минерале49. Тренутно није јасно да ли једно једињење или синергијска комбинација фитоједињења у ОЛЕ може бити од користи у модулацији интрацелуларних одговора. Екстракт који је коришћен у овој студији примењен је као могући адитив за храну и стога је важно дефинисати физиолошки утицај самог екстракта с обзиром на то да се неколико фенола, укључујући хидрокситиросол, може филтрирати преко бубрега и вратити у урину50. Даља истраживања ће обезбедити ефикасност специфичних компоненти које могу активно регулисати интрацелуларну калцијумску сигнализацију кроз ЦаСР. Да закључимо, ова студија пружа доказе да се ОЛЕ може сматрати новим потенцијалним адјувансом корисним за ублажавање поремећаја које карактерише смањење експресије ЦаСР, као и сигнализација и утицај на пропустљивост воде бубрега.

материјали и методе

Хемикалије и антитела.Све хемикалије и антибиотици су купљени од Мерцк-а (Мерцк КГаА, Дармстадт, Немачка). Цалцеин-АМ, Фура{1}}АМ, медијум за ћелијску културу, фетални говеђи серум (ФБС) и хемилуминисцентни супстрати Супер Сигнал Вест Пицо купљени су од Тхермо Фисхер Сциентифиц-а (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, САД). Акуапорин{ {2}}(АКП2) је детектован коришћењем специфичних антитела (Ц-реп Аб) подигнутих против синтетичког пептида који одговара последњих 15 Ц-терминалних аминокиселина хуманог АКП2!. АКП2-пС256 антитела је љубазно поклонио професор Петер Деен. Секундарна козја антитела везана за зечју пероксидазу рена добијена су од Мерцк-а (Мерцк КГаА, Дармстадт, Немачка). Секундарно антитело козе против зеца спојено са Алека-488 купљено је од Тхермо Фисхер Сциентифиц-а (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА).

Производња екстракта богатог фенолима и хемијска карактеризација.Производња екстракта богатог фенолима из листова маслине изведена је као што је објављено у Раниери ет ал.35. Након млевења блендером (Варинг-Цоммерциал, Торрингтон, ЦТ, САД), додата је ддХ2О вода (однос 1/20, в/г), а затим три пута подвргнута ултразвуку (ЦЕИА, Вициомаггио, Италија) 30 мин на 35±5 степени сваки пут. Коначно, екстракти су филтрирани кроз филтер папир, лиофилизовани и чувани на -20 степени Ц. Добијени екстракти су филтрирани најлонским филтерима од 0,45 μм (Мерцк КГаА, Дармстадт, Немачка) и коришћени за хемијску карактеризацију. Укупан садржај фенола, антиоксидативна активност и идентификација појединачних фенолних једињења вршени су према Дифонзо ет ал.. ОЛЕ је показао садржај полифенола, одређен по Фолин-Циоцалтеу, једнак 195 мг. еквиваленти галне киселине (ГАЕ) и антиоксидативна активност, одређена АБТС (2,2'-азино-бис(3-етилбензотиазолин-6-диамонијум со сулфонске киселине)), што чини 750 μмол ТЕ (еквивалената Тролок) .

Ћелијска култура и третмани.МЦД4 ћелије кортикалног сабирног канала миша, које стабилно експримирају хумани АКП2 и химерни В2Р-Рлуц, коришћене су као експериментални модел18. Ћелије су узгајане у мешавини 1:1 Далбец-цос модификованог Еагле-овог медијума и Ф-12 са додатком 5 процената (г/г) феталног говеђег серума. 1 проценат (г/г) Л-глутамина и 1 проценат пеницилина/стрептомицина, 5 μМ дексаметазона, 400 уг/мл Г418 (за отпорност на АКП2) и 1 уг/мл пуромицина (за отпорност на В2Р-Рлуц) , у влажној атмосфери од 5 процената ЦО, на 37 степени. МЦД4 ћелије су остављене у базалном стању (ЦТР) или дуготрајно третиране са ОЛЕ на 0,1 мг/мл О/Н, дДАВП на 100 нМ током 30 минута, или заједно третиране са ОЛЕ и дДАВП или НПС2143 на 1 μМ О/Н Алтернативно, ћелије су биле изложене 8-Бр-цАМП на 500 μМ током 45 минута, краткорочни експерименти су изведени са ОЛЕ при 1 мг/мл током 5 минута и НПС2143 на 10 μМ током 15 минута. Експерименти су изведени 3-5 независних пута коришћењем ћелија из различитих пасуса.

Животињски модел и третмани.Све процедуре су спроведене у сагласности са Данским националним смерницама за негу и руковање експерименталним животињама и објављеним смерницама Националног института за здравље. Протоколи су одобрени од стране Института за клиничку медицину. Универзитет Архус, према дозволама за коришћење експерименталних животиња које је издало данско Министарство правде (број одобрења 2015-15-0201-00658). Студије су спроведене на одраслим пацовима типа Вистар мужјака са почетном тежином од 200-225 г. Животиње су држане на стандардној исхрани глодара (Алтромин, Лаге, Немачка) и имале су слободан приступ води из славине. Током експеримената, пацови су били смештени у групама од по два по кавезу, са циклусом светло-мрак од 12:12 х, температуром од 21±2 степена Ц и влажношћу од 55±2 процента. Пет пацова је третирано субкутаном ињекцијом 1 нг дДАВП (Сигма-Алдрицх, Глоструп, Данска) у 200 ул физиолошког раствора/животиња, а пет пацова третираних носачем служило је као контрола. Након 30 минута, пацови су убијени, а бубрези су обрађени како је описано у наставку.

Ћелије и ИМЦД лизати.Ћелије су узгајане на посудама од {{0}} мм и ресуспендоване у пуферу који садржи 220 мМ манитола, 70 мМ сахарозе, {{10}}. 5 М ЕГТА пХ 8,0,0,5 М ЕДТА пХ 8,0,1 М Трис-ХЦл пХ 7,4 у присуству протеаза (1 мМ ПМСФ, 2 мг/мл леупептина и 2 мг/мл пепстатина А) и фосфатаза (10 мМ НаФ и 1 мМ инхибитори натријум ортованадата. Алтернативно, пресеци бубрега од приближно 0,5 мм су припремљени и уравнотежени 10 минута у пуферу који садржи 1и8 мМ НаЦл, 16 мМ Хепес, 17 мМ На-Хепес, 14 мМ глукозе, 3,2 мМ КЦл, 2,5 мМ ЦаСОлм2, мМ ЦаСО8. 1,8 мМ КХ2ПО4 (пХ7,4). Бубрежна папила је уситњена маказама у истом пуферу у присуству протеаза (1 мМ ПМСФ, 2 мг/мллеупептин, и 2 мг/млпепстатин А) и фосфатаза (10 мМ НаФ и 11) ортованадат) инхибитори. После ултразвучне обраде (60 кХз током 5 с), лизати су центрифугирани на 12,000×г током 10 мин. Супернатанти су сакупљени и коришћени за имуноблотинг студије'8.

Конфокална микроскопија.Конфокалне студије су изведене као што је претходно описано1. Укратко, ћелије су узгајане на ПЕТ уметцима ћелијске културе и третиране као што је горе описано. Алтернативно, пресеци бубрега добијени од контролних, ОЛЕ, дДАВП и ОЛЕ са пацовима третираним дДАВП су подвргнути експериментима имунофлуоресценције као што је претходно описано. Слике су добијене конфокалним ласерским скенирајућим флуоресцентним микроскопом Леица ТЦС СП2 (Леица Мицросистемс, Хеербругг, Швајцарска). Гел електрофореза и имуноблотирање. Протеини су раздвојени на 12% полиакриламидних гелова без мрља (Био-Рад Лабораториес, Инц., Херцулес, ЦА, УС.А.) у редукционим условима као што је претходно описано=5,52. Укратко, протеинске траке су пренете на Иммобилон-П мембране (Мерцк КГаА, Дармстадт, Немачка) и имуноблотиране коришћењем анти-АКП2 (Пре-Ц-таил Аб) и анти-АКП2-пС256 антитела. Имунореактивни сигнали су добијени коришћењем Супер Сигнал Вест Пицо хемилуминисцентних супстрата са Цхемидоц системом (Био-Рад Лабораториес, Инц., Херцулес, ЦА, УСА). Траке су нормализоване на укупни протеин коришћењем технологије без мрља (Био-Рад Лабораториес, Инц., Херцулес, ЦА, УСА). Анализа дензитометрије је извршена коришћењем ИмагеЛаб-а (Био-Рад Лабораториес, Инц., Херцулес, Калифорнија, САД) и анализирана коришћењем ГрапхПад Присм (ГрапхПад Софтваре, Сан Диего, ЦА, УСА).

Испитивање водопропусности.Осмотска пропустљивост воде је мерена као што је претходно описано43. Укратко, МЦД4 ћелије су узгајане на 40-мм стакленим покровним стакалцима. После третмана, ћелије су напуњене са 10 μМ мембрански пропустљивим Цалцеин-АМ током 45 минута на 37 степени, 5 процената ЦО, у ДМЕМ/Ф-12. Поклопци су постављени у перфузиону комору (ФЦС2 Цлосед Цхамбер Систем, БИОПТЕЦХС, Бутлер, САД). Мерења су обављена коришћењем инвертованог ТЕ2000-С микроскопа (Никон Ецлипсе микроскоп, Токио, Јапан) опремљеног за мерење флуоресценције једне ћелије и анализу слике. Узорци напуњени Цалцеин-АМ су побуђени на 490 нм. Мерење флуоресценције, након изосмотске (140 мМ НаЦл. 5 мМ КЦл, 1 мМ МгЦл.. 1 мМ ЦаЦл., 10 мМ Хепес сулфонске киселине, 5 мМ глукозе, пХ 7,4) или хиперосмотске (изосмотски раствор додат са 135 раствором манитола) . су спроведене коришћењем Метафлуор софтвера (Молецулар Девицес, МДС Аналитицал Тецхнологиес, ​​Торонто, Канада). Снимани су подаци о временском току флуоресценције након перфузије ћелија са изо- и хиперосмотским растворима. Временски ток скупљања ћелије је мерен као временска константа (Ки, изражена као 1/р, сек), параметар у корелацији са пропусношћу воде, добијен уклапањем података са експоненцијалном функцијом анализираном помоћу ГрапхПад Присм (ГрапхПад Софтваре, Сан Диего , Калифорнија, САД).

Мерење преноса енергије флуоресцентне резонанције.За процену интрацелуларних цАМП промена, примењена је технологија преноса енергије флуоресцентне резонанце (ФРЕТ). За ФРЕТ експерименте, ћелије су трансфектоване са плазмидом који кодира Х96 сензор који садржи цАМП-везујући консензус мотив ЕПАЦ1 уграђен између цијан флуоресцентног протеина (ЦФП) и цп173Венера-Венера као што је претходно приказано32.33.54. Плазмид који кодира сонду Х96 је поклон др.К. Јалинк. Визуелизација ћелија које експримирају ЕЦФП и/или ЕИФП и детекција ФРЕТ-а изведени су помоћу инвертованог ТЕ2000-С микроскопа (Никон Ецлипсе микроскоп, Токио, Јапан). Свака слика је исправљена и анализирана као што је претходно приказано55.

Интрацелуларна мерења калцијума. Интрацелуларна мерења калцијума су обављена као што је претходно приказано56. Укратко, МЦД4 ћелије су напуњене са 4 μМ Фура-2 АМ током 15 минута на 37 степени у ДМЕМ/Ф-12. За перфузију ћелија током експеримента коришћен је Рингеров раствор који садржи 140 мМ НаЦл, 5 мМ КЦл, 1 мМ МгЦл, 10 мМ ХЕПЕС, 5 мМ глукозу, 1,8 мМ ЦаЦл, пХ 7,4. У мерењима флуоресценције, поклопци са преоптерећеним ћелијама су постављени у перфузиону комору (ФЦС2 Цлосед Цхамбер Систем. БИОПТЕЦХС. Бутлер, САД). Мерења су обављена коришћењем инвертованог ТЕ2000-С микроскопа (Никон Ецлипсе микроскоп, Токио. Јапан). Однос интензитета флуоресценције на 340 и 380 нм је уцртан и израчунат као промена флуоресценције. Конкретно, стимулација са ОЛЕ (1 мг/мл) или НПС2143 (10 μМ) је упоређена у истом типу ћелија са онима добијеним након стимулације са максималном дозом агониста посредованог калцијумом АТП (100 μМ) који је коришћен као унутрашња контрола (100 посто).

Интрацелуларни ниво калцијума је мерен у стабилном стању и калибрисан како је описао Гринкиевицз57. ОЛЕ и НПС2143 су коришћени дугорочно на 0.1 мг/мл и л уМ, респективно, а сваки узорак је калибрисан додавањем 5 μМ јономицина у присуству 1 мМ ЕГТА (Рм.), а затим 5 мМ ЕГТА (Рм.) μМ јономицина у 5 мМ ЦаЦл, (РМА).

ПЦР анализа АКП2 и ЦаСР мРНА у реалном времену код контролних и третираних пацова.ПЦР експерименти у реалном времену су изведени да би се измерила релативна експресија мРНК у унутрашњем сабирном каналу медуле (ИМЦД) изолованом из контролних и третираних папила бубрега пацова. Направљени су резови бубрега од око 0.5 мм и еквилибрисани 10 минута у пуферу који садржи 118 мМ НаЦл, 16 мМ ХЕПЕС, 17 мМ На-Хепес, 14 мМ глукозе, 3,2 мМ КЦл, 2,5 мМ ЦаЦл2. мМ МгСО4 и 1,8 мМ КХ2ПО4 (пХ 7,4). Бубрежна папила је изолована под стереомикроскопом. Узорци контролних и третираних пацова су затим уситњени маказама директно у Тризолу (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА). Реверзна транскрипција је извршена на 2,5 уг укупне РНК коришћењем СуперСцриптВило Мастер Мик-а (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, САД), у складу са предлозима произвођача (25Ц 10 мин; 42Ц 60 мин; 85Ц 5 мин). ПЦР амплификација у реалном времену је изведена коришћењем ТагМан Фаст Адванцед Мастер Мик-а са ЦаСР, АОП2 и ГАПДХ тестовима (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА) у СтепОне ПЦР систему у реалном времену (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА ), постављање услова термичког циклуса како је навео произвођач (95 степени Ц за 20 с; 40 циклуса алтернативно на 95°Ц за 1 с и 60 степени Ц за 20 с). Резултати су изражени као 2- вредности (релативна квантификација) са третираним △АЦт=(Цт циљ-Цт ГАПДХ)-(Цт циљ-Цт ГАПДХ)Схам1.

процена миРНА-137 код контролних и третираних пацова.Садржај миРНА{{0}} у контролном и третираном сабирном каналу унутрашње мождине пацова је процењен коришћењем ТагМан Адванцед миРНА Ассаис (хас-миР-137; ИД анализе; 477904 мир; Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА .УС.А), који је омогућио високо осетљиво и специфично обавештење о зрелој миРНА помоћу квантитативне ПЦР. Направљени су резови бубрега од око 0,5 мм и еквилибрисани 10 минута у пуферу који садржи 118 мМ НаЦл, 16 мМ ХЕПЕС, 17 мМ На-Хепес, 14 мМ глукозу, 3,2 мМ КЦл, 2,5 мМ ЦаЦл2, 1м М88. КХ2ПО4(пХ7,4). Бубрежна папила је изолована под стереомикроскопом. Узорци контролних и третираних пацова су затим уситњени маказама директно у Тризолу (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА) да би се екстраховала укупна РНК. ТакМан Адванцед миРНА цДНА Синтхесис Кит （Каталог н²∶А25576; Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, САД) је коришћен за добијање цДНК синтезе, према протоколу који је обезбедио произвођач (Реакција поли(А) репа; реакција лигације; реакција реверзне транскрипције; миР-Амп реакција). Синтетичку РНК (УУАУУГЦУУААГААУАЦГЦГУАГ) са 59-фосфором је синтетизовао Тхермо Фисхер Сциентифиц и користио је за извођење калибрационе криве за интерполацију вредности узорка миРНА и за добијање прецизне процене (у нанограмима) садржаја миР-137 у узорци16, коришћењем ГрапхПад Присм (ГрапхПад Софтваре, Сан Дијего, Калифорнија, САД).

Статистичка анализа.Све вредности су приказане као средња вредност±СЕМ Статистичка анализа је извршена једносмерном АНОВА-ом праћеном Невман-Кеулсовим тестом вишеструких поређења са *п<0.05 considered="" statistically="" different="">

Изјаве, етичко одобрење и сагласност за учешће.Студије на животињама су спроведене у складу са данским националним смерницама за негу и руковање експерименталним животињама и објављеним смерницама Националног института за здравље. Етички комитет за бригу о животињама Института за клиничку медицину Универзитета Архус одобрио је протоколе студија, у складу са дозволама за коришћење експерименталних животиња које је издало данско Министарство правде (број одобрења 2015-15-0201-00658). Аутори потврђују да су све методе спроведене у складу са релевантним смерницама и прописима. Штавише, аутори потврђују да је студија спроведена у складу са смерницама АРРИВЕ.

Референце

1. Ел, СН & Каракаиа, С. Дрво маслине (Олеа еуропаеа) оставља потенцијално благотворно дејство на здравље људи. Нутр. Рев. 67, 632–638.

2. Јавади, Х., Иагхообзадех, Х., Есфахани, З., Реза Мемарзадех, М. & Мехди Мирхасхеми, С. Ефекти екстракта листова маслине на метаболички одговор, функције јетре и бубрега и инфламаторне биомаркере код хипертензивних пацијената. ПЈБС 22, 342–348.

3. Саибандитх, Б., Спенцер, ЈПЕ, Ровланд, ИР & Цоммане, ДМ Оливе полифеноли, и метаболички синдром. Молецулес

4. Цхериф, С. ет ал. Клиничко испитивање титрираног Олеа екстракта у лечењу есенцијалне артеријске хипертензије. Ј. Пхарм. Белг. 51, 69–71 (1996).

5. Дифонзо, ГРА ет ал. Зелени екстракти из сорте маслине цортина остављају антиоксидантну карактеристику и биолошку активност. Ј. Фунцт. Храна 31, 8.

6. Херреро, М. ет ал. Нове могућности за валоризацију нуспроизвода маслиновог уља. Ј. Цхроматогр. 1218, 7511–7520.

7. Марцхетти, Ц. ет ал. Екстракт листа маслине обогаћен олеуропеином утиче на динамику калцијума и нарушава виталност ћелија малигног мезотелиома. еЦАМ 2015, 908493.

8. Ромеро, М. ет ал. Антихипертензивни ефекти екстракта маслиновог листа обогаћеног олеуропеином код спонтано хипертензивних пацова. Функција хране 7, 584–593.

9. Халл, ЈЕ Дисфункција бубрега, а не неренална васкуларна дисфункција. Посредује у хипертензији изазваној соли. Тираж 133, 894–906.

10. Вилсон, ЈЛ, Миранда, ЦА & Кнеппер, МА Васопресин и регулација аквапорина-2. Цлин. Екп. Непхрол. 17, 751–764.