Абстрацт

Цистанцхе тубулоса(Сцхенк) Вајт, драгоцена хомологна биљка за храну и лек из породице Оробанцхацеае, широко се узгаја у јужном Синђангу у Кини. Његови главни биоактивни састојци фенилетаноидног гликозида,ехинакозидиактеозид (вербаскозид), пружају вишеструке фармаколошке активности укључујући антиоксидацију, антиинфламацију и регулацију имунитета. Нестандардизовани традиционални поступци прераде често узрокују значајне губитке ових основних активних једињења, ограничавајући примену у медицини и функционалној храни.Цистанцхе тубулосадецоцтион комада. Ово истраживање је имало за циљ да оптимизује савремене параметре прераде свежегЦистанцхе тубулосакришке како би се максимизирао опоравак актеозида и ехинакозида и додатно разјаснили антиоксидативни стрес и антиинфламаторну биоактивност, као и основни молекуларни механизам оптимално обрађених комада децокције на ћелијском нивоу.

Експерименти са једним фактором су изведени да би се прегледали одговарајући распони за дебљину кришке, трајање парења и температуру сушења у пећници. Усвојена је трофакторна тростепена методологија Бок-Бехнкенове површине одговора за успостављање модела интеракције са више фактора, користећи садржај актеозида и ехинакозида као двоструке индикаторе евалуације. Након тога, направљен је модел ћелије макрофага миша РАВ264.7 стимулисан липополисахаридом (ЛПС) како би се симулирала пероксидација липида и акутна запаљенска оштећења. Серија биохемијских тестова укључујући МТТ, РОС флуоресцентну детекцију, ЕЛИСА и Вестерн блот је спроведена да би се проценила потенција антиоксидативног стреса и истражили путеви трансдукције сигнала.

Према експерименталним резултатима, оптимални параметри обраде су одређени као дебљина реза од 0,6 цм, третман паром у трајању од 6 минута и температура сушења подешена на 57 степени. Под овим практичним условима обраде, измерени садржаји актеозида и ехинакозида достигли су 7,25 % и 31,62 % респективно, показујући добру конзистентност са теоријским предвиђеним вредностима. Тестови засновани на ћелијама открили су да је то оптимално обрађеноЦистанцхе тубулосаекстракти децоцтион-комада значајно су смањили концентрације азотног оксида (НО) и малондиалдехида (МДА) у макрофагима РАВ264.7 изазваним ЛПС. У међувремену, значајно је повећао интрацелуларне антиоксидативне ензимске активности супероксид дисмутазе (СОД), каталазе (ЦАТ), лактат дехидрогеназе (ЛДХ), заједно са повећаним садржајем глутатиона (ГСХ). Нивои секреције проинфламаторних медијатора укључујући ТНФ‑, ИЛ‑1 и ИЛ‑6 су такође потиснути на начин који зависи од дозе. Western‑blot detection validated thatЦистанцхе тубулосаекстракти су обуздали прекомерну фосфорилацију кључних протеина унутар п38/АКТ/ЈНК/НФ‑κБ сигналних каскада.

Укратко, овај оптимизовани модеран протокол обраде ефикасно побољшава приносе карактеристичних фенилетаноидних гликозида (актеозида и ехинакозида) уЦистанцхе тубулосадецоцтион комада. Обрађени биљни материјал испољава истакнуте антиоксидативне и антиинфламаторне ефекте у моделу повреде макрофага изазваних ЛПС-ом, чији се фармаколошки механизам делимично реализује преко инхибиције прекомерне активације п38/АКТ/ЈНК/НФ-аммоторног сигнала у акутном сигналу. Овај рад пружа поуздане техничке параметре за стандардизовану индустријску производњу и пружа експерименталну подршку за развој антиоксидантне функционалне хране добијене одЦистанцхе тубулоса.

Кључне речи: Цистанцхе тубулоса; технологија обраде децоцтион-комада; ацтеосиде; ехинакозид; антиоксидативни стрес; РАВ264.7 макрофаг; п38/АКТ/ЈНК/НФ‑κБ сигнални пут

1. Увод

Цистанцхе тубулоса(Сцхенк) Вајт припада породици Оробанцхацеае, а његова месната љускава стабљика је званични лековити део. Ова пустињска лековита биљка је углавном засађена у сушном јужном Ксињиангу у Кини. У традиционалној кинеској биљној пракси,Цистанцхе тубулосаслужи као класична тоник биљка са документованим терапеутским функцијама тонирања бубрега-јанга, допуњавања есенције крви и опуштања пражњења црева. Клинички се примењује за ублажавање болова-слабости лумбуса и колена, неплодности изазване недостатком бубрега и затвором изазваном сувоћом црева维普期刊.

Фенилетаноид гликозиди представљају најкритичније биоактивне маркереЦистанцхе тубулоса. Кинеска фармакопеја предвиђа да укупан садржај ехинакозида плус актеозид не сме бити мањи од 1,50% за квалификоване медицинске материјале. Ипак, тренутна главна производњаЦистанцхе тубулосакомадићи децокције и даље углавном прате древне ручне токове рада: намакање свеже сирове биљке, темељно влажење, резање и природно сушење или обрада вина на пари. Овим конвенционалним приступима недостају прецизне квантитативне техничке спецификације. Термичка нестабилност фенилетаноидних гликозида често доводи до озбиљне деградације активног састојка током прераде, што смањује квалитет финалног производа и ограничава производњу великог квалитета. Тренутно, само ограничено истраживање истовремено комбинује оптимизацију технологије обраде са валидацијом биолошке активности; већина студија само открива садржај хемијских састојака без провере ћелијске функције, стварајући празнине за индустријску трансформацију.

Оксидативни стрес делује као основни патолошки покретач за више хроничних метаболичких и инфламаторних болести. Прекомерна акумулација реактивних врста кисеоника (РОС) ремети редокс хомеостазу, додатно провоцирајући прекомерну активацију макрофага и масивно ослобађање проинфламаторних цитокина, формирајући зачарани круг између оксидације и упале. Постојећа фармаколошка истраживања су то доказалаЦистанцхефенилетаноидни гликозиди поседују антиоксидативна и антиинфламаторна својства. Претходни експерименти на животињама су то показалиЦистанцхе тубулосаукупни гликозиди су побољшали повреду јетре код модела глодара сепсе активирањем Нрф2/ХО‑1 антиоксидативне сигнализације. Компоненте лигнан-гликозида изоловане изЦистанцхе тубулосамогао ублажити инфламаторне одговоре изазване ЛПС-ом путем модулације ПИ3К/АКТ пута у РАВ264.7 макрофагима. Међутим, није систематски процењивано да ли децоцтион-комадићи произведени у новооптимизованим условима обраде задржавају снажну биоактивност против оксидативног стреса. Конкретни молекуларни регулаторни механизам и даље захтева дубље истраживање.

Макрофаг РАВ264.7 стимулисан ЛПС-ом је добро прихваћен модел ин-витро запаљења-оксидативног оштећења, широко прихваћен за процену антиоксидативних и анти-инфламаторних ефеката природних производа. У овој студији, прво смо спровели једнофакторски скрининг, а затим Бок-Бехнкенову оптимизацију површине да бисмо добили стандардизоване техничке параметре за резање-парење-сушење који циљају на високе приносе актеозида и ехинакозида. Након добијања оптимизованих производа за децокцију, припремамо биљне екстракте и усвајамо модел оштећења ћелија РАВ264.7 изазван ЛПС-ом. Више експерименталних платформи укључујући мерење биохемијских маркера оксидативног стреса, квантификацију цитокина ЕЛИСА и Вестерн-блот анализу пута се користи да би се разјаснила ефикасност антиоксидативног стреса и механизам трансдукције сигнала. Ово истраживање даје практичне параметре процеса за пилотску производњу високог квалитетаЦистанцхе тубулосакомадићи децокције са стабилном антиоксидативном активношћу и постављају експерименталну основу за каснији развој функционалне хране и производа дијететских суплемената пореклом из КсињиангаЦистанцхе тубулосаресурси.

2. Материјали и методе

2.1 Сировине, реагенси и инструменти

СвежеЦистанцхе тубулосамеснате стабљике убране су у јесен из Хотана, аутономни регион Синђијанг Ујгура, Кина. Ћелијска линија леукемије моноцита-макрофага миша РАВ264.7 купљена је од Процелл Лифе Сциенце & Тецхнологи Цо., Лтд (Вухан, Кина). Ацетонитрил и метанол хроматографске чистоће испоручио је Мерцк (Немачка). Референтне стандардне супстанце ехинакозид и актеозид (чистоћа већа од или једнака 98 %) добијене су од Пекиншког института за метролошка истраживања у области метрологије у Пекингу. Диметил сулфоксид (ДМСО) је купљен од Сигма‑ВЕТЕЦ (САД). ДМЕМ медијум са високим садржајем глукозе, комплет за анализу укупног протеина БЦА су производи компаније Тхермо Фисхер Сциентифиц (САД). Фетални говеђи серум (ФБС) је набављен од БИ (Израел). Раствор двоструких антитела пеницилин-стрептомицина дошао је из компаније ХиЦлоне (САД). Комерцијални сетови за анализу НО, МДА, СОД, ЦАТ, ГСХ набављени су од Беиотиме Биотецхнологи (Шангај, Кина). Комплет за детекцију ЛДХ и липополисахарида (ЛПС,Е. цоли055:Б5) добијени су од Соларбио (Пекинг, Кина).

Кључни лабораторијски инструменти укључивали су систем течне хроматографије високих перформанси Схимадзу (ХПЛЦ), ЛабТецх ротациони испаривач, брзи млевач кинеског биља са окретањем, термостатску пећ за сушење млазом, опрему за сушење паром, микроплатер за микроплоче, БиоТек СИНЕ1РГИ. Електронска аналитичка вага ФА1204Н, хлађена центрифуга ЦФ1524Р, биолошки сигурносни ормарић БСЦ‑1300ИИА2 и инвертни оптички микроскоп БДС200‑ПХ.

2.2 Експерименти обраде са једним фактором

СвежеЦистанцхе тубулосамеснате стабљике су исечене на кришке различите дебљине (0,2 цм, 0,4 цм, 0,6 цм, 0,8 цм, 1,0 цм, 1,2 цм). Кришке су куване на пари различитог трајања (3 мин, 6 мин, 9 мин, 12 мин, 15 мин, 18 мин, 21 мин). Потом су материјали сушени под различитим температурним градијентима (амбијент 25 степени, 40 степени, 50 степени, 60 степени, 70 степени, 80 степени). Потпуно осушени узорци децокционих комада су уситњени и просејани кроз сито од 40-месх за накнадну квантификацију компоненти ХПЛЦ-а.

2.3 Одређивање садржаја актеозида и ехинакозида

Припрема раствора узорка: Прецизно одмерити 1,0 г праха прашкастог децоцтион-комада у запушену конусну тиквицу. Прецизно додати 100 мЛ 50% раствора метанола. Извршите намакање од 30 минута након чега следи ултразвучна екстракција од 40 минута. Након хлађења, допунити губитак тежине растварача са 50% метанола, равномерно измешати и оставити статичко таложење. Супернатант је филтриран кроз микропорозну мембрану од 0,22 μм за ХПЛЦ ињекцију.

Припрема референтног стандардног раствора: Прецизно одмерити одговарајућу количину референтних супстанци актеозида и ехинакозида, растворити са 50% метанола у волуметријским боцама, припремити стандардне растворе серијског градијента, филтрирати са филтерском мембраном од 0,22 μм.

Хроматографска поставка: ЦОСМОСИЛ Ц₁₈ аналитичка колона; систем мобилне фазе: мобилна фаза А: 0,1% водени раствор фосфорне киселине; мобилна фаза Б: ацетонитрил. Таласна дужина детекције је постављена на 330 нм; температура колоне 35 степени; проток 1 мЛ/мин. За квантитативно израчунавање садржаја актеозида и ехинакозида примењена је метода екстерног стандарда. Свеобухватни резултат евалуације=(садржај ехинакозида × 50 %) + (садржај актеозида × 50 %). Свеобухватни резултати су служили као композитни индикатор за процену перформанси услова обраде.

2.4 Експериментални дизајн Бок-Бехнкен Респонсе-Сурфаце

На основу једнофакторских експерименталних исхода, софтвер Десигн-Екперт 13.0 је коришћен за имплементацију Бок-Бехнкен трофакторног тростепеног експерименталног аранжмана. Дебљина пресека (Кс₁, цм), време обраде паром (Кс₂, мин), температура сушења (Кс₃, степен) изабрани су као независне варијабле. Садржај актеозида (И₁, %) и садржај ехинакозида (И₂, %) су вредности одговора. Изведено је седамнаест група експеримената. Нулти ниво за сваки фактор је изабран према оптималном параметру добијеном у једнофакторским тестовима. Након завршетка испитивања површине одговора, завршена је анализа варијансе модела, цртање површине 3Д одговора и предвиђање стања. Практични верификациони експерименти су спроведени након прилагођавања теоријских предвиђених параметара оперативним стварним вредностима производње.

2.5 Култура ћелија и припрема узорака

Сировина за децоцтион-пиеце је произведена у оптимизованим условима обраде. Биљни прах је екстрахован према горе поменутом протоколу за припрему узорака, концентрован ротационим испаравањем и осушен у вакууму да би се добио чврсти прах екстракта. Основни раствор је припремљен растварањем праха екстракта у ДМСО, даље разблажен комплетним ДМЕМ медијумом (који садржи 10% ФБС и 1% пеницилин-стрептомицина) за ћелијске експерименте; коначна радна концентрација ДМСО је контролисана испод 0,1 % (в/в). Макрофаги РАВ264.7 су култивисани у ДМЕМ комплетном медијуму под 37 степени, 5% ЦО₂ влажном окружењу инкубатора.

2.6 Тест цитотоксичности МТТ

РАВ264.7 ћелије су засејане на микроплоче са 96 јажица при густини ћелија од 8 × 10⁴ ћелија/мЛ. Експерименталне групе су укључивале контролну групу растварача (0,1% ДМСО медијум), групу ЛПС-модела (коначна концентрација ЛПС 1 уг/мЛ) и вишеструкуЦистанцхе тубулоса extract concentration groups (3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/mL). After 2‑h pre‑incubation with herbal sample, LPS (1 ug/mL final concentration) was supplemented to each group except solvent‑control group. Incubation continued for 24 h. Then MTT reagent (5 mg/mL) was added and incubated for 4 h. Discard supernatant, add 150 μL DMSO per well, shake at 37 ℃ for 15 min. Absorbance value at 490 nm wavelength was read on microplate reader, and cell‑survival rate was calculated. Safe working‑concentration range was determined for follow‑up functional tests.

2.7 Интрацелуларно мерење РОС

Макрофаги РАВ264.7 су инокулисани на плоче са шест јажица при густини од 4 × 10⁵ ћелија по бунарчићу. Након адхеренције ћелија, извршен је групни третман: група за контролу растварача, група ЛПС-модела и групе за третман екстракта ЦТ (12,5, 25, 50, 100 уг/мЛ). После 2-часовног претходног третмана са узорком, додат је ЛПС 1 уг/мЛ осим контролне групе растварача, инкубирајте 24 х. Интрацелуларни ниво РОС је детектован коришћењем методе пуњења флуоресцентном сондом према упутствима комплета. Интензитет флуоресценције је мерен читачем флуоресцентних микроплоча (ексцитација 488 нм, емисија 525 нм).

2.8 Детекција НО, МДА, СОД, ЦАТ, ЛДХ и ГСХ

Након одговарајућег третмана ћелија, супернатант ћелијске културе је сакупљен за мерење НО усвајањем Грисове реакције. Спојене ћелије су испране претходно охлађеним ПБС, лизиране на леду, супернатант ћелијског лизата је сакупљен након центрифугирања (10 000 р/мин, 4 степена, 5 мин). БЦА комплет је одредио укупну концентрацију протеина у сваком узорку. Садржај МДА, ГСХ и индикатора ензимске активности СОД, ЦАТ, ЛДХ је анализиран стриктно пратећи оперативне приручнике комплета.

2.9 ЕЛИСА одређивање проинфламаторних цитокина

Ћелије РАВ264.7 су добиле претходну обраду узорка и ЛПС стимулацију током укупно 16 сати. Супернатант ћелијске културе је сакупљен и центрифугиран. Концентрације ТНФ‑, ИЛ‑1, ИЛ‑6 у супернатанту су квантификоване помоћу комерцијалних ЕЛИСА комплета.

2.10 Вестерн-блот анализа

После 45 минута коинкубације ЛПС-а и узорка, ћелије РАВ264.7 су лизиране коришћењем РИПА пуфера за лизу допуњеног коктелом инхибитора протеазе-фосфатазе. Ћелијски лизат је центрифугиран на 10 000 р/мин на 4 степена током 5 минута. БЦА комплет квантифицира укупну концентрацију протеина. Протеини узорка (50 уг по траци) су денатурисани у металном купатилу од 100 степени током 5 минута. СДС-ПАГЕ гел електрофореза је одвојила циљне протеине, који су затим пребачени на ПВДФ мембране. Мембране су блокиране 1 х са 5% раствором ТБСТ обраног млека. Примарна антитела која циљају на п38, п-п38, АКТ, п-АКТ, ЈНК, п-ЈНК, НФ-κБ п65, п-НФ-κБ п65 и ГАПДХ су инкубирана преко ноћи на 4 степена. После испирања ТБСТ-а, одговарајућа секундарна антитела су инкубирана на собној температури 1 х. Након поновљеног прања, ЕЦЛ ултра-осетљиви хемилуминисцентни реагенс је примењен за снимање протеинских трака. Примењена је квантитативна анализа у скали сиве траке за процену релативног нивоа експресије протеина фосфорилације.

2.11 Статистичка анализа

Софтвер ГрапхПад Присм 8.0.2 је коришћен за статистичко израчунавање и цртање графикона. Резултати експерименталних квантитативних података су изражени као средња вредност ± стандардна девијација (\\(\\бар{к} \\пм с\\)). Једносмерна АНОВА праћена пост-хоц тестовима вишеструког поређења примењена је за међугрупно поређење. \\(П<0.05\) represented statistically significant difference; \(P<0.01\) highly significant difference; \(P<0.001\) extremely significant difference.

3. Експериментални резултати

3.1 Исходи експеримената са једним фактором

Slice thickness exerted obvious influence over the contents of acteoside and echinacoside. Slices at 0.2 cm thickness were easily over‑steamed, leading to thermal degradation of phenylethanoid‑glycoside active components. Excessively thick slices (>0,4 цм) омета унутрашње ослобађање супстанце, смањујући коначни садржај компоненти који се може детектовати. Под фиксним временом парења (10 мин) и температуром сушења (60 степени), дебљина кришке од 0,4 цм постигла је највишу свеобухватну процену.

Резултати трајања третмана паром: када је дебљина кришке фиксирана на 0,4 цм и температура сушења одржавана на 60 степени, недовољно време парења није могло у довољној мери да уништи структуру биљне ћелије тако да се активна једињења тешко растварају. Када је време парења премашило 6 минута, прекомерно парење је оштетило биљно ткиво и изазвало деградацију ехинакозида и актеозида. Стога је 6 минута прелиминарно идентификовано као пожељно трајање обраде паром.

За експерименте са градијентом температуре сушења у пећници: фиксирана је дебљина кришке 0,4 цм и време парења 6 мин. Садржај компоненти је растао са повећањем температуре сушења у одређеном опсегу. Када је температура сушења прешла 60 степени, високотемпературно термичко разлагање изазвало је значајан пад садржаја циљне супстанце. Стога је 60 степени изабрано као почетни оптимални услов температуре сушења за накнадну оптимизацију површине одзива.

3.2 Бок-Бехнкен Респонсе-Сурфаце Оптимизација и верификација

Седамнаест група Бок-Бехнкен експерименталних серија је завршено према матрици дизајна. Резултати анализе варијансе су показали да су регресиони модели за садржај актеозида и ехинакозида постигли статистичку значајност (\\(П<0.05\)). The lack‑of‑fit terms were non‑significant (\(P>0.05\)), demonstrating satisfactory model‑fitting quality. Coefficient of determination \(R^2\) values were close to 1, illustrating high consistency between predicted values and practical measured experimental data. Factor‑influence rank for acteoside yield: slice thickness > drying temperature > steaming time. Factor‑influence rank for echinacoside yield: steaming time > drying temperature >дебљина кришке.

Математичким прорачуном модела, теоријски оптимални параметри обраде били су: дебљина кришке 0,600 цм, време обраде паром 5,685 мин, температура сушења 57,009 степени. Узимајући у обзир стварну изводљивост индустријског рада, параметри су подешени на дебљину кришке 0,6 цм, време парења 6 минута, температура сушења 57 степени. Изведена су три паралелна експеримента валидације. Под овим практичним условима измерени садржај актеозида износио је 7,25 %, садржај ехинакозида је достигао 31,62 %. Одступање између измерених вредности и теоретског предвиђања остало је испод 5 %, што је доказало да је овај модел површине одговора био поуздан и применљив за вођење производње децокција у стварном свету.

3.3 Скрининг цитотоксичности оптимизоване обрадеЦистанцхе тубулосаЕкстракт у РАВ264.7 ћелијама

Резултати цитотоксичности МТТ открили су да концентрација екстракта у распону од 0-100 уг/мЛ није испољила очигледан токсични ефекат на макрофаге РАВ264.7, а чак је показала и благу тенденцију подстицања пролиферације ћелија. Када се концентрација третмана попела на 200 уг/мЛ и 400 уг/мЛ, стопа преживљавања ћелија се значајно смањила у поређењу са групом за контролу растварача, показујући цитотоксичност зависну од концентрације. Због тога су градијенти концентрације од 12,5 уг/мЛ, 25 уг/мЛ, 50 уг/мЛ, 100 уг/мЛ одабрани као сигурне радне концентрације за накнадне ћелијске тестове везане за оксидативни стрес и инфламацију.

3.4 Цистанцхе тубулосаЕкстрахујте смањени интрацелуларни ниво РОС у макрофагима стимулисаним ЛПС

У поређењу са контролном групом растварача, интрацелуларни РОС флуоресцентни интензитет групе ЛПС-модела се изузетно значајно повећао (\\(П<0.001\)), confirming successful construction of cellular oxidative‑damage model. After intervention with gradient‑concentration Цистанцхе тубулосаекстракта, интрацелуларна акумулација РОС је опала у зависности од дозе. Свака група за лечење леком показала је статистички значајно смањење РОС у односу на групу ЛПС-модела (\\(П<0.001\)). This finding demonstrated that processed‑herb extract could effectively restrain excess ROS generation under inflammatory stimulation.

3.5 Ефекти на садржај НО и МДА

НО служи као класични инфламаторни медијатор који ослобађају активирани макрофаги. МДА је златни стандард биомаркер који одражава оксидативну повреду липидне пероксидације. У поређењу са групом за контролу растварача, ЛПС стимулација је значајно повећала садржај НО и МДА у ћелијама РАВ264.7 (\\(П<0.001\)). Different dosages of Цистанцхе тубулосатретман екстрактом могао би значајно смањити концентрацију НО. За индикатор МДА: група од 12,5 уг/мЛ није довела до статистички значајног побољшања; Концентрационе групе од 25-100 уг/мЛ приметно су смањиле ниво МДА (\\(П<0.001\)). The results illustrated that extracts alleviated LPS‑triggered lipid‑peroxidation injury and inflammatory‑mediator over‑production.

3.6 Утицаји на биохемијске индикаторе повезане са антиоксидансима СОД, ЦАТ, ЛДХ, ГСХ

Након изазивања ЛПС-а, интрацелуларна СОД, ЦАТ, ЛДХ ензимска активност као и садржај ГСХ су нагло опали у односу на групу за контролу растварача (\\(П<0.001\)). Low‑dose (12.5 μg/mL) extract treatment could significantly raise SOD activity, but failed to generate prominent changes for CAT and LDH activity. Medium‑and‑high concentration groups (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) concentration‑dependently enhanced SOD, CAT, LDH enzyme activities and intracellular GSH content (\(P<0.001\)). It indicated that optimally‑processed Цистанцхе тубулосаЕкстракти децокција могу да поврате ћелијски ендогени антиоксидативни одбрамбени капацитет против оксидативних увреда изазваних ЛПС-ом.

3.7 Инхибиторни ефекат на ослобађање проинфламаторних цитокина ТНФ-, ИЛ-1, ИЛ-6

Резултати ЕЛИСА детекције су показали да ЛПС стимулација снажно подстиче лучење ТНФ-, ИЛ-1, ИЛ-6 из РАВ264.7 макрофага (\\(П<0.001\)). With the increase of Цистанцхе тубулосаконцентрација третмана екстракта, количина ослобађања ова три кључна проинфламаторна цитокина је прогресивно потиснута, представљајући јасну корелацију доза-одговор. Потврђено је да биљни екстракт испољава снажну антиинфламаторну функцију ограничавањем лучења проинфламаторних цитокина из активираних макрофага.

3.8 Уредба о фосфорилацији сигналног пута п38/АКТ/ЈНК/НФ‑κБ

Вестерн-блот експериментални подаци су показали да су односи п-п38/п38, п-АКТ/АКТ, п-ЈНК/ЈНК и п-НФ-κБ/НФ-κБ значајно повишени у групи ЛПС-модела у односу на групу растварача (\\П контролна група<0.001\)). Medium‑and‑high‑dosage Цистанцхе тубулосаинтервенција екстракције је значајно смањила п-п38/п38 и п-ЈНК/ЈНК однос (\\(П<0.001\)). All concentration‑treatment groups obviously down‑regulated p‑AKT/AKT and p‑NF‑κB/NF‑κB phosphorylation level (\(P<0.05\) or \(P<0.001\)). These observations proved that Цистанцхе тубулосаЕкстракт децоцтион-пиеце-а је ублажио оксидативно-инфламаторну повреду сузбијањем активације хиперфосфорилације п38/АКТ/ЈНК/НФ-κБ сигналне мреже.

4. Дискусија

Традиционални захтеви за обраду забележени у кинеској фармакопеји заЦистанцхе тубулосауглавном укључују уклањање нечистоћа, прање, влажење, резање и сушење, без специфицирања прецизних нумеричких параметара за дебљину кришке, трајање парења и температуру сушења. Нестандардна ручна обрада доводи до велике флуктуације квалитета комерцијалних производа од децоцтион-комада. Фенилетаноидни гликозиди (ехинакозид и актеозид) су термички лабилна биоактивна једињења. Неодговарајуће време загревања или температура ће изазвати хемијско разлагање и смањити лековиту вредност. Наши експерименти са једним фактором су открили да би и недовољно и прекомерно испаривање, као и превисока температура сушења, изазвали губитак циљних компоненти гликозида. Даљњом Бок-Бехнкен мултифакторском оптимизацијом добијени су практични параметри производње: дебљина кришке 0,6 цм, парење 6 мин, сушење 57 степени. Под овим условима, садржај актеозида и ехинакозида достигао је 7,25% и 31,62%, што је далеко премашило праг минималног квалитета фармакопеје. Овај оптимизовани протокол пружа изводљиве квантитативне техничке референце за стандардизовану индустријску прераду пореклом из СинђиангаЦистанцхе тубулоса.

Оксидативни стрес и запаљење су тесно повезани патолошки процеси. Вишак РОС индукује пероксидацију липида и ствара МДА, који даље активира урођене имуне макрофаге. Активирани макрофаги луче обиље НО и вишеструке проинфламаторне цитокине, који насупрот томе појачавају интрацелуларну производњу РОС-а, формирајући самопојачавајући оксидативно-инфламаторни зачарани круг. Природне антиоксидативне супстанце биљног порекла могу прекинути ову патолошку петљу подизањем ендогеног антиоксидативног ензимског система и обуздавањем преноса инфламаторног сигнала. У овој ин-витро студији, оптимално обрађенојЦистанцхе тубулосаЕкстракти децоцтион-комада снизили су нивое РОС, НО и МДА, док су појачали активности СОД, ЦАТ, ЛДХ и садржај ГСХ у макрофагима РАВ264.7 стимулисаним ЛПС. Истовремено, инхибирао је лучење проинфламаторних цитокина ТНФ-, ИЛ-1, ИЛ-6, показујући интегрисани антиоксидативни стрес и антиинфламаторни капацитет.

Молекули породице протеин-киназе активиране митогеном п38, ЈНК заједно са АКТ и НФ-κБ сачињавају централно чвориште за трансдукцију сигнала које посредује инфламаторно-оксидативне одговоре макрофага. Након ЛПС стимулације, узводни сигнал покреће активацију фосфорилације п38, ЈНК и АКТ, што секвенцијално промовише фосфорилацију НФ-κБ п65 подјединице и нуклеарну транслокацију. Активирани НФ‑κБ делује као транскрипциони фактор и покреће транскрипцију великих серија проинфламаторних цитокина и гена повезаних са оксидативним стресом. Наши Вестерн-блот резултати су то показалиЦистанцхе тубулосаекстракт би могао да потисне фосфорилацију п38, ЈНК, АКТ и НФ‑κБ п65. Стога закључујемо да се његова антиоксидативни стрес и антиинфламаторна биоактивност постиже, барем делимично, блокирањем прекомерне активације п38/АКТ/ЈНК/НФ-κБ сигналне осе.

У оквиру тренутног истраживања постоји неколико ограничења. Све функционалне верификације су ограничене на ниво културе ћелија ин-витро. Потребни су даљи експерименти ин-виво на животињском моделу да би се верификовале ин-виво фармакодинамичке перформансе оптимизованих комада декокције. Поред тога, ова студија је усвојила укупни мешани екстракт из комада децокције, тако да не можемо разликовати појединачни допринос ехинакозида, актеозида и других мањих секундарних метаболита. Накнадно истраживање може да изолује мономерна једињења како би се упоредила одговарајућа потенција антиоксидативног стреса и спровела испитивање ефекта компатибилности. Упркос томе, наш садашњи рад и даље пружа практичне параметре технологије обраде и прелиминарне механичке доказе за развојЦистанцхе тубулоса‑сродни производи за здравствену негу.

5. Закључак

У закључку, модернизовани ток обраде оптимизован Бок-Бехнкен методологијом одговорне површине (дебљина пресека 0,6 цм, парење 6 мин, температура сушења 57 степени) може значајно повећати садржај актеозида и ехинакозида уЦистанцхе тубулосадецоцтион комада. Екстракти припремљени од ових оптимално обрађених биљних кришки показују истакнути антиоксидативни стрес и антиинфламаторне ефекте против оштећења макрофага РАВ264.7 изазваног ЛПС-ом. Основни механизам је у корелацији са обнављањем интрацелуларног антиоксидантно-одбрамбеног система и инхибицијом прекомерне активације п38/АКТ/ЈНК/НФ‑κБ инфламаторног сигналног пута. Ова студија пружа солидну експерименталну основу за стандардизовану индустријску производњу и функционално-храну експлоатацијуЦистанцхе тубулосаресурси.

Референце

Лин Ј, Иу Х, Зхао И, ет ал. Екстракција ехинакозида изЦистанцхе тубулоса(Сцхенк) Р. Вигхт и истраживање његовог заштитног ефекта на оштећење јетре код пацова са сепсом. Фоод Сци Тецхнол, 2023, 43:е010523.

Гуо Ј, Танг С, Миао И, ет ал. Анти-инфламаторни ефекти лигнанских гликозида изЦистанцхе тубулосапотиче на ЛПС/ИФН-индукованим ћелијама макрофага РАВ264.7 преко ПИ3К/АКТ пута. Цуррент Пхармацеутицал Биотецхнологи, 2021, 22(10):1380‑1391.

Рани В, Дееп Г, Сингх РК, ет ал. Оксидативни стрес и метаболички поремећаји: Патогенеза и терапијске стратегије. Науке о животу, 2016, 148:183‑193.

Парк ЈХ, Ким ЈХ, Јанг С И. Анти-инфламаторно дејство дисе-неционил цис-келактона у ЛПС-стимулисаним ћелијама РАВ264.7 и његова инхибиторна активност на растворљиву епоксид хидролазу. Хелиион, 2023,9(10):е21032.

Цхунг ИЦ, Сонг С Ј. Исобавацхин ублажава инфламаторне одговоре изазване липополисахаридом у макрофагима сузбијањем МАПК и НФ-κБ сигналних путева. Јоурнал оф Етхнопхармацологи, 2024,321:117501.

He X, Li Y, Deng B. The PI3K/AKT signalling pathway in inflammation, cell death and glial scar formation after traumatic spinal‑cord injury. Cell Proliferation, 2022,55(9):e13275.