Абстрацт

Цистанцхе тубулосаје драгоцена тоник биљка која се широко примењује у традиционалној кинеској медицини. Фенилетаноидни гликозиди представљени ехинакозидом и актеозидом су његове основне биоактивне супстанце. Ово истраживање има за циљ да оптимизује савремене параметре обраде заЦистанцхе тубулосакомадићи декокције за побољшање приноса ехинакозида и актеозида и даље истраживање његовог антиоксидативног стреса и антиинфламаторног механизма на ћелијском нивоу.

Експерименти са једним фактором су спроведени, након чега је уследила оптимизација површине одзива Бок-Бехнкена са дебљином пресека, временом парења и температуром сушења као факторима утицаја. Течна хроматографија високих перформанси (ХПЛЦ) је усвојена да детектује садржај два једињења маркера. Модел повреде макрофага РАВ264.7 изазван ЛПС-ом је конструисан да процени фармаколошке активности. Одређене су реактивне врсте кисеоника (РОС), азот оксид (НО), малондиалдехид (МДА), активности антиоксидативних ензима укључујући СОД, ЦАТ, ЛДХ и садржај глутатиона (ГСХ). ЕЛИСА је коришћена за тестирање нивоа секреције проинфламаторних цитокина ТНФ‑, ИЛ‑1 и ИЛ‑6. Вестерн блот тест је изведен да би се анализирао статус фосфорилације кључних протеина у сигналном путу п38/АКТ/ЈНК/НФ‑κБ.

Оптимални услови обраде били су дебљина кришке од 0,6 цм, време парења од 6 минута и температура сушења од 57 степени. Под овим условима садржај актеозида је достигао 7,25 %, а ехинакозида 31,62 %. Екстракти из оптимизованих комада децокције могу значајно смањити прекомерну производњу интрацелуларних РОС, НО и МДА у ћелијама РАВ264.7 стимулисаним ЛПС. Појачао је активности СОД, ЦАТ, ЛДХ и повећао интрацелуларни ниво ГСХ, док је у међувремену значајно инхибирао ослобађање ТНФ-, ИЛ-1 и ИЛ-6. Резултати Вестерн-блот-а су показали да је екстракт смањио однос фосфорилације п-п38/п38, п-АКТ/АКТ, п-ЈНК/ЈНК и п-НФ-κБ/НФ-κБ.

Оптимизована технологија обраде паром и сушењем може ефикасно повећати стопу опоравка главних фенилетаноидних гликозидаЦистанцхе тубулоса. Комадићи декокције испољавају антиоксидативне и антиинфламаторне ефекте против оштећења ћелија изазваних ЛПС инхибирањем сигналног пута п38/АКТ/ЈНК/НФ‑κБ. Ова студија даје практичне техничке параметре за стандардизовану индустријску прерадуЦистанцхе тубулоса, и нуди експерименталне доказе за развој функционалне хране и нутрацеутских производа добијених из овог биљног ресурса.

Кључне речи: Цистанцхе тубулоса; технологија обраде децоцтион-комада; ацтеосиде; ехинакозид; антиоксидативни стрес; РАВ264.7 макрофаг; п38/АКТ/ЈНК/НФ‑κБ пут

1. Увод

Цистанцхе тубулоса(Сцхенк) Вајт припада породици Оробанцхацеае, а њен лековити део је осушена месната стабљика са љускавим листовима. У Кини се ова биљка углавном сади у сушним регионима северозапада, са највећом површином за садњу у јужном Синђијангу. Као добро познати биљни тоник, делује тако да тонизира бубреге-јанг, допуни суштину и крв и влаже црева како би ублажио затвор. Клинички се користи за лечење дефицита бубрега-јанга, инсуфицијенције есенције-крви, неплодности, болова и слабости у струку и коленима, као и затвор сувоће црева.

Фенилетаноид гликозиди, углавном ехинакозид и актеозид, су примарне активне компонентеЦистанцхе тубулоса. Према захтевима кинеске фармакопеје, укупан садржај ехинакозида и актеозида у квалификованим медицинским сировинама не сме бити мањи од 1,50 %, што служи као критични индикатор за процену квалитета. Традиционални приступи обради заЦистанцхе тубулосауглавном усвајају методе намакања-квашења, сечења-сушења или кухања вина на пари. Велики број студија се фокусира на побољшање приноса активних компоненти, док истраживања која комбинују оптимизацију технологије обраде са верификацијом биолошке активности остају недовољна.

Оксидативни стрес делује као уобичајена патолошка основа за више метаболичких и инфламаторних болести. Постојећа истраживања су доказала да се укупни гликозиди екстрахују изЦистанцхе тубулосаможе потиснути инфламаторни одговор и активирати Нрф2/ХО‑1 пут за ублажавање оштећења јетре код животиња са сепсом. Фракције лигнан гликозида из ове биљке могу ублажити упалу макрофага регулацијом ПИ3К/АКТ сигнализације. Ипак, фармаколошка својства савремених прерађених децокција и њихов основни молекуларни механизам и даље захтевају даље истраживање.

У овој студији, Бок-Бехнкенов дизајн површине одзива примењен је на основу једнофакторских тестова, узимајући дебљину кришке, време парења и температуру сушења као варијабле за оптимизацију радног тока обраде. Након добијања оптималних техничких параметара, успостављен је модел ћелије РАВ264.7 изазваног ЛПС-ом са оксидативним оштећењем како би се проценио антиоксидативни стрес и антиинфламаторни капацитет и сецирао релевантан сигнални механизам. Овај рад има за циљ да обезбеди стабилне и оперативне параметре обраде за пилотску производњу и постави експерименталну основу за свеобухватно коришћењеЦистанцхе тубулосаресурси.

2. Материјали и методе

2.1 Биљни материјал, реагенси и инструменти

Свеже меснате стабљикеЦистанцхе тубулосаубране су у јесен из Хотана, Синђианг. РАВ264.7 ћелије леукемије моноцита-макрофага миша купљене су од Процелл Лифе Сциенце & Тецхнологи Цо., Лтд (Вухан, Кина).

ХПЛЦ ацетонитрил и метанол су добијени од компаније Мерцк. Референтне стандарде за ехинакозид (већи или једнаки 98%) и актеозид (већи или једнаки 98%) обезбедио је Институт за метрологију Северне Веије у Пекингу. Диметил сулфоксид (ДМСО) је купљен од Сигма-Алдрицх. ДМЕМ медијум са високим садржајем глукозе, фетални говеђи серум (ФБС), раствор двоструких антитела пеницилин-стрептомицина, комплет за квантификацију БЦА протеина, комплети за тестове за НО, МДА, СОД, ЦАТ, ГСХ и ЛДХ, липополисахарид (ЛПС), МТТ реагенси и комерцијални производи инфлтокинеса.

Експериментални инструменти су укључивали течни хроматограф високих перформанси Схимадзу, ротациони испаривач, млевач кинеског биља, термостатску пећ за високо сушење, парни штедњак, читач микроплоча пуне таласне дужине, електронску аналитичку вагу, расхлађену центрифугу, биосигурносни микроскоп у оптичком ормарићу.

2.2 Експеримент обраде са једним фактором

СвежеЦистанцхе тубулосамеснате стабљике су исечене на кришке дебљине 0,2 цм, 0,4 цм, 0,6 цм, 0,8 цм, 1,0 цм и 1,2 цм. Кришке су парене 3 мин, 6 мин, 9 мин, 12 мин, 15 мин, 18 мин и 21 мин, респективно, и сушене под различитим температурним градијентима укључујући собну температуру (25 степени), 40 степени, 50 степени, 60 степени, 70 степени и 80 степени. Осушени узорци децокционог комада су уситњени и просејани кроз сито од 40-месх ради накнадне детекције. За свеобухватну процену усвојена је композитна формула за бодовање: Композитни резултат=садржај ехинакозида × 50 % + садржај актеозида × 50 %.

2.3 ХПЛЦ одређивање актеозида и ехинакозида

Припрема раствора узорка: тачно измерити 1,0 г узорка праха, додати 100 мЛ 50% раствора метанола. После 30-минутног намакања, ултразвучна екстракција је изведена 40 мин. Губитак тежине је допуњен са 50% метанола након хлађења. Супернатант је филтриран преко 0,22 μм микропорозне мембране пре ХПЛЦ ињекције.

Мешани референтно-стандардни раствор актеозида и ехинакозида је припремљен са 50% метанола и разблажен у серијске концентрације за цртање стандардне криве. Услови хроматографије: ЦОСМОСИЛ Ц₁₈ хроматографска колона; систем мобилне фазе се састојао од 0,1% воденог раствора фосфорне киселине (А) и ацетонитрила (Б); таласна дужина детекције је постављена на 330 нм; температура колоне 35 степени; проток 1 мЛ/мин. За квантитативни прорачун циљних једињења коришћена је метода екстерног стандарда.

2.4 Експериментални дизајн Бок-Бехнкен Респонсе-површине

Према експерименталним резултатима са једним фактором, дебљина пресека (Кс₁), време парења (Кс₂) и температура сушења (Кс₃) су изабрани као независне варијабле. Садржај актеозида (И₁, %) и садржај ехинакозида (И₂, %) служили су као вредности одговора. Софтвер Десигн‑Екперт 13.0 је коришћен за успостављање трофакторске тростепене Бок‑Бехнкен експерименталне шеме са укупно 17 група тестова. Подешавање модела, анализа варијансе и предвиђање параметара завршени су софтвером. Практични верификациони експерименти су изведени у три примерка након прилагођавања теоретских оптималних параметара како би одговарали стварном производном погону.

2.5 Култура ћелија и припрема узорака

Узорак децокционог комада добијен под оптимизованим условима обраде припремљен је у прах екстракта. Прашак је растворен у ДМСО и даље разблажен комплетним ДМЕМ медијумом који садржи 10% ФБС и 1% пеницилин-стрептомицина за експерименте са ћелијама. Ћелије РАВ264.7 су култивисане у влажном инкубатору на 37 степени са 5% ЦО₂.

2.6 МТТ тест за виталност ћелија

Ћелијска суспензија је инокулисана у плоче са 96 јажица при густини ћелија од 8 × 10⁴ ћелија/мЛ. Групе су постављене као контролна група растварача (0,1% ДМСО), група ЛПС модела (1 уг/мЛ ЛПС) и више концентрационих групаЦистанцхе тубулосаекстракт (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 уг/мЛ). После 2-часовне пре-инкубације узорака, додат је ЛПС са коначном концентрацијом од 1 уг/мЛ осим контролних бунара за раствараче и инкубиран још 24 х. МТТ раствор (5 мг/мЛ) је додат током 4-часовне реакције. После уклањања супернатанта, додат је ДМСО да би се растворио кристал формазана. Вредност апсорпције на 490 нм детектована је читачем микроплоче да би се израчунала виталност ћелија. Опсег безбедне концентрације је изабран за пратеће функционалне тестове.

2.7 Интрацелуларно мерење РОС

Ћелије РАВ264.7 су засејане у плоче са 6 бунарчића при густини од 4 × 10⁵ ћелија по бунарчићу. Након приањања на зид, ћелије су претходно третиране концентрацијом градијентаЦистанцхе тубулосаекстракт (12,5, 25, 50, 100 уг/мЛ) током 2 х, затим стимулисан са 1 уг/мЛ ЛПС током 24 х. Интрацелуларни ниво РОС је детектован комплетом реагенса флуоресцентне сонде. Интензитет флуоресценције је забележен при таласној дужини ексцитације 488 нм и таласној дужини емисије 525 нм.

2.8 Детекција НО, МДА, СОД, ЦАТ, ЛДХ и ГСХ

Супернатант ћелијске културе је сакупљен да би се открио садржај НО помоћу Гриессове методе. Ћелије су испране претходно охлађеним ПБС и лизиране на леду. Ћелијски лизат је центрифугиран на 10 000 рпм испод 4 степена током 5 минута да би се добио интрацелуларни супернатант. Садржај МДА, активности ензима нивоа СОД, ЦАТ, ЛДХ и ГСХ мерени су стриктно у складу са спецификацијама комплета. БЦА метода је примењена за нормализацију укупног протеина.

2.9 ЕЛИСА детекција проинфламаторних цитокина

Ћелије РАВ264.7 су третиране узорком и ЛПС током 16 х. Супернатант културе је сакупљен и центрифугиран на 10 000 рпм током 10 мин. Концентрације секреције ТНФ‑, ИЛ‑1 и ИЛ‑6 су квантификоване помоћу ЕЛИСА комплета.

2.10 Вестерн блот анализа

После 45-минутне интервенције узорака и ЛПС-а, укупни ћелијски протеин је екстрахован коришћењем РИПА пуфера за лизу. Концентрација протеина је квантификована помоћу БЦА комплета. Једнака количина узорка протеина (50 уг за сваку траку) је денатурисана, одвојена СДС-ПАГЕ електрофорезом и пребачена на ПВДФ мембрану. Мембрана је блокирана 5% раствором ТБСТ обраног млека током 1 х, а затим инкубирана са примарним антителима преко ноћи на 4 степена. После поновљеног испирања са ТБСТ, секундарно антитело је инкубирано на собној температури 1 х. Циљне протеинске траке су визуелизоване помоћу ЕЦЛ хемилуминисценционог реагенса. Спроведена је анализа скале сиве траке да би се израчунао однос фосфорилациони протеин/укупни протеин.

2.11 Статистичка анализа

За цртање графикона и статистичку анализу коришћен је софтвер ГрапхПад Присм 8.0.2. Једносмерна АНОВА и т-тест су усвојени за поређење података.P < 0.05 represented statistically significant difference; P < 0.01 and P < 0.001 stood for higher significance. All experimental data were expressed as mean ± standard deviation (\(\bar{x}\pm s\)).

3. Резултати

3.1 Експериментални резултати са једним фактором

Дебљина пресека је имала значајан утицај на садржај циљних гликозида. Кришке дебљине 0,2 цм лако су се препариле, што је изазвало термичко разлагање активних састојака. Предебеле кришке ометале су ослобађање унутрашњих активних супстанци. Када је време парења фиксирано на 10 минута и температура сушења на 60 степени, 0,4 цм је био оптимални параметар дебљине пресека у једнофакторском скринингу.

Недовољно време парења није могло у потпуности да уништи структуру биљних ћелија и довело је до ниског приноса гликозида. Када је време парења премашило 6 минута, дошло је до дезинтеграције ткива и деградације ехинакозида као и актеозида. Под фиксном дебљином кришке од 0,4 цм и температуром сушења од 60 степени, 6 минута је био најбољи услов за време парења.

У оквиру одређеног опсега, садржај фенилетаноидних гликозида је растао заједно са повећањем температуре сушења, али је деградација наступила када је температура прешла 60 степени. Са дебљином пресека од 0,4 цм и временом парења од 6 минута, 60 степени је показао најбоље свеобухватне перформансе у једнофакторском скринингу.

3.2 Тест оптимизације и верификације површине одзива

Анализа варијансе је показала да су регресиони модели за садржај актеозида и ехинакозида значајни (P < 0.05, P < 0.01). The lack‑of‑fit term was non‑significant (P >0,05), што указује на добар степен уклапања модела. Коефицијент детерминације Р² био је близу 1, што је доказало високу корелацију између предвиђене вредности и стварних експерименталних података.

Редослед утицаја фактора за садржај актеозида била је дебљина кришке > температура сушења > време парења. За садржај ехинакозида, редослед је био време парења > температура сушења > дебљина кришке.

Софтверски израчунати теоретски оптимални параметри су били дебљина реза 0,600 цм, време парења 5,685 мин и температура сушења 57,009 степени. Узимајући у обзир практичне услове производње, параметри су подешени на дебљину реза 0,6 цм, време парења 6 мин и температуру сушења 57 степени. Три групе паралелних експеримената верификације добиле су садржај актеозида од 7,25 % и садржај ехинакозида од 31,62 %. Одступање између практичне вредности и теоријске предвиђене вредности износило је 3,89 % и 4,92 %, респективно, што је показало поузданост овог модела одзив-површине.

3.3 Резултат скрининга виталности ћелије

У опсегу концентрације од 0-100 уг/мЛ,Цистанцхе тубулосаекстракт децоцтион-комада није имао очигледну цитотоксичност на ћелијама РАВ264.7 и показао је благи ефекат подстицања пролиферације. Када је концентрација достигла 200 уг/мЛ и више, виталност ћелија се значајно смањила. Стога су 12,5 уг/мЛ, 25 уг/мЛ, 50 уг/мЛ и 100 уг/мЛ одабране као радне концентрације за наредне експерименте са ћелијама.

3.4 Утицај на интрацелуларни ниво РОС

У поређењу са контролном групом за раствараче, група ЛПС модела је показала изузетно повишен интензитет флуоресценције унутарћелијске РОС (P < 0.001), proving the successful establishment of oxidative‑stress injury model. Pretreatment of Цистанцхе тубулосаекстракт смањује прекомерну акумулацију РОС на начин који зависи од дозе (P < 0.001 versus model group).

3.5 Уредба о НО, МДА и индикаторима везаним за антиоксидансе

ЛПС стимулација је изазвала оштар пораст садржаја НО и МДА у ћелијама РАВ264.7. У поређењу са групом ЛПС модела, интервенција екстракта је значајно снизила ниво НО са тенденцијом зависне од дозе. 12.5 уг/мЛ екстракт није произвео очигледан ефекат на садржај МДА, док је екстракт од 25‑100 уг/мЛ приметно смањио концентрацију МДА (P < 0.001).

После третмана ЛПС, активности СОД, ЦАТ, ЛДХ и интрацелуларног ГСХ садржаја су се значајно смањиле. 12.5 уг/мЛ екстракт би могао да побољша активност СОД без побољшања активности ЦАТ и ЛДХ. Екстракт у концентрацији од 25‑100 уг/мЛ значајно је повећао активности ензима СОД, ЦАТ, ЛДХ и садржај ГСХ на начин који зависи од концентрације.

3.6 Инхибицијски ефекат на лучење проинфламаторних цитокина

ЛПС стимулација је покренула масовно ослобађање ТНФ-, ИЛ-1 и ИЛ-6 у РАВ264.7 макрофагима.Цистанцхе тубулосаПредтретман екстракта децоцтион-комада значајно је потиснуо лучење горе поменута три проинфламаторна цитокина (P < 0.001), presenting prominent dose‑dependent anti‑inflammatory property.

3.7 Модулација на п38/АКТ/ЈНК/НФ‑κБ сигналном путу

У поређењу са групом за контролу растварача, ЛПС интервенција је повећала однос фосфорилације п‑п38/п38, п‑АКТ/АКТ, п‑ЈНК/ЈНК и п‑НФ‑κБ/НФ‑κБ. Групе екстраката са средњим и високим дозама значајно су смањиле однос п-п38/п38 и п-ЈНК/ЈНК. Све концентрационе групе су смањиле ниво п-АКТ/АКТ и п-НФ-κБ/НФ-κБ (P < 0.05 or P < 0.001). Results illustrated that optimized Цистанцхе тубулосаЕкстракт децоцтион-пиеце-а је обуздао активацију п38/АКТ/ЈНК/НФ-κБ сигналног пута инхибирањем фосфорилације протеина.

4. Дискусија

Тренутни захтеви обраде заЦистанцхе тубулосазабележени у кинеској фармакопеји описују само квалитативне оперативне кораке без прецизних квантитативних параметара. Претходна истраживања су показала да би различите методе прераде изазвале велике разлике у хемијском саставу и фармаколошкој активности између сировог и прерађеног.Цистанцхе тубулосаузорци. Прерађени производи показују боље антиоксидативне и имунорегулаторне перформансе у поређењу са сировинама.

У овом истраживању, модерна обрада паром и сушењем оптимизована методологијом површине одговора дала је много већи принос ехинакозида и актеозида од многих традиционалних техника обраде. То сугерише да прецизна контрола дебљине кришке, трајања парења и температуре сушења може ефикасно задржати и побољшати садржај фенилетаноид-гликозида уЦистанцхе тубулоса.

Оксидативни стрес и запаљење су уско повезани патолошки процеси. Прекомерни РОС доводи до пероксидације липида и акумулације МДА; у међувремену активира низводне инфламаторне каскаде и промовише стварање НО и вишеструких проинфламаторних цитокина. Инфламаторни медијатори додатно убрзавају производњу РОС-а и формирају зачарани патолошки циклус. Наши ћелијски експериментални резултати су показали да је то оптимизованоЦистанцхе тубулосаЕкстракт децокционог комада би могао да елиминише сувишне РОС, смањи маркере оксидативног оштећења НО и МДА, обнови активност антиоксидативног ензимског система представљеног СОД, ЦАТ, ЛДХ и допуни интрацелуларни ГСХ, као и да инхибира ослобађање проинфламаторних цитокина са очигледним односом доза-ефекат.

п38, ЈНК који припада породици МАПК и оса АКТ-НФ-κБ су централна чворишта за трансдукцију сигнала која посредују оксидативно-инфламаторни одговор макрофага. ЛПС стимулација промовише фосфорилацију п38, ЈНК и АКТ, даље активира НФ‑κБ и индукује транскрипцију бројних проинфламаторних гена. Подаци Вестерн-блота су то открилиЦистанцхе тубулосаЕкстракт децоцтион-пиеце-а је блокирао активацију фосфорилације п38, ЈНК, АКТ и НФ‑κБ. Закључује се да ехинакозид и актеозид са високим садржајем из оптимизоване обраде заједнички доприносе сузбијању сигналне каскаде п38/АКТ/ЈНК/НФ‑κБ, како би се ублажио оксидативни стрес изазван ЛПС и инфламаторне повреде у РАВмацропх.7.

Још увек постоје ограничења у овој студији. Све фармаколошке евалуације су завршене на ин-витро ћелијском моделу. Потребни су даљи експерименти на нивоу животиња да би се потврдила ин виво ефикасност и метаболичке карактеристике прерађенихЦистанцхе тубулосадецоцтион комада.

У закључку, ова студија је утврдила мерљиву и скалабилну модерну технологију обраде заЦистанцхе тубулосадецоцтион комада. Под параметрима обраде дебљине кришке 0,6 цм, времена парења 6 мин и температуре сушења 57 степени, садржај главних фенилетаноидних гликозида је значајно побољшан. Прерађени комадићи декокције могу ублажити оксидативни стрес и запаљенско оштећење у макрофагима РАВ264.7 стимулисаним ЛПС-ом инхибирањем сигналног пута п38/АКТ/ЈНК/НФ-κБ. Ово истраживање пружа практичну техничку референцу за индустријализовану производњу и нуди експерименталну основу за развој функционалне хране и производа дијететских суплемената поријеклом из СинђиангаЦистанцхе тубулоса.

Признања

Овај рад је подржан од стране Пројекта култивације капацитета за иновације у области науке и технологије младих Синђанг академије пољопривредних наука (кјнкк‑2022022) и „Тианцхи докторског програма“ (2021.) у Синђангу.

Референце

[1] Лин Ј, Иу Х, Зхао И, ет ал. Екстракција ехинакозида изЦистанцхе тубулосаи истраживање његовог заштитног ефекта на оштећење јетре код пацова са сепсом.Наука о храни и технологија. 2023;43:e010523.

[2] Гуо Ј, Танг С, Миао И, ет ал. Анти-инфламаторни ефекти лигнанских гликозида изЦистанцхе тубулосапотиче на ћелије макрофага РАВ264.7 изазване ЛПС/ИФН-ом преко ПИ3К/АКТ пута.Цуррент Пхармацеутицал Биотецхнологи. 2021;22(10):1380‑1391.

[3] Рани В, Дееп Г, Сингх РК, ет ал. Оксидативни стрес и метаболички поремећаји: Патогенеза и терапијске стратегије.Лифе Сциенцес. 2016;148:183‑193.

[4] Мартинез-де-Тода И, Цеприан Н, Диаз-де-Цастро Е. Улога старења окси-инфламације у патофизиологији човека.Ћелије. 2021;10(11):2974.

[5] Цхунг ИЦ, Сонг СЈ, Лее А, ет ал. Исобавацхин ублажава инфламаторне одговоре изазване липополисахаридима у макрофагима и зебри тако што потискује МАПК и НФ-κБ сигналне путеве.Часопис за етнофармакологију. 2024;321:117501.