Оптогенетско фреквентно скрембовање хипокампалних тета осцилација дисоцира преузимање радне меморије из хипокампалних просторно-временских кодова, 3. део

Оптогенетски пејсинг неурона МС доводи до нефизиолошкетета синхронизације

Изненађујуће, оптогенетске стимулације од 8 Хз које су повезане са пејсингом тета осцилација довеле су до смањених перформанси када се примењују током кодирања или преузимања епизодне меморије у задатку НПОР, као и проналажења просторне радне меморије у ДНМТСтаску. Да бисмо даље разумели ефекте тета пејсинга на хипокампалфизиологију, анализирали смо фазно закључавање тета осцилације пре и током оптогенетских стимулација од 8 Хз (додатна слика 7а) и открили да је таква стимулација довела до повећане синхронизације фаза кроз епохе стимулације (додатна слика 7б). Штавише, анализирали смо унакрсну корелацију тета осцилација преко дорзалног ЦА1 (~ 1 мм растојање између електрода дуж септотемпоралне осе (додатна слика 7ц) и открили да су тета ритмови пејсинга на 8 Хз довели до повећане унакрсне корелације између те две електроде ( Додатна слика 7д).

Генетика је наука која проучава генетско наслеђе и варијације, а памћење је аспект који изазива велику забринутост. Дакле, какве везе генетика има са памћењем? Овај чланак ће истражити питања везана за памћење из генетске перспективе.

Пре свега, знамо да су генетски гени основа физичког и интелектуалног развоја човека, а да ли су ти гени супериорнији утицаће на памћење људи. Најновија истраживања показују да на коефицијент интелигенције и памћење људи утичу генетски фактори. Истраживања показују да генетски гени играју кључну улогу у интелигенцији и памћењу. Због тога се неки људи рађају са снажнијим памћењем, док други морају напорно да раде и тренирају како би побољшали своје памћење.

Друго, фактори околине су такође важни фактори у развоју памћења. Не само да нам је потребна подршка генетских гена, већ и да побољшамо своје памћење кроз научну обуку и добре животне навике. На пример, можемо инсистирати на свакодневном вежбању, довољном спавању, поштовању принципа усклађивања оброка, итд., што може помоћи да побољшамо функцију нашег мозга и памћење.

Коначно, обични људи, не пренаглашавају утицај генетских фактора на развој памћења. Пошто генетски фактори нису апсолутни, памћење и интелигенција људи се и даље могу побољшати побољшањем својих напора и обуке. Увек треба да одржавамо позитиван и континуиран став учења, и да стално истражујемо и развијамо свој потенцијал памћења. Верујем да само тако можемо постати паметнији и имати већи осећај постигнућа. Да сумирамо, однос између генетике и памћења је веома близак, али не треба пренаглашавати генетске факторе, већ треба стално да унапређујемо своје памћење и интелигенцију кроз самоусавршавање и тренинг.

Види се да треба побољшати своје памћење. Цистанцхе десертицола може значајно побољшати памћење јер је цистанцхе десертицола традиционални кинески медицински материјал са многим јединственим ефектима, од којих је једно побољшање памћења. Ефикасност млевеног меса потиче од различитих активних састојака које садржи, укључујући киселину, полисахариде, флавоноиде, итд. Ови састојци могу да унапреде здравље мозга на различите начине.

Кликните на сазнајте 10 начина за побољшање меморије

Дискусија

Within the septohippocampal system, the exact causal relationships between (1) MS activity, (2) hippocampal oscillations, (3) hippocampal neuron activity, and (4) behavior, including memory, remain an active area of research. In particular, whether and how the MS supports encoding of place and time in the hippocampus, as well as its specific contribution to memory function, remain unclear. Here, we leveraged more recent techniques that allowed us to record >1000 неурона током извођења оптогенетске стимулације МС неурона са под-секундарном резолуцијом за контролу тета ритмова и процену њихове улоге у физиологији хипокампуса и памћењу. Оно што је важно, коришћењем ексцитаторног опсина и кодираних или 8 Хз стимулација, били смо у могућности да доследно и снажно укинемо или убрзамо хипокампални тета, респективно.

У поређењу са МС инхибицијом коришћењем било инхибиторног опсина или фармаколошких једињења (нпр. мусцимола), наш приступ омогућава поређење два супротна стања унутар субјекта (пејсинг наспрам укинутогтхета) уз одржавање нивоа активности у МС-ПВ ћелијама. Комбиновали смо задатак линеарног праћења који нам је, заједно са теоретским приступима, омогућио да раздвојимо просторне и временске хипокампалне кодове. Овај метод ублажава потребу за произвољним праговима, омогућавајући стандардизован приступ анализи имиџинга калцијума. Док је велики део ЦА1 пирамидалних неурона изражавао мешавину просторно-временских кодова, фокусирали смо наше анализе на неуроне омамљене посебно на место, време или пређену удаљеност.

Док је просторно кодирање опширно истраживано у ЦА1, временски кодови и кодови удаљености су недавно добили више интересовања. Темпорални28,35–37 и кодови удаљености37 су екстраховани стезањем визуелнопросторних знакова или извучени аналитички коришћењем генерализованих линеарних модела у парадигмама виртуелне реалности26,27,38. Овде предлажемо приступ да се раздвоје просторни, временски и даљински кодови коришћењем теоретског приступа информација који, заједно са нашим задатком алтернације, омогућава анализу просторно-темпора и мултиплексираних кодова у стварном свету код животиња које се слободно крећу. Велика количина ЦА1 пирамидалних неурона кодира мултиплексиране информације о локацији, удаљености и времену као што је раније објављено26,27,38 поред сигнала самопокретања као што су убрзање, брзина и оријентација60.

Открили смо да су фреквентно скрембовање и оптогенетске стимулације од 8 Хз драстично укинуле или убрзале тета ритмове, респективно, и довеле до смањене укупне активности у субпопулацији пирамидалних ћелија ЦА1, а да притом нису изазвале значајне промене у ћелијској активности на месту, слично претходним извештајима који су користили било фармаколошку инхибицију36, 46,47 или оптогенетски9,48 пејсинг МС или септалних улаза у хипокампус. Пошто је познато да су МС неурони примарни покретачи хипокампалних осцилација, очекивали смо да ће МС стимулација бити повезана са поремећеном активношћу ћелија у времену или удаљености у условима смањеног тета ритма, али није било промена када је тхета укинут или пејсинг. Поред тога, пејсинг хипокампалних осцилација на 8 Хз није довео до промена у квалитету просторних кодова као што је раније пријављено9 и није променило временске кодове као што је примећено у нашој парадигми понашања.

Иако је објављено да временске (али не и место) ћелије могу директно зависити од инпута медијалног енторхиналног кортекса (МЕЦ)61, недавни експериментални докази сугеришу да лезије МЕЦ-а не доводе до било каквих промена у физиологији хипокампалних временских ћелија62. Значајно је да је новије истраживање открило да оптогенетски пејсинг МС није пореметио просторне кодове ћелија мреже у енторхиналкортексу63, што даље сугерише да МС активност није директно укључена у просторне кодове унутар формације хипокампуса. Заједно са нашим резултатима, ово указује да би темпорални кодови могли бити или резултат рачунања зависних од МС унутар енторхиналкортекса63 (1) или бити генерисани интринзично унутар самог хипокампуса (2).

Док су ране студије откриле да је МС играо суштинску улогу у одржавању временских ћелија и подржавању радне меморије36, недавни експериментални докази показују да би тачан допринос временских ћелија перформансама радне меморије могао бити мањи него што се раније мислило62. Пошто МС-ПВ неурони вероватно одржавају значајне нивое активности током оптогенетске стимулације са скромбом фреквенције (за разлику од приступа инхибицији), наши резултати снажно подржавају улогу прецизно темпиране септалне активности у подршци радној меморији, што је раније претпостављено као хипотеза. Иако смо приметили смањене перформансе меморије када смо користили оптогенетску стимулацију током преузимања, стимулација током фазе кодирања ДНМТС задатака није била повезана са смањеном меморијом у ДНМТС задатку. Пејсинг тетаосцилација на 8 Хз током фазе кодирања или преузимања задатка НОПР довео је до нарушеног преузимања меморије. Наше електрофизиолошке анализе даље откривају да је таква стимулација проузроковала да се удаљени региони дорзалног ЦА1 увуку у исту фазу, са нефизиолошким закључавањем фазе. Иако нисмо директно истраживали узрочну везу између промена фазе и перформанси меморије, утврђено је да су спикетиминг и прецесија фазе такође повезани са измењеном функцијом радне меморије упркос томе што је кодирање остало нетакнуто64. Штавише, раније се показало да је фазно закључавање пирамидалних неурона на тетаосцилације предиктор перформанси меморије65.

Приметно, једно ограничење нашег приступа успостављању својстава темпора и подешавања удаљености је то што захтева четири пута више узорковања него обична линеарна стаза, што повећава шансе за фотобељење када се додају услови стимулације на експерименталну временску линију. Док смо открили да оптогенетске стимулације у истој сесији не утичу на просторне кодове, новији хардвер за снимање који укључује сензоре са повећаном осетљивошћу може помоћи у спречавању избељивања фотографија и омогућити дуже сесије снимања, на тај начин узорковање временских и удаљених ћелија заједно са стимулацијама. Такође смо открили да је скуп неурона који значајно и специфично кодирају само једну променљиву мали у поређењу са бројем коњуктивних неурона, што чини захтеве за узорковањем за ове високо специфичне неуроне много вишим.

Пружамо експерименталне доказе да манипулација МС не мења брзину локомотора и да, обрнуто, брзина локомотора диктира тета фреквенцију. Иако су кодови места и времена сачувани током наших МС стимулација, део (~ 6%) ћелија је директно модулисан и могао би да објасни оштећење памћења уочено у нашим тестовима понашања. Раније је пријављено да су ПВ интернеурони у хипокампусу део микрокола који су кључни у регулисању консолидације меморије66,67, а наше оптогенетске манипулације могу бити повезане са утишавањем дела ових ћелија. Штавише, иако нисмо приметили промене у фреквентним опсезима осим тета, не можемо искључити да би тајминг пирамидалног неурона ЦА1 могао бити драстично промењен када се скремболују тета осцилације, док се показало да стимулација од 8 Хз не доводи до повећане активности хипокампуса18, што би могло објаснити диференцијалне ефекте ти обрасци стимулације на перформансе радне меморије. Поремећаји памћења које смо приметили вероватно нису били холинергични: прво, у нашим имунохистолошким експериментима, нисмо нашли практично никакву експресију ЦхримсонР у ЦхАТ неуронима МС. Друго, наше оптогенетске стимулације нису биле повезане са променама таласања хипокампуса, док претходни извештаји указују да стимулација ЦхАТ неурони су повезани са смањеном фреквенцијом таласања45,57. ЦхримсонР трансфекција неурона МС ВГЛУТ2 такође је мало вероватна јер је активација ових неурона повезана са директним повећањем локомоторне активности 68, што нисмо приметили.

Иако би прецизан временски распоред пирамидалних шиљака ЦА1 могао да објасни, бар делимично, ефекте МС стимулације на памћење, треба узети у обзир алтернативне механизме. Посебно, поред хипокампуса и енторхиналног кортекса, МС ПВнеурони пројектују и ретроспленијални кортекс3 и могли би бити одговорни за нека од оштећења памћења која су овде примећена.

Укратко, користећи имиџинг калцијума, оптогенетику и електрофизиологију, открили смо да се тета ритмови могу убрзати или укинути коришћењем стимулације МС. Таква стимулација је пореметила периодично као и враћање радне меморије. Ови ефекти нису били холинергични и нису пореметили активност таласања хипокампуса. Коначно, док је мали део неурона хипокампуса реаговао директно на оптогенетску стимулацију МС, ћелије места, времена и удаљености нису биле поремећене манипулацијама тета осцилација. Заједно, ови резултати сугеришу да док МС улаз у хипокампус игра битну улогу у меморији, мултиплексирани кодови у ЦА1 пирамидалним неуронима можда нису директан супстрат за такве функције.

Методе

Животиње

Све процедуре су одобрили Комитет за бригу о животињама Универзитета МцГилл и Канадски савет за негу животиња (протокол 2015-7650). Укупно н=41 мужјака (н=20) и женки (н=21) старих 8–16 недеља, Б6; 129П2 ПВ-Цре мишева (Јацксон Лаборатори, РРИД: ИМСР{{ 10}}ЈАКС:017320) су коришћени у овој студији. н=5 мишеви су коришћени за комбиновање оптогенетике са снимањем калцијума; н=3 мишеви су имплантирани за снимање калцијума, оптогенетику и електрофизиолошку контролу; н=4 мишеви су коришћени у електрофизиолошким студијама; н=29 мишева је трансфектовано и имплантирано за тестове понашања. Мишеви су смештени појединачно у циклусу 12-х светло/мрак на 22 степена и 40% влажности са храном и водом по вољи. Сви експерименти су изведени током светлосног дела циклуса светло/мрак.

Адено-повезани вирусни вектори

Адено-асоциран вирус ААВ5.ЦамКИИ.ГЦаМП6ф.ВПРЕ.СВ40 (Аддгене# 100834, добијен са Универзитета Пенсилваније Вецтор Цоре) је коришћен у свим експериментима за снимање калцијума. Адено-повезан вирус (ААВ) серотипа дј (хибридни капсид креиран од осам различитих ААВсеротипова) ААВдј-хСин-ЦхримсонР-тдТомато добијен је из Вецтор Цоре Фацилити на Универзитету здравља и науке Орегон у Портланду, Орегон. Иако је он ген за одржавање домаћинства, нисмо приметили трансфекцију у холинергичним ћелијама (погледајте „Резултате“ и Слику 2б–е). Као контрола коришћена је еИФП конструкција без ЦхримсонР секвенце (названа ИФП контрола у овом рукопису).

Хируршке процедуре

Мишеви су анестезирани изофлураном (5% индукција, 0.5–1% одржавање) и стављени у стереотаксички оквир (Давид Копф Инструментс). Температура тела је одржавана грејним јастучићем, очи су хидриране гелом (Оптикцаре) и карпрофен (10 мл/кг) је примењен субкутано. Лобања је потпуно очишћена од везивног ткива и урађене су мале краниотомије помоћу зубне бушилице за накнадну ињекцију или имплантацију.

Вирусне ињекције. Све вирусне ињекције су изведене помоћу стаклене пипете повезане са Нанојецт ИИИ (Друммонд) ињектором. 500 нл ААВдјхСин-ЦхримсонР-тдТомато (или еИФП контроле) је испоручено у МС брзином од 1 нЛ/с, на следећим координатама на основу стереотаксијског атласа референтног миша69 (удаљеност од Брегме у мм): антеропостериорно (АП) 0,85, медиолатерално (МЛ) 0, дорсовентрално (ДВ) -4,50 користећи угао од 5 степени у равни МЛ. Након операције, животиње су праћене до опоравка.

Имплантат са оптичким влакнима. Две недеље након ињекције, мишеви су анестезирани за имплантацију након исте хируршке процедуре. На истим координатама уграђена је оптичка влакна пречника 200 μм са керамичким ферулом (Тхорлабс). Имплантати су цементирани на месту коришћењем Ц&Б-Метабонд® (Паттерсон дентал). Црни лак за нокте је нанет преко зубног цемента да би се блокирала емисија светлости током оптогенетске стимулације.

Имплантати електроде. Низ од 7 волфрамових микроелектрода (~1 МΩимпеданса) спуштен је у дорзални ЦА1 који се протеже кроз стратумпирамидале (пир), стратум радиатум (рад) и стратум лацуносуммолецуларе (лм). Вијци постављени у кост изнад фронталног кортекса и малог мозга служили су као тло и референца. Након постављања електрода, уземљења и референтног положаја, примењен је зубни цемент да би се имплант трајно учврстио за лобању.

Имплантат за снимање калцијума. Убризгали смо вирус ААВ5.ЦамКИИ.ГЦаМП6ф (200 нЛ при 1 нл с−1) у хипокампални ЦА1 користећи следеће координате: антеропостериорно (АП) − 1.86 мм од брегме, медиолатерално (МЛ) 1,5 мм, дорсовентрално (ДВ) 1,5 мм. Две недеље након ињекције, мишеви су анестезирани изофлураном и лобања је очишћена. А<2 mm diameter craniotomy was performed in the skull above the injection site. An anchor screw was placed on the posterior plate above the cerebellum. The dura was removed, and the portion of the cortex above the injection site was aspirated using a vacuum pump until the corpus callosum was visible. These fiber bundles were then gently aspirated without applying pressure on the underlying hippocampus, and a 1.8 mm diameter gradient index (GRIN; Edmund Optics) lens was lowered at the following coordinates: AP − 1.86 mm from bregma, ML 1.5 mm, DV 1.2 mm. The GRIN lens was permanently attached to the skull using C&B-Metabond (Patterson Dental), and Kwik-Sil (World Precision Instruments) silicone adhesive was placed on the GRIN to protect it. Four weeks later, the silicone cap was removed and CA1 was imaged using a miniscope mounted with an aluminum base plate while mice were under light anesthesia (<0.5% isoflurane) to allow the visualization of cell activity. When a satisfying field of view was found (large neuronal assembly, visible landmarks), the base plate was cemented above the GRIN lens, the mini scope was removed, and a plastic cap was placed on the base plate to protect the GRIN lens.

Симултано снимање калцијума и електрофизиолошка снимања. Да бисмо контролисали ефекте ГРИН имплантата на хипокампалне тета, као и унакрсни разговор између мини-скопа и оптогенетских ексцитационих светала, причврстили смо волфрамове микроелектроде на ГРИН сочива. У ту сврху, поставили смо ГРИН сочива хоризонтално под микроскопом са малим увећањем у окружењу без прашине. Микроелектрода од волфрама је нежно постављена на горњу ивицу ГРИН сочива помоћу микроманипулатора. Користили смо познати пречник ГРИН сочива као референтну јединицу да проценимо жељено избочење електроде (~50 µм, даље дигитално процењено након микрофотографије препарата) према нашим планираним координатама имплантације. Мале количине (~ 50 µЛ) суперлепка су депоноване на горњу ивицу ГРИН сочива са електродом на месту и остављене да се осуши око 10 минута, пре наношења следећег слоја лепка. Пет танких слојева је коришћено за одржавање електроде причвршћене за ГРИН сочиво. Након имплантације ових склопова ГРИН електрода коришћењем гореописаног протокола, избочене жице су нежно савијене и сакривене испод заштитне капице (високе 1–1,5 цм) извучене из крушке ручне пипете за усисавање као замена за Квик-Сил.

Ин виво поступци понашања

Хабитуатион. Мишеви су нежно држани око 5 минута током једне недеље, уз прогресивно навикавање на процедуру зачепљења (оптичка влакна, минископ и електрофизиолошки пре-амплификовани каблови). Животиње су затим заказане за воду (приступ 2 сата дневно).

Снимци минископа. Минископи (В3) су састављени коришћењем инструкција отвореног кода (минисцопе.орг). Подаци о слици су добијени помоћу ЦМОС сензора за снимање (Аптина, МТ9В032) и мултиплексирани преко лаганог коаксијалног кабла. Подаци су добијени коришћењем кутије за прикупљање података (ДАК) повезаног преко УСБ хост контролера (Ципресс, ЦИУСБ3013). Понашање животиња је забележено коришћењем веб камере за потрошаче (Логитецх) постављене изнад окружења. Подаци о калцијуму и понашању су снимљени коришћењем минисцопе.орг, изворног софтвера за прилагодбу ДАК-а. ДАК је истовремено добијао токове понашања и ћелијске слике на 30 Хз као некомпримоване.ави датотеке од 1000 кадрова за 15-минутне сесије снимања, заједно са одговарајућим временским ознакама да би се омогућило прецизно временско усклађивање података о понашању и калцијумским сликама.

Ин виво електрофизиолошки снимци. Након 1 недеље постхируршког опоравка и једне недеље навикавања на постављање привезивања, забележен је ЛФП од имплантираних мишева. Сви снимљени сигнали са имплантираних електрода су појачани претпојачивачем тетхера пре него што су дигитализовани на 22 кХз коришћењем дигиталног система за снимање (Неуралинк, САД). Снимци сваког сигнала канала су сачувани заједно са видео снимцима и ТТЛ сигналима са ласерске диоде за накнадну анализу.

Оптогенетска стимулација. Ласерска стимулација је испоручена преко оптичког кабла (пречника 200 μм) коришћењем извора светлости од ласерских диодних влакана (Дориц Ленсес). Интензитет светлости је калибрисан и таласна дужина коригована коришћењем Повер Метер Бундле-а са ПМ100Д конзолом и С130Ц Слим Пхотодиоде Сенсорлигхт (Тхорлабс). Свака стимулација пејсинга (укључујући 8 Хз) је изведена коришћењем квадратних импулса од 5 мс. Да бисмо применили кодирану светлосну стимулацију, користили смо Ардуино микроконтролер да генеришемо осцилациони сигнал беле буке који се директно доводи у аналогни улаз драјвера ласерске диоде. Да бисмо извршили насумично одабрану фреквенцијску стимулацију, користили смо стандардни 5 с ОН, 5 с ОФФ протокол, али за сваку епоху стимулације користили смо Ардуино микроконтролер да насумично бирамо фреквенцију стимулације у тхета опсегу. Приликом примене оптогенетске стимулације током понашања, лабав комад топлоскупљајуће цеви је постављен око споја између повезног кабла и имплантата мишјег прстена да би се ограничила емисија видљиве светлости. Интензитет светлости се изражава као номинална снага, мерена на врху склопа имплантата од оптичког влакна-канала (пре хируршког постављања), и коригована за одговарајућу таласну дужину.

Тестови понашања

Линеарна стаза секвенцијалног тона. Мишеви су били по распореду воде и могли су приступити води само 2 сата дневно од 18 до 20 сати. Да бисмо раздвојили просторне, временске и шифре удаљености, градимо линеарну стазу дугу 134 цм користећи средње сиве Лего® коцке, што омогућава лаке модификације и имплементације без потребно је трајно изменити структуру лавиринта. Пироелектрични сензори су постављени на сваки крај линеарне стазе и повезани са Ардуино микроконтролером. Свака детекција је активирала нови тон у низу, указујући на напредак у испоруци. Коришћени су и испоручени следећи тонови помоћу апиезо звучника: бипови од 1 с на 2000 Хз, бипови од 250 мс на 3000 Хз и непрекидни тон на 4000 Хз. Када се активирао последњи, континуирани тон, награда (10% сахарозе у води) је испоручена на почетном крају линеарне стазе у поклопцу Фалцон епрувете од 15 мЛ. Промене у смеру трчања пре активирања следећег тона сматрале су се грешкама и нису покренуле испоруку награде. Учинак је мерен као број тачних покушаја (без грешке) подељен са бројем укупних покушаја.

Препознавање места новог објекта. Првог дана, мишевима је било дозвољено да слободно истражују тамно сиво отворено поље величине 45 × 45 цм које је садржало визуелне елементе (велике беле хоризонталне и вертикалне решетке) на својим зидовима током 10 минута. Другог дана, два идентична предмета (подлога за руку) су представљена 10 мин. Трећег дана, мишевима је дозвољено да истражују исто отворено поље док је локација једног од два објекта била измештена. Да би се контролисале потенцијалне пристрасности просторних преференција, и почетни, као и померени положај објеката, били су насумични. Мишеви су приписали насумични редослед тестирања који је остао идентичан током три дана тестирања. Понашање је снимљено видео камером (Логитецх) и анализирано ван мреже. Бихевиорална анализа је урађена без обзира на генотип и третман. Истраживања објеката су дефинисана као епохе у којима мишеви имају нос унутар 1 цм од објекта. РИ је израчунат на следећи начин:

Аутоматско одложено неподударање са узорком задатка. Мишеви су били заказани за воду и обучени у континуираном Т-лабиринту за одложени задатак узорка који није подударан. Укратко, свако испитивање је подељено у две фазе: узорак и тест. У фази узорка, једна рука је била блокирана, а мишеви су били приморани да истражују супротну руку, где су добили награду од 50 µЛ воде од 10% сахарозе. Након завршетка фазе узорковања, мишеви су били подвргнути кашњењу (10 с) у почетном одељку. Затим, током фазе тестирања, обе руке су могле да се истраже, али само супротна (неистражена) рука је била мамацна, тако да су мишеви морали да мењају локације између фазе узорка и фазе тестирања. Мишеви су били подвргнути 10 покушаја (узорак + тест) дневно, током 10 узастопних дана, а дневни успех је израчунат као број тачних покушаја подељен укупним бројем покушаја.

Постмортем хистолошке анализе

Након завршетка тестирања понашања, мишеви су дубоко анестезирани мешавином кетамин/ксилазин/ацепромазин (100, 16, 3 мг/кг, респективно, интраперитонеална ињекција) и перфузирани транскардијално са 4% параформалдехида (ПФА) у ПБС. Мозгови су екстраховани и накнадно фиксирани преко ноћи у ПФА на 4 степена и затим испрани у ПБС додатних 24 х на 4 степена. Мозак и пресеци су криозаштићени у раствору 30% етилен гликола, 30% глицерола и 40% ПБС до употребе. Сваки мозак је затим исечен на 50 µм помоћу вибратома: сваки део је секвенцијално сакупљен у 4 различите епрувете од 1,5 мЛ да би се омогућила различита анализа (локација електроде, имунохистохемија).

Имунохистологи. Користећи једну епрувету сакупљених делова мозга (25% узорковања) за сваку анализу, секције су испиране 3 × 5 минута у ПБС-у да би се уклонио криопротективни раствор. Секције су инкубиране преко ноћи са ПГТ (0.45% желатина и 0.25% тритона у ПБС) на 4 степена. Затим, кришке су инкубиране са примарним антителима: или 1:200 козји анти-холин-ацетил -трансфераза из Миллипореа или 1:500 мишји анти-ПВмоноклонални ИгГ1 из Сигма-Алдрицх у ПГТ на собној температури 48 х или 2 х. Након испирања од 10, 20 и 30 минута, секције су затим инкубиране са секундарним антителима [1:2000 магарећа коза у комбинацији са Алека 488 или 1:500 козјим анти-мишјим ИгГ1 спојеним са Алека 488 (Лифе Тецхнологиес за)] у ПГТ 45 мин. Након прања од 10, 20 и 30 минута у ПБС-у, секције су затим постављене на стакалце и трајно прекривене Флуоромоунт медијумом за монтирање који је садржао ДАПИ. У ову студију су укључени само мишеви са хистолошки потврђеним постављањем имплантата. За ГРИН сочива, површина сочива је морала бити<100 µm above stratum pyramidale, and GCaMP6f expression was validated using fluorescence microscopy. Electrophysiological implants had to include at least one microelectrode in CA1 stratum radiatum or stratum pyramidale. Finally, the tips of fiber optics had to be within 100 µm of the MS region, and proper construct expression was assessed using fluorescence microscopy.

Анализа података

Except for analyses of SWRs and the explicit impact of locomotion on physiological recordings, electrophysiological and calcium imaging analyses were performed only on periods of locomotion (>2 cm s−1 in the open field; >5 цм с−1 на линеарној стази).

Аутоматизовано праћење понашања. Да бисмо издвојили информације о положају, брзини и правцу главе мишева, користили смо ДеепЛабЦут70,71. Укратко, обучили смо модел да детектује мишеве уши, нос, тело и базу репа. Смер главе је процењен коришћењем угла између сваког уха или носа и тела, у зависности од доступности мерења. Подаци о локацији су интерполирани на фреквенцију узорковања калцијумских слика коришћењем линеарне интерполације. Брзина је екстрахована израчунавањем Δд/Δт где је д растојање и т време, а резултат је накнадно изглађен применом Гаусовог филтера са сигма=33 мс да би се уклонили артефакти детекције. Сигнали брзине су коришћени за идентификацију периода локомоторне активности и израчунавање места, времена и модулације удаљености активности посебно за те периоде.

Анализа слике калцијума. Анализа података са сликања калцијума је извршена коришћењем МАТЛАБ 2020а и Питхон 3.8.4. Видео снимци су анализирани помоћу цевовода Минисцопе Аналисис (хттпс://гитхуб.цом/еттергуиллауме/МинисцопеАналисис). Укратко, крута (ротација и транслација) корекција покрета је примењена коришћењем НоРМЦорре72, а видео снимци су просторно смањени (3×) пре спајања. Трагови калцијума су екстраховани коришћењем ЦНМФе51 користећи следеће параметре: гСиг=3 пиксела (ширина Гаусовог језгра), гСиз=20 пиксела (приближан пречник неурона), позадина_модел='прстен', просторни_алгоритам='халс', мин_корекција=0.8 (минимални праг корелације пиксела), мин_ПНР {{17 }} (минимални праг односа пик-шум).

Сирови трагови калцијума су филтрирани да би се уклониле флуктуације високе фреквенције и бинаризовани: Укратко, неурони су се сматрали активним када је нормализована амплитуда калцијумовог сигнала премашила две стандардне девијације, а дериват првог реда је био изнад 0 (погледајте реф. 52 за додатне детаље о методологији52). Да би се издвојили неурони који су подешени на специфичне варијабле, локација, време и растојање су спаковани (локација: канте од 3 цм; време: канте од 1 с; растојање: канте од 3 цм). Из бинаризованих сигнала, израчунали смо маргиналну вероватноћу да ће ћелије бити активне П Аð Þ које користимо као прокси за неуронску активност. Што је још важније, онда изводимо вероватноћу активности или 'вероватноћу да будемо активни с обзиром на стање променљиве' ПА ј Си користећи биниране варијабле:

где је М укупан број могућих стања понашања, а П(Си∩Ај) је заједничка вероватноћа да животиња буде у кошу И истовремено са нивоом активности ј (0 или 1). Да бисмо проценили значај добијене МИ вредности, онда смо генерисали 1000 измешаних сурогата користећи насумичне кружне пермутације. Одабрали смо кружне пермутације јер уклањају временску везу између неуронске активности и понашања, док и даље чувају временску структуру калцијумских транзијента и на тај начин доводе до конзервативнијих резултата (за разлику од потпуне рандомизације сваке тачке података, што повећава значајну вредност резултата). Пошто измешани сурогати нису били систематски нормално распоређени, користили смо непараметарски приступ где п-вредност (пН) одговара броју тачака података из измешане дистрибуције који је већи од стварних података за сваку корпу, подељен са бројем пермутација52, 73.

Да бисмо одредили модулацију ћелија оптогенетским стимулацијама, користили смо сличан приступ, али смо израчунали МИ између неуронске активности и бинаризованих сигнала стимулације (на тај начин третирано као стање понашања). Иста процедура кружног мешања је тада коришћена да би се издвојио статистички значај.

where P(S|A) is the posterior probability distribution of states given neuronal activity. Using only epochs with velocity >5 цм с−1, скуп података за обуку је генерисан коришћењем 90% података. Преосталих 10% података је коришћено за тестирање. Грешка у декодирању је израчуната коришћењем 50 покретаних сурогата и групе од 160 ћелија коришћењем насумично одабраних тачака података са заменом. Претпоставља се да је сваки неурон независан један од другог, што у пракси није случај и доводи до већих грешака у реконструкцији, али смањује време рачунања. Постериорна вероватноћа популације је изведена из следеће једначине:

Праћење ћелија током више дана. Неурони су праћени током више дана коришћењем ЦеллРег74: хттпс://гитхуб.цом/зивлаб/ЦеллРег (в1.5.3). Укратко, просторни отисци су поравнати помоћу крутог поравнања да би се исправиле ротације и транслације. Након поравнања, сматрали смо да су кандидатски скупови ћелија исти неурони ако је њихова максимална удаљеност<12 µm, and used the modeled spatial correlation threshold (usually in the range 0.6–0.8) to determine the identity of cell pairs across days. Finally, we assessed the stability of the spatial representation using pairwise field correlation (Pearson correlation of tuning curves).

Електрофизиолошка анализа. Анализа електрофизиолошких података обављена је коришћењем МАТЛАБ-а 2020а коришћењем и обраде сигнала као и вавелет алата. Конволуција таласа је примењена на ЛФП сигнале коришћењем комплексних Морлет таласа ('цмор1–1.5' у МАТЛАБ-у) када је била потребна прецизност у временском и фреквенцијском домену. Покретни прозор Фуријеова конволуција (2 с прозор у тхета опсегу, 5 с прозор у гама опсегу, 10 мс покретни кораци) је коришћена када је тачност фреквентног домена била привилегована у односу на тачност временског домена (нпр. топлот доминантна фреквенција при пејсингу помоћу оптогенетике). Анализа спектралне густине снаге је извршена када су мишеви трчали на 5 цм с-1 или више, осим ако није другачије описано.

Снага осциловања. ОС је израчунат као однос спектралне густине кумулативне снаге око вршне фреквенције осциловања ±1 Хз до кумулативне снаге опсега у тхета (4–12 Хз) опсегу. Ова метрика постаје 1 када сва спектрална густина снаге падне у вршну фреквенцију осциловања (нпр. 8 Хз ако се стимулише на тој фреквенцији).

Детекција и анализа СВР-а. За праћење СВР-а, мишевима је дозвољено да слободно истражују отворено поље 10 мин током снимања. Стимулације (шифроване или 8 Хз) су изведене са парадигмом од 5 с ОН, 5 с ОФФ. За анализу су узети у обзир само периоди тихог одмора. У ту сврху, израчунали смо з-скориран однос тета/делта снаге након филтрирања за сваки фреквентни опсег, изводећи Хилбертову трансформацију и узели у обзир само периоде у којима је резултујућа вредност била испод 0. Да бисмо открили СВР, филтрирали смо ЛФП сигнале у 150–250 Хз фреквенцијски опсег и накнадно з-скод. Таласање је откривено коришћењем функције финдпеакс у МАТЛАБ-у, са следећим параметрима: тхресхолд=4 сд, минпеаквидтх=0 с, минпеакдистанце=0.03 с.

Референце

1. Цолгин, ЛЛ Ритмови хипокампалне мреже. Нат. Рев. Неуросци. 17, 239–249 (2016).

2. Тотх, К., Фреунд, ТФ & Милес, Р. Дезинхибиција хипокампалпирамидних ћелија пацова помоћу ГАБАергичних аферената из септума. Ј. Пхисиол. 500, 463–474 (1997).

3. Унал, Г., Јосхи, А., Винеи, ТЈ, Кис, В. & Сомогии, П. Синаптичке мете медијалне септалне пројекције у хипокампусу и екстрахипокампалним кортексима миша. Ј. Неуросци. 35, 15812–15826 (2015).

4. Симон, АП, Поиндессоус-Јазат, Ф., Дутар, П., Епелбаум, Ј. & Бассант, М.-Х. Својства пуцања анатомски идентификованих неурона у медијалном септуму анестезираних и неанестезираних пацова. Ј. Неуросци. 26, 9038–9046 (2006).

5. Сцотти, Ф. ет ал. Изразита електрофизиолошка својства глутаматергичних, холинергичких и ГАБАергичних септохипокампалних неурона пацова: нове импликације за ритмичност хипокампуса. Ј. Пхисиол. 551,927–943 (2003).

6. Мансеау, Ф., Даник, М. & Виллиамс, С. Функционална глутаматергична неуронска мрежа у подручју медијалног септума и дијагоналне траке. Ј.Пхисиол. 566, 865–884 (2005).

7. Амилхон, Б. ет ал. Парвалбумин интернеурони хипокампуса тунепопулационе активности на тхета фреквенцији. Неурон 86, 1277–1289 (2015).

8. Еттер, Г. ет ал. Оптогенетска гама стимулација спасава оштећења памћења у моделу миша са Алцхајмеровом болешћу. Нат. Цоммун. 10, 1–11 (2019).

9. Зутсхи, И. ет ал. Хипокампална неуронска кола реагују на оптогенетски пејсинг тета фреквенција генерисањем убрзаних фреквенција осциловања. Цурр. Биол. 28, 1179–1188.е3 (2018).

10. Бендер, Ф. ет ал. Тхета осцилације регулишу брзину локомоције путем пута од хипокампуса до бочног септума. Нат. Цоммун. 6,8521 (2015).

For more information:1950477648nn@gmail.com