Оптогенетска инхибиција улаза медијалног енторхиналног кортекса у хипокампус током кратког временског периода одмах након учења нарушава формирање меморије контекстуалног страха

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Апстрактан

Формирање временске асоцијацијемеморијаи страх од контекстамеморијасматра се да захтева медијални енторхинални кортекс (МЕЦ) инпуте захипокампустоком догађаја учења. Међутим, још увек није директно тестирано да ли су МЕЦ улази такође укључени у формирање меморије током периода након учења. Да бисмо испитали ову могућност, оптогенетски смо инхибирали аксоне и терминале који потичу од билатералних дорзалних МЕЦ ексцитаторних неурона у дорзалнојхипокампустоком 5 минута одмах након условљавања контекстуалног страха (ЦФЦ). Мишеви који су експримирали еНпХР3.0 су показали значајно мање замрзавање у поређењу са контролним мишевима који су експримирали само ЕГФП током теста преузимања у условљеном контексту 1 дан након учења. Насупрот томе, иста оптогенетска инхибиција МЕЦ улаза изведена 30 минута пре теста преузимања није утицала на замрзавање током теста преузимања, искључујући могућност неспецифичног штетног ефекта оптичке инхибиције на процес преузимања. Ови резултати подржавају да формирање контекстуалног памћења страха захтева МЕЦ улазе у хипокампус током периода након учења.

Кључне речи: Медијални енторхинални кортекс, Хипокампус, Контекстуално условљавање страха

Мин Соо Канг и Јин-Хее Хан

Хипокампус-енторхинални кортекс систем је кључан за епизодемеморијаформирање [1]. Докази сугеришу да је улаз из медијалног енторхиналног слоја кортекса ИИИ (МЕЦИИИ) ухипокампус, углавном за ЦА1 потпоље, кључно је за темпорално асоцијативно учење као што је условљавање страха у траговима, али не и за контекстуално и одложено условљавање страха [2, 3]. Насупрот томе, оптогенетска инхибиција ћелија медијалног енторхиналног слоја кортекса ИИ (МЕЦИИ) које се пројектују на зупчани гирус (ДГ) и ЦА3, али не и ћелије које пројектују на ЦА1, током ЦФЦ-а нарушава формирање памћења [4]. Дакле, сматра се да је унос од МЕЦИИ до ДГ или ЦА3 потребан за контекстуално учење страха. Не само у учењу, већ и МЕЦ унос у хипокампус је такође укључен у јединствене обрасце физиолошке активности уочене у хипокампусу током одмора и спавања, као што су таласи и назубљени шиљци који су повезани самеморијапроцес консолидације [5–10]. Стога, МЕЦ унос захипокампусможе имати улогу у формирању памћења током периода након учења. Међутим, ова могућност још није тестирана. Да бисмо тестирали да ли је МЕЦ унос у хипокампус неопходан током периода након учења, усвојили смо оптогенетички приступ утишавању активности МЕЦ улаза код 129/Ц57Бл/6 хибридних мишева [11, 12]. Да би се манипулисао уносом МЕЦ, адено-асоцираног вируса (ААВ) који садржи гене који кодирају еНпХР3.0 фузионисан са флуоресцентним протеином ЕИФП под ЦаМКИИ промотором (ААВ-ЦаМКИИ - еНпХР3.0-ЕИФП) је убризган у билатерални МЕЦ циљање на слој ИИ и ИИИ (0.5 µЛ по страни; АП: – 4,65 мм; МЛ: ±3,4 мм; ДВ: – 3,3 мм) (Слика 1а). Као контролу, убризгали смо ААВ коме недостаје еНпХР3.0 (ААВ ЦаМКИИ -ЕГФП), који експримира само флуоресцентни протеин. Експресија ААВ је ограничена на МЕЦ слојеве ИИ и ИИИ, који шаљу пројекцију у хипокампус (слика 1б). У хипокампусу, МЕЦ аксонске пројекције које експримирају ЕИФП откривене су у ДГ и ЦА3, које потичу из МЕЦИИ, као иу ЦА1, које потичу из МЕЦИИИ (слика 1а). Три недеље након операције ињекције ААВ-а, мишеви су поново анестезирани за операцију имплантације оптичких влакана.

Цистанцхеможе побољшатимеморија

Оптичка влакна су имплантирана у дорзални хипокампус (АП: − 2.0 мм; МЛ:±1,3 мм; ДВ: − 1,5 мм) за оптичку супресију дорзалних МЕЦ улаза са 561-}нм ласером. Врхови оптичких влакана били су лоцирани тачно изнад лакунозно-молекуларног слоја ЦА1 стратума, и стога је 561-нм ласер могао да покрије оба МЕЦИИ аферента у ДГ молекуларном слоју/ЦА3 стратум радиатум и МЕЦИИИ аференте у ЦА1 слоју лакунозе-молекуларног слоја ( Додатни фајл 1: Слика С1). Током једнонедељног периода опоравка након операције имплантације, мишеви су пролазили кроз хабитуацију влакана током 3 дана. Повезани су на оптички кабл за испоруку светлости и стављени у кавез за навикавање на 5 минута без испоруке светлости. После 3 дана навикавања, ЕГФП и еНпХР3.0 мишеви су обучени за ЦФЦ.

Мишеви су ушли у комору за кондиционирање и добили удар ({{0}}.5 мА, 2 с) 3 минута касније. Минут након удара стопала, мишеви су одмах пребачени у навикнути кавез и добијали су континуирано 561-нм светло (5 мВ на врху влакна) током 5 минута (слика 1б). Након инхибиције након учења, мишеви су се вратили у своје кућне кавезе. Да би се проверило да ли је контекстуална меморија правилно формирана, тестирана је дугорочна меморија (ЛТМ). Мишеви су поново ушли у комору за кондиционирање 24 сата након ЦФЦ. Нивои смрзавања су мерени као индекс ЛТМ, праћени 3 мин. Мишеви у групи еНпХР3.0 показали су значајно мање замрзавање у поређењу са мишевима у ЕГФП контролној групи (слика 1ц), што указује на 24- х ЛТМ дефицит инхибицијом МЕЦ улаза у хипокампус након учења. Ово смањење смрзавања није било због неспецифичног штетног ефекта процеса оптичке инхибиције. Када је иста оптичка инхибиција испоручена 30 минута пре ЛТМ теста, није било значајне разлике у замрзавању између група (слика 1д, е).

Велика већина аферентних МЕЦ циља хипокампус, познато је да МЕЦ шаље пројекције у медијална префронтална кортикална подручја као што су прелимбички и инфралимбички кортекс [13]. Пошто је експресија ААВ била насумична у МЕЦ-у, могуће је да је наша оптичка инхибиција утицала на МЕЦ аксоне који пролазе кроз хипокампус, ако их има, да би произвели свој ефекат на формирање контекстуалне меморије страха. Да бисмо искључили ову могућност, ретроградно смо означили МЕЦ неуроне који пројектују на хипокампус. У хипокампус смо убризгали вирус ЦАВ2-Цре, који ретроградно преузимају неурони који пројектују у хипокампус преко терминала аксона (слика 1ф).

ААВ-Еф1 - ДИО-еНпХР3.0-ЕИФП или ААВ-Еф1 -ДИО-ЕИФП је убризган у МЕЦ, тако да МЕЦ неурони који су преузели ЦАВ2-Цре могу екпресс еНпХР3.{10}}ЕИФП или ЕИФП (Додатна датотека 1: Слика С2). Десет, успели смо да инхибирамо МЕЦ улазе у хипокампусу одмах после ЦФЦ. Слично претходним резултатима, оптичка инхибиција је пореметила формирање меморије контекста страха (слика 1г, х) у овом стању. Дакле, ови подаци додатно јачају наш закључак да су МЕЦ улази у хипокампус кључни за формирање контекстуалне меморије током периода након учења. Једно ограничење у овој студији је недостатак просторне специфичности у коришћеној оптичкој инхибицији.

Стога је нејасно у којој мери и тачно где су у кругу хипокампуса широко распрострањени МЕЦ улази потиснути оптичком инхибицијом у нашем стању. Прецизна инхибиција МЕЦ улаза који циљају на специфично подпоље као што је ЦА1 или ДГ хипокампуса може бити неопходна да би се разјаснио механизам којим МЕЦ улази доприносе формирању контекстуалне меморије страха у будућој студији. Иако нисмо тестирали ефекат оптичке инхибиције МЕЦ улаза у хипокампус у различитим временским тачкама након контекстуалног условљавања страха у овој студији, претходне студије извештавају о временски зависној улози можданих активности након учења за консолидацију сећања зависних од хипокампуса као што је контекстуално условљавање страха. На пример, користећи оптогенетичку стратегију, претходна студија је вештачки манипулисала индукцијом спороталасног сна (СВС) у различитим временским тачкама након различитих задатака учења и показало се да постоји критични временски прозор (унутар 30 минута) током којег је СВС изазван светлошћу може побољшати сећања зависна од хипокампуса [14].

Слика 1 инхибиција МЕЦ улаза у хипокампус непосредно након зараде нарушава формирање дуготрајног контекстуалног памћења страха. а Шематски приказ билатералне ААВиниекције и места имплантације оптичке феруле (ефт). Репрезентативне конкокалмикроскопк слике које гурају експресију ЕГФП и еНпХР0-ЕИФП у МЕЦ на врху) иу хипокампусу (доле). Звездица означава приближан положај врха оптичког влакна. б Шема понашања.хистограм који показује ниво смрзавања током тестеНпХР30 око (3589主 3,21 процената ,н=】1】) показао је значајно мањи драгуљ у поређењу са ЕГФП контролном групом (53,13±265 процената,н=12) у ЛТМ тест.**стр<00005; students="" t-test.behavior="" scheme.e="" histogram="" shoving="" freezing="" level="" during="" the="" test.enphr3.0(5031±290%,n="1l)and" egfp(4831±427%,n="10group" showed="" similar="" feinglevelin="" utm="" tes.p="">005:Т-тест ученика.није значајан,ф ЦАВ и ААВ инигцтигн стратегија или ретроградно обележавање МЕЦ неуона који проилцтира хипокампус(ф) Шематски приказ билатералне ЦВ ињекције АВ ињекције и шеме понашања на месту имплантата оптичке феруле (десно). х Хистограм који показује ниво замрзавања током тест.еНпХР3.0 групе (33,71±4,06 процената ,н=11) ​​показао је значајно мањи ниво замрзавања у поређењу са ЕИФПцонтролгроуп(50,13±3,18 процената,н=12) у ЛИМ тесту .**п<0005; student's="" t-test="" data="" are="" presented="" as="">

Интересантно је да је друга студија на пацовима показала да селективне електролитичке лезије директне енторхиналне пројекције (темпоамоничне, ТА) на хипокампално подручје ЦА1 24 х, али не 3 недеље након тренинга Моррисовог воденог лавиринта, поремете формирање просторне меморије на даљину. време, што сугерише да је интеракција МЕЦ-хипокампуса преко ТА улазног пута током овог временског периода потребна за консолидацију система [15]. С обзиром на ове налазе, врло је вероватно да МЕЦ улази у хипокампус имају временски зависну улогу у формирању недавне и удаљене контекстуалне меморије страха.

Занимљиво је у нашој студији да је тако кратак период (5 мин) оптогенетске инхибиције након тренинга био довољан да наруши формирање контекстне меморије. Једно тумачење је да наши резултати могу одражавати делимичан блок догађаја консолидације који су потребни за нормално формирање меморије. У складу са овим извештајем, памћење је делимично нарушено у нашем стању. Друга могућност је да може доћи до критичног догађаја током овог кратког временског периода потребног за формирање контекстуалне меморије страха. Једна од могућности је да МЕЦ унос може бити кључан за покретање таласа или зубаца у хипокампусу који су у корелацији са понављањем претходно доживљених догађаја [7, 9, 10, 16], а оптогенетска инхибиција МЕЦ улаза може пореметити такве обрасце активности. Алтернативно, кратка инхибиција МЕЦ улаза може утицати на каснији спороталасни сан, који такође има кључни временски прозор у смислу консолидације меморије зависне од хипокампуса [14].

Референце

1. Еицхенбаум Х. Кортикално-хипокампални систем за декларативно памћење. Нат Рев Неуросци. 2000;1(1):41–50.

2. Сух Ј, Ривест АЈ, Накасхима Т, Томинага Т, Тонегава С. Енторхинални слој кортекса ИИИ улаз у хипокампус је кључан за временску повезаност

3.меморија. Наука. 2011;334(6061):1415–20.Китамура Т, Пигнателли М, Сух Ј, Кохара К, Иосхики А, Абе К, ет ал. Острвске ћелије контролишу меморију временских асоцијација. Наука. 2014;343(6173):896–901.

4. Китамура Т, Сун Ц, Мартин Ј, Китцх Љ, Сцхнитзер МЈ, Тонегава С. Енторхиналне кортикалне ћелије океана кодирају специфичне контексте и покрећу контекстно специфично памћење страха. Неурон. 2015;87(6):1317–31.

5. Бузсаки Г, Хорватх З, Уриосте Р, Хедтке Ј, Висе К. Високофреквентна мрежа

6.осцилације у хипокампусу. Наука. 1992;256(5059):1025–7.Брагин А, Јандо Г, Надасди З, Ванландегхем М, Бузсаки Г. Зупчасти ЕЕГ шиљци и повезана интернеуронска популација пуцања у хипокампалном хиларном региону пацова. Ј Неуропхисиол. 1995;73(4):1691–705.

7. Цхробак ЈЈ, Лоринцз А, Бузсаки Г. Пхисиологицал паттернс ин тхе хиппоцампал-енторхинал цортек систем. Хипокампус. 2000;10(4):457–65.

8. Гирардеау Г, Зугаро М. Хипокампални таласи и консолидација меморије. Цурр Опин Неуробиол. 2011;21(3):452–9.

9. Иамамото Ј, Тонегава С. Директан медијални енторхинални кортекс инпут у хипокампални ЦА1 је кључан за продужено понављање у тихом будном стању. Неурон. 2017;96(1):217–27.

10. Нокиа МС, Гуревициене И, Васелиус Т, Манила Х, Пенттонен М. Хипокампална електрична стимулација омета асоцијативно учење када је усмерена на зубне шиљке. Ј Пхисиол-Лондон. 2017;595(14):4961–71.

11. Вехнер ЈМ, Силва А. Важност разлика сојева у евалуацији процеса учења и памћења код нултих мутаната. Мент Ретард Дев Дисабил Рес Рев. 1996;2(4):243–8.

12. Ветере Г, Кеннеи ЈВ, Тран ЛМ, Ксиа Ф, Стеадман ПЕ, Паркинсон Ј, ет ал. Хемогенетско испитивање мреже памћења страха на нивоу мозга код мишева. Неурон. 2017;94(2):363–74.

13. Инсаусти Р, Херреро МТ, Виттер МП. Енторхинални кортекс пацова: цитоархитектонске поделе и порекло и дистрибуција кортикалних аферената. Хипокампус. 1997;7(2):146–83.

14. Лу И, Зху ЗГ, Ма КК, Су ИТ, Хан И, Ванг Кс, ет ал. Критични временски оквир за селективну индукцију консолидације хипокампалне меморије кратком епизодом спавања спорог таласа. Неуросциенце Буллетин. 2018;34(6):1091–9.

15. Ремондес М, Сцхуман ЕМ. Улога кортикалног улаза у хипокампално подручје ЦА1 у консолидацији дугорочне меморије. Природа. 2004;431(7009):699–703.

16. О'Неилл Ј, Боццара ЦН, Стелла Ф, Сцхоененбергер П, Цсицсвари Ј. Површински слојеви медијалног енторхиналног кортекса се репродукују независно од хипокампуса. Наука. 2017;355(6321):184–8.