Оксидативни стрес, дисфункционални енергетски метаболизам и дестабилизујући неуротрансмитери променили су церебрални метаболички профил у моделу пацова симулираног роњења са засићењем хелиокса на 4.0 МПа Ⅱ

Поступак екстракције ткива

Процедура екстракције поларних метаболита из узорака ткива била је мања модификација као што је објављено [18]. Претходно измерени узорци замрзнутог ткива су одмрзнути на леду, а затим подвргнути механичкој хомогенизацији у ледено хладном ХПЛЦ систему растварача метанол-хлороформ-вода (400 μЛ, 400 μЛ, односно 285 μЛ, на 100 мг можданог ткива) користећи хомогенизатор ткива (Прецеллис 24, Бертин Тецхнологиес, ​​Виллеурбанне, Француска). Добијени хомогенати су држани на леду током периода од 30 мин, а затим центрифугирани на 12,000 кг током периода од 10 мин на 4˚Ц. Супернатант сваког узорка је затим уклоњен и лиофилизован да би се добио прах који садржи поларне метаболите у сушачу смрзавањем (ФД-1А-80, БИОЦООЛ, Кина). Сваки узорак праха је накнадно реконституисан са 550 μЛ ПБС пуфера који има 0,1 проценат ТСП, а сви узорци су затим темељно измешани и центрифугирани на 12,000 кг током периода од 20 минута на 4˚Ц. Аликвот од 500 μЛ супернатанта је затим пребачен у НМР епрувету пречника 5,0 мм (Норрел, УК). Принцип екстракције протеина у узорку кортекса био је као што је претходно описано без модификација. Тачна количина узорака кортекса је сипана у пуфер за хомогенизацију (ХЕПЕС 25 ммол/Л, пХ 7,4, МгЦ12 5 ммо1/Л, ДТТ 2 ммол/Л, ЕДТА 1,3 ммол/Л, ЕГТА 1 ммол/Л, 0,1 проценат Тритон Кс-100, апротинин, пепстатин А и леупептин по 10 уг/мл) и хомогенизовани ручно у леденом купатилу. Смеша је центрифугирана на 1,000 кг током периода од 10 мин на 4˚Ц, а супернатант је коришћен за квантификационе концентрације протеина коришћењем Брадфордовог теста.

Кликните овде да бисте сазнали Цистанцхе антиоксидациону функцију

Биохемијски тест

Осетљиви, компетитивни ензимски имуносорбентни тест (ЕЛИСА) је примењен са комплетима за испитивање за квантификацију метаболичких ензима На-КАТПазе и АЦхЕ и неуротрансмитера ДА, Е, НЕ, 5ХТ и ГАБА. ЕЛИСА је такође одредила нивое СОД, МДА и ГПк у кортикалном ткиву помоћу комплета за анализу према упутствима произвођача.

НМР мерење

Ефикасна квантификација метаболита ткива је постигнута коришћењем аналитичке платформе засноване на течном Брукер Аванце-ИИИ НМР спектрометру високе резолуције опремљеном криогеном сондом високе осетљивости која ради на фреквенцији од 600. 17 МХз за 1 Х посматрање на 298 К. Водом потиснута једнодимензионална 1 Х ЗГПР (ТОПСПИН верзија 3.0, Брукер Биоспин) импулсна секвенца (РД-90˚-АЦК) је примењена на набавити НМР податке за сваки узорак. Четири лажна скенирања и 128 транзијента су снимљени у временском домену од 32 К тачака података коришћењем ширине спектра од 20 ппм са кашњењем релаксације од 10,0 с и временом аквизиције од 2,73 с. Експоненцијална функција проширења линије од 0,3 Хз и попуњавање нулом до 64 К тачака података примењена је на све слободне индукционе распаде (ФИД) пре Фуријеове трансформације. Додатне дводимензионалне НМР технике са корелационом спектроскопијом пулсирајућег поља (гЦОСИ) и 2Д хомонуклеарном тоталном корелационом спектроскопијом (ТОЦСИ) коришћене су коришћењем стандардних импулсних програма на одабраним узорцима да би се потврдила додела хемијског померања. Аутоматизовани мењач узорака за континуирану испоруку узорака је коришћен у свим спектрима.

Идентификација и потврда метаболита

НМР сигнали засновани на локацији појединачних резонанција на спектрима идентификовани су у софтверском пакету Цхеномк НМР Суите в. 8.4 (Евалуатион версион). Потврде неких додељивања метаболита су спроведене узимајући у обзир хемијске помаке, константе спајања и обрасце вишеструкости метаболита као информације о скаларним спрегама екстрахованим из 1 Х–1 Х ЦОСИ, 1 Х–1 Х ТОЦСИ, јавних НМР база података као што су ЦОЛМАР и Хуман Метаболоме База података (ХМДБ) и литература [18, 19].

Мултиваријантна статистичка анализа

Протокол за претходну обраду коришћен за претходну обраду сваког 1Д 1Х НМР спектра био је исти као онај описан у нашем претходном раду [20]. 1Х НМР спектри су фазни и кориговани на основу коришћења МестРеНова (Местрелаб Ресеарцх, СЛ, Шпанија), а спектрални регион сваког метаболита је интегрисан у једну канту. Резонанције сигнала органског растварача и резидуалног Х2О/ХОД сигналног региона су уклоњене у свим 1Д 1Х НМР спектрима. 0.{{30}}03 Хз буцкет процедура и нормализација на збир спектралног интензитета помноженог са 10000 примењени су у свим спектрима. За анализу следећег корака изабране су само највеће вредности у једном врхунцу да би се избегла погрешна интерпретација дискриминантних метаболита због преклапања сигнала. Након тога, издвојене су интегралне канте од 47 метаболита и подвргнуте униваријантној и мултиваријантној анализи података. Анализа дискриминације анализом главних компоненти (ПЦА) и анализа дискриминације парцијалном анализом најмањих квадрата (ПЛС-ДА) и дискриминаторном анализом ортогоналних пројекција на латентне структуре (ОПЛС-ДА) извршена је коришћењем софтверског пакета СИМЦА-П плус 14.0 (Уметрицс). , Умеа, Шведска) скалиран на податке о јединичној варијанси. Графике ПЦА и ПЛС-ДА резултата су илустроване са првом и другом главном компонентом (т[1], т[2]), док је ОПЛС-ДА резултат графика користио т[1] и ортогоналну компоненту (то[1 ]). Параметри К2 (цум), Р2И(цум) и Р2Кс (цум) су израчунати да би се тестирала робусност модела дискриминације у односу на прекомерно прилагођавање [21]. Као што је претходно описано, вредност процене квалитета од К2 � 0,4 се сматра поузданим моделом. Седмострука стратегија унакрсне валидације и тест пермутације 200 пута са првом компонентом примењени су да би се заштитили од прекомерног прилагођавања модела и додатно потврдили поузданост и веродостојност модела. Ако је К2 регресиона линија имала негативан пресек и вредности К2 постављене у крајњој левој тачки биле су веће од свих К2 вредности десних тачака у пермутираном тесту, успостављени ОПЛС-ДА модел је био робустан [22]. Подразумевана 10-стратегија унакрсне провере преклопа је примењена да би се заштитио од прекомерног прилагођавања модела. Генерално, статистика процене квалитета (К2) � 0,4 се сматра поузданим моделом, као што је претходно описано. Коефицијенти корелације (р) и ВИП вредности екстраховани из ОПЛС-ДА модела су коришћени за идентификацију метаболита који су значајно допринели раздвајању између две групе. Поред тога, збирне промене метаболита између група су израчунате коришћењем функције. ИА/ИБ, где ИА и ИБ представљају средње вредности за интеграл метаболита у А и Б групи, респективно. Топлотна мапа и дијаграми су уцртани да би се олакшало разумевање варијација метаболита међу групама.

Униваријантна статистика интеграла метаболита

Просек метаболита у свакој групи је изражен као средња вредност ± стандардна девијација (СД). Униваријантна анализа је такође спроведена коришћењем АНОВА (анализа варијансе). Статистички значајне разлике између група процењене су неупареним т-тестом од два репа након конверзије лог у софтверу ГрапхПад Присм В 8.4.3 (Грапх Пад Софтваре Инц., Сан Дијего, Калифорнија, САД). Статистички значајне разлике дефинисане су вредностима п (< 0.05). According to the three criteria, including an absolute value of r greater than 0.50, a value of VIP greater than 1.0, and a p-value less than 0.05, the bucket variables with one of three features will be selected as discriminatory variables. Because more than one bucket value was listed from the same metabolite, two or more discriminative variables arising from the same metabolite will be present in the discriminatory panel. Selection will be carried out based on VIP rankings, and only the variables from the same metabolites with the highest VIP values were therefore selected as discriminatory metabolite level features, which will be included in the next-step analysis.

Системска статистичка анализа метаболичке корелације и хијерархијска кластер анализа

Прорачун Пирсоновог коефицијента корелације и хијерархијска кластер анализа су спроведени на основу релативних интеграла метаболита у Р Студио (верзија 1.4.1717) са малим скриптама. За сваки групни пар, матрица корелације је илустрована у мапи пиксела како је описано у литератури [21]. Укратко, за сваку променљиву у једној групи, корелације са п вредностима мањим од 0.05 су се сматрале значајним статистичким корелацијама и држане су да би се конструисала коначна мрежа корелација како би се илустровали латентни односи метаболита унутар групе и поремећених метаболичких односа међу групама. Црвени квадрати указују на значајнију позитивну корелацију. Плави квадрати указују на значајнију позитивну корелацију. Бели квадрати означавају корелацију без значаја. Анализа најрелевантнијих церебралних метаболичких путева и мрежа призваних као испитаници на ХСД извршена је помоћу алата МетабоАналист 3.0. За извршену анализу топологије пута, изабрана је библиотека путева сисара Раттус норвегицус (пацов). Овај приступ је такође коришћен за пружање процена утицаја на пут, стопе лажног откривања (ФДР) и п вредности.

Резултати Кортикални биохемијски индекси из ХСД и ЦОН група

Да би се потврдили ефекти метаболичке промене ХСД-а на мождана ткива, биохемијски параметри, укључујући метаболичке ензимске активности На-КАТП, АЦхЕ и ЛДХ, неуротрансмитера ДА, Е, НЕ, 5ХТ и ГАБА у вези са енергетским метаболизмом, и тхепротеини повезани са оксидативним стресомофСОД, МДА, и Гпк у ткивима ипсилатералног кортекса ХСД и ЦОН пацова су такође одређени (Табела 1). У поређењу са контролном групом, нивои ДА, Е, НЕ и МДА су значајно повећани, док је у ХСД моделу смањен садржај На-КАТП, АЦхЕ, ЛДХ, 5ХТ, ГАБА, СОД и Гпк. Граница детекције комплета за анализу коришћених у овом раду наведена је у табели С3 у фајлу додатних материјала.

Табела 1. Квантификација биохемијских параметара мерена је у ЦОН и ХСД животињама ткива кортекса помоћу ЕЛИСА са комплетима за анализу. (средња вредност ± СД). указује на статистичку значајност.

Метаболити идентификовани у 1Х НМР спектрима узорака можданог ткива

Слика 3 приказује три репрезентативна 1Х НМР спектра из кортекса (слика 3А), хипокампуса (слика 3Б) и стријатума (слика 3Ц) ХСД пацова. Према 1Х НМР подацима узорака можданог ткива идентификован је широк спектар истакнутих метаболита, а то су ањони органске киселине (лактат (Лац), малонат (Малн), сукцинат (Суц), малат (Мал), фумарат (ФМА). ), 2-хидроксибутират (2-ХБ), ацетат (Аце), формат (Фор), таурин (Тау), аскорбат (Асц), 2-хидроксибутират (2ХИБ)), аминокиселине (леуцин (Леу), изолеуцин (Иле), валин (Вал), аланин (Ала), глицин (Гли), тирозин (Тир), фенилаланин (Пхе), аспартат (Асп), глутамин (Глн), глутамат (Глу) , треонин (Тхр), серин (Сер), лизин (Лис), аспарагин (Асн)), неуротрансмитери (-аминобутират (ГАБА)), метаболити повезани са енергијом (креатин (Цре), аденозин трифосфат (АТП), аденозин монофосфат ( АМП)), метаболити сродни фосфолипидима (Офосфоетаноламин (ПЕА), О-фосфохолин (Пцхо), сн-глицеро-3-фосфохолин (ГПЦ)) и други (мио-инозитол (МИ), никотинамид аденин динуклеотид (НАД плус ), никотинична киселина (Ниц), Н-ацетиласпартат (НАА), никотинамид-аденин-динуклеотид фосфат (НАДП плус), УДП-Н- галактоза (УДПГа), уридин (Ури), урацил (Ура), цистидин (Цит) , уридин 5'- монофосфат (УМП), инозин 5'-монофосфат (ИМП), инозин (Ино), холин (Цхо), карнитин (Цар), глутатион (ГСХ). С1 Табела приказује детаљне информације о додели метаболита.

Промене метаболичког профила откривене метаболомском анализом

ПЦА, истраживачки и непристрасни приступ анализи 1Х НМР спектра из свих екстраката мозга у различитим регионима мозга, прво је направљен да открије главне метаболичке трендове изазване хипербаричном изложеношћу 400 мсв окружење засићења хелиоксом. Графикон распршења ПЦ1 у односу на ПЦ2 добијен из ПЦА (С1А–С1Ц слика) интегралних података у канти открио је одређену дискриминацију са одређеним преклапањем између ове две класификације. Надзирана истраживања модела ПЛС-ДА (С1А'–С1Ц' слика) и ОПЛС-ДА (слике 4А–4Ц) показала су јасну класну дискриминацију метаболичких профила између група. Слика 4 приказује графиконе резултата ОПЛС-ДА модела за регион кортекса (А), регион хипокампуса (Б) и регион стријатум (Ц), показујући јасну дискриминацију између ХСД група и контрола. Висока објашњена варијација и доброта предвиђања коју одражавају вредности Р2Кс и К2 (С1А'–С1Ц' слика, слика 4А-4Ц) и дијаграми теста пермутације (слика 4'-4Ц'А) указују на робусност генерисаних надгледаних модела. Коефицијент корелације (р) екстрахован из дијаграма С-линије, променљиве важности у пројекцији (ВИП) и п-вредност из непараметарских униваријатних тестова су прикупљени да би се проценили значајни метаболити одговорни за класно-дискриминаторне обрасце. Стога, испуњавајући било који од три критеријума (апсолутна вредност р већа од 0.50, вредност ВИП већа од 1.0, заједно са п вредношћу мањом од 0.05), одабрали смо панел статистички значајних метаболита (Табела 1) одговорна за раздвајање између ЦОН и ХСД група. У табели 1, вредности фолд-цханге веће од 1 указују на повећан ниво у ХСД групи, док вредности фолд-цханге мање од 1 указују на смањен ниво у ХСД групи. Средње вредности СД дискриминативних метаболита су наведене у табели С2. Користећи хијерархијску кластер анализу метаболита и метод просечног повезивања, генерисана топлотна мапа (Слике 5А–5Ц) са дендрограмима омогућава бољу визуализацију три метаболичке промене у региону мозга узроковане хипербаричном експозицијом у окружењу засићеном кисеоником хелијумом.

Метаболички поремећаји уочени у различитим регионима мозга ХСД пацова

Горе поменута мултиваријантна анализа и униваријантна анализа коришћењем висине метаболита у различитим групама пружиле су одличну радну цев за идентификацију дискриминативних метаболита откривајући потенцијалне неуролошке метаболичке промене повезане са ХСД догађајима. Повишени АМП, ФМА, Ниц и Пхе и смањење Ала, Асн, Цар, Цхо, Цит, ГАБА, ГСХ, Ино, Лац, Пцхо, Пхе, Тир, Ура и Ури пронађени су у ткиву кортекса ХСД група у поређењу са ЦОН групом (слика 5А, табела 1). У међувремену, у хипокампусу, Ала, ГСХ, Лац, Ури, Цит, ГАБА, Тир и Ура такође су се смањили, а АМП се повећао у ХСД групи, као иу кортексу. Штавише, повећани Тхр и смањени Гли, АТП, Тау, Имп, Суц, Асц и ДМА су изражени у екстрактима хипокампуса ХСД групе у односу на контроле (Слика 5Б, 5Д, Табела 1). У поређењу са групом ЦОНС, садржај Цит, ГАБА, Ура, Цхо и Тхр такође се смањио као и у кортексу и хипокампусу. Поред тога, повећани нивои аминокиселина разгранатог ланца (БЦАА, укључујући Леу, Иле, Вал) и Лис и смањени нивои Глн, НАА, НАД плус, НАДП плус, Асп, серије метаболита АТП, Тау, ИМП, и Суц, који се такође смањио у хипокампусу, и друга два метаболита, Ино и Пцхо, који су такође смањени у кортексу, примећени су у стријатумским ткивима пацова ХСД групе (Слика 5Ц, 5Д, Табела 1). Толико много метаболита увек указује на имплициране молекуларне путеве са сложеношћу и разноврсношћу. Интегралне вредности дискриминантних метаболита су квантификоване, а статистички значајне збирне промене њихових концентрација између хелиокс-сатурације-хипербарично изложене и контролне групе су сумиране у С2 табели и табели 2 за три региона мозга.

Слика 4. Ортогонална парцијална дискриминантна анализа најмањих квадрата (ОПЛС-ДА) графикони резултата и дијаграми теста пермутације који разликују ефекат изложености 400 мсв хелиоксу засићености на 1Х НМР спектре из контролних група у кортексу (ЦОНЦ, н=8, ХСДЦ, н=8, А и А') (Р2Кс=0.38; К2=0.46), хипокампус (ЦОНХ, н {{12} }, ХСДХ, н=8, Б и Б') (Р2Кс=0.37; К2=0.43) и стријатум (ЦОНС, н=8, ХСДС, н=8, Ц и Ц') (Р2Кс=0.39; К2=0.40). Вредности К2 параметра у графиконима ОПЛС-ДА резултата, које су биле једнаке или веће од 0,40, заједно са К2 вредностима крајње леве тачке у пермутираним моделима биле су веће од свих подешених К2 вредности десних тачака (пермутација тест 80 пута), што указује да су успостављени ОПЛС-ДА модели валидни.

Пцхо, који се такође смањио у кортексу, примећен је у стријатумским ткивима пацова ХСД групе (слика 5Ц, 5Д, табела 1). Толико много метаболита увек указује на имплициране молекуларне путеве са сложеношћу и разноврсношћу. Интегралне вредности дискриминантних метаболита су квантификоване, а статистички значајне збирне промене њихових концентрација између хелиокс-сатурације-хипербарично изложене и контролне групе су сумиране у С2 табели и табели 2 за три региона мозга.

Слика 5. Хеатмап и статистички корелациони дијаграми изведени из буцкет вредности дискриминаторних метаболита из кортекса (А, А', ХСДЦ узорци леже у горњем панелу, а ЦОНЦ лежи у доњем панелу), хипокампуса (Б, Б', ХСДХ група лежи у горњем панелу и ЦОНХ лежи у доњем панелу), и стријатум (Ц, Ц', ХСДС узорци леже у горњем панелу, а ЦОНС лежи у доњем панелу) ткива ХСД и ЦОН пацова. Метаболити на топлотној мапи су организовани хијерархијским груписањем на основу укупне сличности у обрасцима нивоа. Венов дијаграм (Д) који илуструје преклапање метаболита између ХСДЦ-ЦОНЦ, ХСДХ-ЦОНХ и ХСДС-ЦОНС поређења.

Анализа корелације метаболита

Однос између или између метаболита је био тако сложен на слици 5А'-5Ц'. За енергетске метаболите, позитивне корелације за Лац вс Ала у ХСДЦ, АМП вс ИМП у ХСДХ, АТП вс Пцхо у ХСДС, Суц вс ГАБА/Глн/Тир/НАА у ХСДС, и негативне корелације за Лац вс Тхр и ГСХ вс. Суц у ХСДХ, Суц вс Вал у ХСДС су били присутни у дијаграмима корелације метаболита. За неуротрансмитере, позитивне корелације за ГАБА наспрам Цар у ХСДЦ, ГАБА наспрам Цхо у ЦОНХ, и ГАБА наспрам Суц/Ино/Глн у ХСДС биле су присутне у дијаграмима корелације метаболита. Негативне корелације за ГАБА наспрам ФМА у ЦОНЦ и ГАБА наспрам НАА/Ура/НАДП плус у ЦОНС биле су присутне у дијаграмима корелације метаболита. За метаболите повезане саоксидативни стрес, тхепозитивне корелацијеза ГСХ вс Асн у ХСДЦ и ЦОНЦ, Тау вс Лац у ХСДХ, Тау вс Суц/Ала у ЦОНХ, негативне корелације за ГСХ вс Суц у ХСДХ, Тау вс Тхр у ХСДХ биле су присутне у корелацији метаболита парцеле.

Анализа метаболомског пута

Квантитативна анализа путања која се састоји од анализе обогаћивања путање и утицаја путање од топологије путање открила је високо статистички значајне модулације изазване ХСД-ом до серије метаболичких путева. Резултати утицаја путање, заједно са стопом лажног откривања (ФДР) и п вредностима, описани су на Слици 6. Сматрало се да су путеви значајно обогаћени ако су п вредности ниже од 0.05; профилисани метаболити (погоци) у односу на укупне метаболите пута (статус подударања) били су већи од 1; а резултати утицаја (који указују на утицај значајно погођених метаболита на пут на основу мере топологије мреже релативне централности између) били су већи од 0. Путеви у кортексу (слика 6А) са највећом вредношћу метаболичког утицаја су билифенилаланин, тирозин, ибиосинтеза триптофана>метаболизам фенилаланина> метаболизам пиримидина > метаболизам аланина, аспартата и глутамата. Путеви у хипокампусу (Слика 6Б) са највећим метаболичким утицајем били су биосинтеза фенилаланина, тирозина и триптофана > метаболизам глутатиона > метаболизам глицина, серина и треонина > метаболизам пурина > метаболизам пиримидина > метаболизам аланина и глутамата . Путеви у стриатуму (слика 6Ц) са највећим метаболичким утицајем били су метаболизам аланина, аспартата и глутамата > метаболизам никотината и никотинамида > метаболизам пурина.

Тражи више:

Е-пошта:wallence.suen@wecistanche.com

Вхатсапп/тел: плус 86 15292862950