Део 1: Актеозид супротставља интерлеукин-1 -индуковане катаболичке процесе кроз модулацију митоген-активираних протеинских киназа и НФκБ ћелијског сигналног пута

Актеозид супротставља катаболичке процесе изазване интерлеукином-1 - кроз модулацију протеин киназа активираних митогеном и НФκБ ћелијски сигнални пут

ХиангИ Лим, 1 До Киунг Ким, 1 Тае-Хиеон Ким, 1 Киеонг-Рок Канг, 1 Јеонг-Иеон Сео, 1,2 Сеунг Сик Цхо, 3 Иоунгхее Иун, 4,5 Ие-ионг Цхои, 4,5 Јунгтае Леем ,4,5 Хиоун-Воо Ким ,6 Геон-Унг Јо ,6

Цхан-Јин Ох ,6 Деук-Сил Ох ,6 Хонг-Сунг Цхун ,2 и Јае-Сунг Ким 1

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com

1 Институт за стоматолошке науке, Универзитет Цхосун, Гвангју 61452, Република Кореја

2 Одељења за биомедицинске науке, Универзитет Цхосун, Гвангју 61452, Република Кореја

3Одсек за биомедицину, науке о здрављу и конвергенцији живота, БК21 четири, Фармацеутски факултет, Национални универзитет Мокпо,

Јеоннам 58554, Република Кореја

4Цхунг-Иеон Медицал Институте, Гвангју 61949, Република Кореја

5 Институт за истраживање и развој, ЦИ Пхарма Цо., Сеул 06224, Република Кореја

6 Институт за шумске ресурсе Јеолланамдо, Нају, Јеолланамдо, 58213, Република Кореја

Преписку треба упутити на Јае-Сунг Ким; јс{{1}kim@chosun.ac.kr

Примљено 2. јула 2020.; Ревидирано 15. фебруара 2021; Прихваћено 6. марта 2021; Објављено 25. марта 2021

Академски уредник: Јоел Р. Древет

Ауторска права © 2021 ХиангИ Лим ет ал. Ово је чланак отвореног приступа који се дистрибуира под ЦреативеЦоммонсАттрибутионЛиценсе,

који дозвољава неограничену употребу, дистрибуцију,и репродукција у било ком медију, под условом да је оригинално дело правилно цитирано.

цистанцхе може лечити бубрежну болест, побољшати функцију бубрега

Остеоартритис (ОА) је најчешћа дегенеративна болест зглобова са хроничним болом у зглобовима узрокована прогресивном дегенерацијом зглобне хрскавице на синовијалним зглобовима.Ацтеосиде, кафеоилфенилетаноидни гликозид, има различите биолошке активности као што су антимикробни, антиинфламаторни, антиканцерогени, антиоксидативни, цитопротективни и неуропротективни ефекти. Даље, орална применаактеозидпри високим дозама не изазива генотоксичност. Стога је циљ ове студије да се верификује антикатаболички ефекатактеозидпротив остеоартритиса и његовог антикатаболичког сигналног пута.Ацтеосиденије смањио виталност ћелија Л929 мишјих фибробласта које се користе као нормалне ћелије и примарни хондроцити пацова.Ацтеосидесузбија губитак протеогликана изазван ИЛ-1 -у хондроцитима и зглобној хрскавици сузбијањем експресије и активације ензима који разграђују хрскавицу као што су матрикс металопротеиназа- (ММП-) 13, ММП-1 и ММП{{ 6}}. У наставку,актеозидпотисну експресију инфламаторних медијатора као што су индуцибилна синтаза азот оксида, циклооксигеназа-2, азот оксид и простагландин Е2 у примарним хондроцитима пацова третираним ИЛ-1. Након тога, експресија проинфламаторних цитокина је смањена заактеозиду примарним хондроцитима пацова третираним ИЛ-1. Штавише, актеозид је потиснуо не само фосфорилацију протеин киназа активираних митогеном у примарним хондроцитима пацова третираним ИЛ-1, већ и транслокацију НФκБ из цитосола у језгро кроз супресију његове фосфорилације. Орална примена 5 и 10 мг/кг актеозида је ублажила прогресивну дегенерацију зглобне хрскавице у моделу миша са остеоартритисом насталу дестабилизацијом медијалног менискуса. Наши налази показују да је актеозид обећавајући потенцијални антикатаболички агенс или додатак за ублажавање или спречавање прогресивне дегенерације зглобне хрскавице.

Молимо кликните овде до 2. дела

1. Представљање

Остеоартритис (ОА) је најчешћа дегенеративна болест зглобова са хроничним болом у зглобовима узрокована прогресивном дегенерацијом зглобне хрскавице на синовијалним зглобовима [1].

Због повећања очекиваног животног века, преваленција ОА са губитком покретљивости и хроничним болом у зглобовима узрокованим прогресивном дегенерацијом зглобне хрскавице на синовијалним зглобовима процењује се на 18 процената и 9,6 процената код жена након менопаузе и код мушкараца [2]. ]. Иако се преваленција ОА у свету повећава сваке године, патофизиолошка етиологија ОА је још увек непозната. Може бити узроковано веома сложеним и мултифакторским факторима ризика као што су старење, пол, генетско наслеђе, трауматске повреде зглобова и тешко механичко оптерећење зглобова. Штавише, неуропатолошки односи између прогресивне дегенерације зглобне хрскавице и развоја хроничног бола у зглобовима су непознати [3]. Дакле, циљ клиничког лечења пацијената са ОА је одржавање покретљивости тела и механичке функције зглобова кроз ублажавање хроничног бола у зглобовима, коришћењем фармаколошких и нефармаколошких приступа и операције замене зглобова. Потреба за развојем ефикасне интервенције или суплементације, са дуготрајном биолошком безбедношћу, како би се спречила или ублажила ОА како би се одржао квалитет живота кроз одржавање механичке функције зглобова код старије популације, расте.

Као што је приказано на слици 1,актеозид(ЦАС бр. 61276-17-3; Ц29Х36О15) је кафеоилфенилетаноид гликозид изолован из неколико биљних биљака као што су Вербасцум цхлоридес [4], Буддлеја глобоса [5] и Плантаго аустралис [6]. Ацтеоид има различите биолошке активности као што су антимикробно [5], антиинфламаторно [7], антиканцерогено [8], антиоксидативно [9], цитопротективно [9] и неуропротективно дејство [10]. Даље, орална применаактеозидпри високим дозама не изазива генотоксичност[11].

Дакле, претпоставили смо да актеозид са антиинфламаторном биолошком безбедношћу има антикатаболичке ефекте повезане са заштитом зглобне хрскавице од прогресивне дегенерације зглобне хрскавице кроз супресију катаболичких фактора као што су проинфламаторни цитокини, инфламаторна медијаторна синтеза и инфламаторна карцинома зглобова. . Стога је циљ ове студије био да се истражиактеозид-индуковане антикатаболичке ефекте и његов ћелијски сигнални пут како ин витро, користећи примарне хондроците изоловане из зглобне хрскавице коленског зглоба пацова, тако и ин виво, користећи ОА животињски модел генерисан хируршком дестабилизацијом медијалног менискуса у коленском зглобу мишева.

актеозидинцистанцхемоћипобољшатиимунитет

2. Методе

2.1. Ћелијска култура.

Примарни хондроцити пацова су изоловани из зглобне хрскавице коленских зглобова пацова (5-дан; Спрагуе-Давлеи) у складу са протоколом (ЦИА-ЦУЦ2019-А0027) који је одобрила институционална Комитет за негу и употребу животиња Универзитета Цхосун, Гвангју, Република Кореја. Изоловани примарни хондроцити пацова су одржавани у Дулбеццо-овој модификованој орловом медијуму/хранљивим смешама Ф-12 (ДМЕМ/Ф12) (Тхермо Сциентиfiц, Роцкфорд, ИЛ, УСА) са додатком 10 процената феталног говеђег серума (ФБС) (ФБС) , Гранд Исланд, НИ, САД), антибиотици (50У/мЛ пеницилина и 50уг/мЛ стрептомицина) и 50уг/мЛ аскорбинске киселине. Нормална ћелијска линија Л-929 фибробласта миша је купљена од Америцан Типе Цултуре Цоллецтион (АТЦЦ). Према упутствима добијеним од АТЦЦ, Л-929 ћелије су култивисане у Еагле-овом минималном есенцијалном медијуму, који садржи 10 процената ФБС, и узгајане су у влажном инкубатору на 37 степени са 5 процената ЦО2.

2.2. Тест виталности ћелија.

Тест диметил тиазолил дифенил тетразолијумове соли (МТТ) је изведен да би се проценила виталност ћелија Л929 ћелијске линије мишјих фибробласта које се користе као нормалне ћелије и примарних хондроцита пацова третираних актеозидом. Укратко, ћелије Л929 и примарни хондроцити пацова су култивисани при густини ћелија од 8×105 ћелија/мЛ у плочама за културу током 24 сата, а затим третирани са 2,5, 5, 10, 25, 50 и 100 μМактеозидза 24х. После третмана са МТТ раствором, и ћелије Л929 и хондроцити су даље култивисани током 4 сата. Након инкубације, формирани МТТ кристали су потпуно суспендовани у диметил сулфоксиду и мерена апсорпција на 570 нм коришћењем спектрометра (Епоцх микроплоча спектрофотометар, БиоТек®, Винооски, ВТ, УСА) да би се проценила виталност ћелија.

2.3. Целл Ливе/Деад Ассаи.

Преживљавање ћелија је обављено коришћењем комплета за тестирање Целл Ливе/Деад (Молецулар Пробес, Царлсбад, Калифорнија, САД), који се састоји од зеленог калцеина-АМ за обележавање живих ћелија (са зеленом флуоресценцијом) и етидијум хомодимера-1 за обележавање мртвих ћелије (са црвеном флуоресценцијом). Укратко, и ћелије Л929 и примарни хондроцити пацова су култивисани при густини ћелија од 8×105 ћелија/мЛ на стакалцима (Нунц® Лаб-Тек® Цхамбер Слиде™ систем; Сигма-Алдрицх; Мерцк КГаА) током 24 сата, а затим третирани са 50 и 100 μМ актеозида током 24 сата. Након култивације, извршено је испитивање преживљавања ћелија према упутствима произвођача. Након тога, обојене ћелије су снимљене помоћу флуоресцентног микроскопа (Ецлипсе ТЕ200; Никон Инструментс, Мелвилле, НИ).

2.4. Диметилметиленско плаво (ДММБ) тест.

ДММБ тест је изведен да би се проценила промена садржаја протеогликана у примарним хондроцитима пацова третираних актеозидом током 21 дана у присуству или одсуству ИЛ-1. Да би се одржале карактеристике примарних хондроцита пацова 21 дан, примарни хондроцити пацова (2 × 106 ћелија) су суспендовани у 1 мЛ 1,2 процентног алгината и затим инкапсулирани капањем суспензије ћелија/алгината у раствор од 105 мМ ЦаЦл2. Примарни хондроцити пацова инкапсулирани у алгинату су култивисани током 24 сата у ДМЕМ/Ф12 (који садрже 10 процената ФБС, 50У/мЛ пеницилина, 50уг/мЛ стрептомицина и 50уг/мЛ аскорбинске киселине), а затим прилагођени за ЕМ 24х/мл садрже проценат ДМ мини-инсулин–трансферин–селен (мини-ИТС) и 50 уг/мл аскорбинске киселине. Након тога, хондроцити су третирани са 50 или 100 μМактеозиду присуству или одсуству 1нг/мЛ ИЛ-1 током 21 дана. 21. дана, примарни хондроцити пацова су сакупљени за процену садржаја протеогликана коришћењем ДММБ теста, као што је претходно описано [12]. Поред тога, да би се квантификовао садржај протеогликана по ћелији и проценила пролиферација примарних хондроцита пацова, број ћелија је мерен ДНК тестом коришћењем ПицоГреен-а (Молецулар Пробес, Царлсбад, ЦА), према упутствима произвођача. присуство или одсуство 10 нг/мЛ ИЛ-1 током 7 дана. На крају периода културе, узорци су сакупљени и фиксирани у 4% параформалдехида током 72 сата за хистолошку анализу.

2.6. Хистолошка анализа.

Хистолошка анализа коришћењем сафранина-О и брзог зеленог бојења је извршена да би се потврдио губитак протеогликана у зглобној хрскавици третираној са 100 μМ актеозида у присуству или одсуству 10 нг/мЛ ИЛ-1 током 7 дана. Укратко, фиксирани узорци зглобне хрскавице су декалцификовани у етилендиаминтетрасирћетној киселини, а затим уграђени у парафин. Након тога, припремљени парафински блокови који садрже зглобну хрскавицу су серијски исечени на дебљину од 5 μм и стављени на стакалце. Сафранин-О и брзо зелено бојење су накнадно урађени да би се проценио губитак протеогликана у материји зглобне хрскавице. Поред тога, извршено је бојење хематоксилином и еозином да би се посматрала општа морфологија зглобне хрскавице.

2.7. Вестерн блоттинг.

Вестерн блотинг је спроведен да би се испитала експресија катаболичких фактора укључујући ММП-13, ММП-1, ММП-3, индуцибилну синтазу азот-оксида (иНОС) и циклооксигеназу-2 (ЦОКС -2) и промена ћелијских сигналних молекула као што су протеин киназе активиране митогеном и нуклеарни фактор-капа Б (НФκБ). Укратко, примарни хондроцити пацова су третирани са 50 или 100 μМ актеозида у присуству или одсуству 10 нг/мЛ ИЛ-1 током 24 сата. Након тога, примарни хондроцити пацова су сакупљени центрифугирањем и лизирани коришћењем пуфера за лизу (Целл Сигналинг Тецхнологи, Данверс, МА, САД) према упутствима произвођача. Поред тога, да би се потврдила нуклеарна транслокација НФκБ, примарни хондроцити пацова су третирани са 50 или 100 μМ актеозида у присуству или одсуству 10 нг/мЛ ИЛ-1 током 24 сата. Након тога, цитосолне и нуклеарне фракције су екстраховане коришћењем НЕ-ПЕР™ нуклеарних и цитоплазматских екстракционих реагенаса (Тхермо Сциентиfi, Роцкфорд, ИЛ, УСА) према упутствима произвођача. Концентрација укупног протеина екстрахованог из примарних хондроцита пацова одређена је коришћењем комплета за испитивање протеина бицинхонинске киселине (Тхермо Сциентифиц, Роцкфорд, ИЛ, УСА) према упутствима произвођача. Поред тога, кондиционирани медијум је сакупљен да би се открили нивои ензима који разграђују хрскавицу излучених из хондроцита. Једнаке количине протеина и кондиционираног медијума су подвргнуте електрофорези на натријум додецил сулфат-полиакриламид гел електрофорези (СДС-ПАГЕ), а затим пренете на нитроцелулозне мембране. Након тога, вестерн блотинг је изведен коришћењем циљаних примарних антитела против ММП-13, ММП-1, ММП-3, иНОС, ЦОКС-2, фосфо-ЕРК1/2, тотал -ЕРК1/2, фосфо-п38, тотал-п38, фосфо-ЈНК, укупни ЈНК, фосфо-НФκБ, укупни НФκБ, - актин и ламин Б. Имунореактивне траке су визуелизоване коришћењем побољшаног система хемилуминисценције (Тхермо Сци- fiц, Роцкфорд , ИЛ, САД) према упутству произвођача, а затим снимљено Мицроцхеми уређајем (ДНР Биоимагинг Системс, Јерусалим, Израел).

2.8. Квантитативна ланчана реакција полимеразе (кПЦР) и квантитативна ПЦР у реалном времену (кРТ-ПЦР).

Примарни хондроцити пацова су третирани са 50 или 100 μМактеозиду присуству или одсуству 10нг/мЛ ИЛ-1 током 24х. Након тога, укупна РНК је изолована из примарних хондроцита пацова коришћењем ТРИзол реагенса (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, УСА) према упутствима произвођача. Укупна концентрација РНК је мерена коришћењем НаноДроп 2000 (Тхермо Сциентифиц, Роцкфорд, ИЛ, УСА). Да би се синтетизовала цДНК, 1 уг РНК је реверзно транскрибовано коришћењем ТхермоСцрипт система реверзне транскрипције-ПЦР (Инвитроген, Царлсбад, Калифорнија, САД) према упутствима произвођача. кПЦР цДНК је изведен коришћењем 2× ТОПсимпле™ ДиеМИКС-Так (Ензиномицс, Сеул, Република Кореја) и специфичних прајмера на ТаКаРа ПЦР Тхермал Цицлер уређају (ТаКаРа Био Инц., Схига, Јапан). Након тога, ПЦР производи су подвргнути електрофорези на агарозном гелу да би се одредили нивои експресије циљних гена. Глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа (ГАПДХ) је коришћена као ендогена контрола. Поред тога, за кРТ-ПЦР, цДНК је амплиfiкована коришћењем Ецо™ ПЦР система у реалном времену (иллумине Инц., Сан Диего, Калифорнија, САД). -Актин је коришћен као ендогена контрола. Секвенце прајмера коришћених у кПЦР и кРТ-ПЦР сумиране су у табелама 1 и 2, респективно.

2.9. Желатин Зимограпхи.

Урађена је желатинска зимографија да би се проценила активација ММП у примарним хондроцитима пацова. Укратко, примарни хондроцити пацова су третирани са 50 или 100μМ актеозида у присуству или одсуству 10нг/мЛ ИЛ-1 током 24 часа. Након тога, једнака запремина кондиционираног медијума је подвргнута електрофорези на 10% полиакриламидном гелу кополимеризованом са 0,2% (1мг/мЛ) желатина од свињске коже. Након електрофорезе, гел је инкубиран у пуферу за ренатурисање зимограма (50 мМ Трис-ХЦл (пХ7,6), 10 мМ ЦаЦл2, 50 мМ НаЦл и 0,05 процената Бриј-35) на 37 степени током 72 сата. Након ренатурације ММП-а, гел је обојен са 0,1% Цоомассие Бриллиант Блуе Р250. Желатинолитичке траке су откривене као јасне траке на позадини једнолично обојене светлоплавом, а затим снимљене дигиталном камером.

2.10. Мерење азотног оксида (НО).

Примарни хондроцити пацова су третирани са 50 или 100 μМ актеозида у присуству или одсуству 10 нг/мЛ ИЛ-1 током 24 сата. Након тога, 50 μЛ кондиционираног медијума је реаговало са по 50 μЛ сулфаниламида и Н-1-нафтил етилендиамин дихидрохлорида. Апсорбанца је затим мерена на таласној дужини од 540 нм коришћењем спектрофотометра (Епоцх Спецтропхотометер, БиоТек, Винооски, ВТ, УСА).

2.11. Простагландин Е2 (ПГЕ2) тест.

Примарни хондроцити пацова су третирани са 50 или 100 μМактеозиду присуству или одсуству 10нг/мЛ ИЛ-1 током 24х. Након тога, концентрација ПГЕ2 је мерена коришћењем комплета за анализу параметара ПГЕ2 (Р&Д Системс Инц., Миннеаполис, МН, САД) према упутствима произвођача.

2.12. Цитокине Арраи.

Примарни хондроцити пацова су третирани са 50 μМ актеозида у присуству или одсуству 10 нг/мЛ ИЛ-1 током 24 сата. Након тога, укупни протеини су екстраховани и квантификовани као што је претходно описано [13]. Затим је урађен низ цитокина да би се истражила промена у производњи цитокина, према упутствима произвођача (РаиБиотецх, Инц., Норцросс, ГА, УСА).

2.13. Тест нуклеарне транслокације.

Примарни хондроцити пацова су третирани са 50 и 100 уг/мЛактеозиду присуству 10нг/мЛ ИЛ-1. После 30 минута, примарни хондроцити пацова су фиксирани са 1 процентом параформалдехида, пермеабилизовани у 0,2 процента Тритон Кс-100 и опсежно испрани физиолошким раствором пуферисаним фосфатом. Неспецифични сигнали су блокирани коришћењем нормалног козјег серума. Након вишеструког испирања, хондроцити су инкубирани са зечјим анти-НФкБ антителима, након чега је уследила инкубација са ФИТЦ-коњугованим козјим анти-зечјим ИгГ (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА) преко ноћи на 4 степена. Након тога, обојене ћелије су снимљене коришћењем система ласерског конфокалног скенирајућег микроскопа (Леица Мицросистемс, Ветзлар, Немачка) у Гвангју филијали Корејског института за основне науке (Гвангју, Република Кореја).

2.14. Генерација животиња са остеоартритисом.

Да би се створиле животиње са остеоартритисом, медијални менискус (ДММ) је хируршки дестабилизован у зглобовима колена БАЛБ/ц мишева (просечна телесна тежина 19:3±0:5г) у складу са смерницама ИАЦУЦ (ЦИАЦУЦ{{4} }А0029). Животиње изазване ОА су третиране орално са 5 и 10 мг/кг актеозида раствореним у 5 процената етанола (експериментална група; н =5) или носача (5 процената етанола) (ДММ група; н =5) сваки други дан 8 недеља. На крају периода културе, зглобови колена су сецирани и фиксирани коришћењем 5% параформалдехида током 7 дана да би се извршиле хистолошке процене. Након бојења сафранином-О и брзог зеленог бојења, сликана ткива зглобне хрскавице су прегледана у складу са оценом Манкин [14, 15].

2.15. Статистичка анализа.

Експериментални подаци су представљени као средња вредност ± стандардна девијација и упоређени су коришћењем анализе варијансе, праћене пост хоц вишеструким упоређивањем (Тукеи-јев тест) коришћењем СПСС софтвера верзије 25 (ИБМ Цорп.). Сви подаци, осим студије на животињама, су добијени из три независна експеримента.

актеозидинцистанцхе

3. Резултати

3.1. Актеозид не утиче на виталност ћелија Л929 и примарних хондроцита пацова.

Ћелијска линија мишјег фибробласта Л929 коришћена као нормалне ћелије третирана је са 2,5, 5, 10, 25, 50 и 100 μМ актеозида током 24 сата. Након тога, МТТ тест је изведен да би се проценила цитотоксичност актеозида на Л929 ћелије. Као што је приказано на слици 2(а), утврђено је да је релативна виталност ћелија Л929 94:8±8 процената, 93:6±7 процената, 100±5 процената, 103:9±5 процената, 126:1±8 процената. и 122:7±4 процента при 2,5, 5, 10, 25, 50 и 100 μМ актеозида, респективно, у поређењу са контролом (100:02 ± 3 процента). Даље, да би се потврдила цитотоксичност актеозида на примарним хондроцитима пацова, МТТ тест је изведен као што је приказано на слици 2(б). Вибилности примарних хондроцита пацова третираних са 2,5, 5, 10, 25, 50 и 100 μМ актеозида су одређене као 114 ± 4 процента, 117:8 ± 6 процената, 123:9 ± 5 процената, 132:6±4 процената, 153:1±7 процената, односно 142:1±6 процената, у поређењу са контролом (100:4±5 процената). Штавише, да би се потврдио ефекат актеозида на одрживост и ћелија Л929 и примарних хондроцита пацова, изведен је тест Целл Ливе/Деад као што је приказано на слици 2(ц). Број мртвих ћелија обојених као црвена флуоресценција није се повећао и за ћелије Л929 и за примарне хондроците пацова третиране са 50 и 100 μМ актеозида током 24 сата. Ови подаци су доследно показали да је дефинисана дозаактеозидније утицало на одрживост ћелија Л929 и примарних хондроцита пацова. Дакле, 50 μМ актеозид и 100 μМ актеозид, који су нетоксичне дозе у ћелијама Л929 и примарним хондроцитима пацова, коришћени су да би се потврдили његови антикатаболички ефекти ин витро студија коришћењем примарних хондроцита пацова.

3.2. Актеозид делује против губитка протеогликана изазваног ИЛ-1 -у примарним хондроцитима пацова.

Примарни хондроцити пацова уграђени у перле алгината третирани су са 50 и 100 μМ актеозида у присуству или одсуству 1 нг/мЛ ИЛ- 1 током 21 дана. Након тога, изведен је ДММБ тест да би се проценила промена садржаја протеогликана као што је приказано на слици 3(а). Релативни садржај протеогликана је одређен као 88:3±18:1 проценат и 86:8±16:3 процената у примарним хондроцитима пацова третираним са 50 и 100 μМ актеозида, респективно, у поређењу са контролом (103:8± 32:3 одсто). Иако је релативни садржај протеогликана смањен актеозидом, ови резултати нису били значајни. Међутим, релативни садржај протеогликана је значајно смањен за 37:1±14:7 процената у примарним хондроцитима пацова третираним са 1нг/мЛ ИЛ-1, али 50 и 100μМ актеозида значајно смањују садржај протеогликана за 127: проценат и 64 ± 14:5 процената, респективно, у присуству 1нг/мЛ ИЛ-1. Затим, да би се проверило да ли актеозид потискује губитак протеогликана изазван ИЛ-1 -, зглобна хрскавица сецирана из зглобова колена пацова третирана је са 100 μМ актеозида у присуству или одсуству 10нг/мЛ ИЛ-1 током 7 дана. Након тога, извршене су хистолошке процене коришћењем Х&Е бојења и сафранин-О и брзог зеленог бојења као што је приказано на слици 3(б). Морфолошка промена није примећена коришћењем Х&Е бојења; међутим, сафранин-О и брзо зелено бојење открили су да се протеогликан обојен црвеном бојом није променио у зглобним хрскавицама третираним са 100 μМ актеозида у поређењу са оним у контроли. Међутим, озбиљан губитак протеогликана је изазван 10 нг/мЛИЛ-1 у зглобној хрскавици, а 100 μМ актеозида је значајно потиснуо губитак протеогликана у зглобној хрскавици третираној са 10 нг/мЛ ИЛ- 1. Заједно, ови подаци доследно показују да актеозид има антикатаболички ефекат који успорава дегенерацију зглобне хрскавице кроз супротстављање ИЛ-1 -индукованом губитку протеогликана.

актеозидинцистанцхеимају добре ефекте наантиоксиданс

3.3. Актеозид има антикатаболички ефекат који потискује експресију и активацију ММП у примарним хондроцитима пацова третираним ИЛ-1.

Да би се истражило да ли је антикатаболички ефекат изазван актеозидом повезан са супресијом експресије и активације ММП, примарни хондроцити пацова су третирани са 50 и 100 μМ актеозида у присуству или одсуству 10 нг/мЛ ИЛ-1 током 24 сата. Након тога, истражене су промене у ММП. Као што је приказано на слици 4(а), иако је експресија ензима који разграђују хрскавицу као што су ММП-13, ММП-1 и ММП-3 значајно повећана у кондиционираној подлози примарног пацова хондроцити третирани са 10нг/мЛ ИЛ-1, смањен је заактеозидна начин који зависи од дозе. Штавише, резултати и кПЦР (слика 4(б)) и кРТ-ПЦР (слика 4(ц)) открили су да ИЛ-1 значајно повећава нивое мРНА ММП-а као што су ММП-13, ММП{ {6}} и ММП-3 у примарним хондроцитима пацова. Међутим, они су се смањивали у зависности од дозе у примарним хондроцитима пацова третираних са 50 и 100 μМ актеозида. Штавише, 50 и 100 μМ актеозид је ефикасно потиснуо активацију ММП у примарним хондроцитима пацова третираним са 10 нг/мЛ ИЛ-1 (Слика 4(д)). Узети заједно, ови подаци доследно указују на то да актеозид има антикатаболички ефекат који потискује експресију и активацију ензима који разграђују хрскавицу.