Део 1: Епигенетска регулација циркадијалног гена Пер1 доприноси променама у хипокампалном памћењу везаним за старење
Mar 19, 2022
Контакт: Аудреи Хуaudrey.hu@wecistanche.com
Јанине Л. Квапис1,2,3, Иасаман Алагхбанд1,2, Енико А. Крамар1,2, Алберто Ј. Лопез1,2, Анние Вогел Циерниа4, Андре О. Вхите5, Гуанхуа Сху1,2, Диане Рхее1,2,
Цхристина М. Мицхаел1,2, Емилие Монтеллиер6, Иу Лиу7,8, Цхристопхе Н. Магнан7,8, Сивеи Цхен7,8, Паоло Сасоне-Цорси6, Пиерре Балди7,8, Дина П. Матхеос1,2 и Марцело А. Воод1,2 ,3
Старење је праћено поремећајима циркадијалног ритма и дуготрајниммеморија. Иако је јасно дамеморијана перформансе утичу циркадијални циклуси, није познато да ли поремећај циркадијалног сата повезан са узрастом узрокује оштећење хипокампусамеморија. Овде показујемо да репресивна хистон деацетилаза ХДАЦ3 ограничава дуготрајну меморију, синаптичку пластичност и искуство изазвану експресију циркадијалног гена Перлин у хипокампусу старења без утицаја на ритмичке циркадијалне обрасце активности. Такође показујемо да је хипокампални Пер] критичан за дугорочномеморијаформација. Заједно, наши подаци оспоравају традиционалну идеју да промене у језгру циркадијалног сата доводе до циркадијанских промена умеморијаформирање и уместо тога залажу се за аутономнију улогу функције гена циркадијалног сата у ћелијама хипокампуса да би се утврдила вероватноћа формирања дугорочне меморије.
Цистанцхе може побољшати памћење
Животиње имају унутрашњи циркадијални сат који покреће ритмички циклус биолошких процеса свака ~24 сата. Циркадијални ритмови покрећу бројне физиолошке догађаје, укључујући циклус спавања и буђења, понашање при храњењу, телесну температуру и метаболизам. У главном циркадијалном сату, супрахијазматском језгру (СЦН), група гена језгра сата осцилује у негативној повратној спрези која кружи сваких ~24 х1,2. Осим што регулише основне биолошке процесе, циркадијални сат такође има снажан утицај намеморија. Дугорочна меморија, која је зависна од транскрипције, показује снажан ефекат у току дана, са вршним перформансама меморије током дана (неактивна фаза) код мишева3,4. Приметно, обоје дугорочномеморијаи циркадијални ритмичност су поремећени са годинама5, што сугерише да заједнички молекуларни механизми могу бити у основи оба процеса. Једна идеја је да се гени сата налазе умеморија-релевантне структуре, као што је дорзални хипокампус, могу да блокирају способност животиње да се формира дугорочномеморијана основу доба дана6. У складу са овим, поремећај неколико појединачних гена сата у целом мозгу може нарушити хипокампално дуготрајно памћење код младих животиња. Како ниједна студија до данас није селективно пореметила циркадијалну функцију гена у дорзалном хипокампусу, нејасно је да ли гени сата делују у ћелијама хипокампуса да утичу на дугорочномеморијаформирање или да ли су ови дефицити памћења резултат ефеката који нису циљани у другим регионима мозга, као што су поремећени циркадијални ритмови, недостатак сна или чак развојне абнормалности.
Експресија гена је смањена у мозгу који стари, што може бити последица репресивније структуре хроматина. Транскрипција се делимично контролише кроз промене у структури хроматина, што може динамички да унапреди или ограничи приступ неуронској ДНК након догађаја учења. Једна хипотеза коју су изнели Барнс и Свит тврди да се епигеном мења у неуронима који старе, што резултира репресивном структуром хроматина која спречава нормалну експресију гена потребну за формирање дуготрајне меморије7. Неколико студија подржава ову идеју показујући измењене механизме модификације хистона у мозгу који стари8–10. Међутим, да ли механизми модификације хроматина абнормално регулишу циркадијалну експресију гена у кључном учењу имеморијарегион мозга је непознат. Овде смо испитали ову могућност фокусирајући се на улогу хистон деацетилазе 3 (ХДАЦ3) зависне регулације памћења и експресије гена везаних за узраст. Открили смо да брисање или поремећај ХДАЦ3 у дорзалном хипокампусу побољшава оштећења у дуготрајној меморији и синаптичкој пластичности код 18-месечних мишева повезаних са старењем, што је ефекат за који се чини да делимично посредује централни циркадијални сат ген Период1 (Пер1). Уопштено говорећи, овај рад сугерише да Пер1 може бити механизам који доприноси оштећењима везаним за старење и на дужи рок.меморијаи циркадијална ритмичност, у зависности од структуре.
Резултати
ХДАЦ3 доприноси узрастумеморијаоштећења. Прво смо тестирали да ли репресивна хистон деацетилаза ХДАЦ3 игра улогу умеморијаодбити. ХДАЦ3 је моћан негативни регулатор формирања меморије и поремећај ХДАЦ3 код младих животиња може трансформисати догађај учења испод прага у један који генерише упорну дугорочну меморију за више задатака11–14. Користили смо две методе ометања ХДАЦ3 у дорзалном хипокампусу старијих (18-месечних) мишева. Прво смо направили фокалне хомозиготне делеције ХДАЦ3 инфузијом ААВ2.{10}}ЦаМКИИ-Цре рекомбиназе (1 μЛ по страни) у дорзални хипокампус ХДАЦ3флок/флок мишева (додатна слика 1а). Друго, да бисмо селективно блокирали ензимску активност ХДАЦ3, користили смо доминантно негативан тачкасти мутантни вирус, ААВ2.{18}}ЦМВ-ХДАЦ3(И298Х)-в5 који специфично блокира активност ХДАЦ3 деацетилазе без утицаја на интеракције протеин-протеин (видети реф. 12,15–17 Додатна слика 1б). Вируси су убризгани дванедељама пре тренинга, омогућавајући чврсту просторну и временску контролу над нашим ХДАЦ3 манипулацијама како би се избегли потенцијални нежељени ефекти који се могу јавити услед продуженог прекида ХДАЦ3 током развоја18,19. Две недеље након инфузије ААВ-ЦаМКИИ-Цре (додатна слика 1ц), приметили смо да на експресију мРНА Хдац3 није утицала обука на локацији објектамеморија(ОЛМ), али генетско брисање хипокампалног Хдац3 пореметило је експресију Хдац3 мРНА (додатна слика 1д) поред ХДАЦ3 протеина (додатна слика 1а).
Да бисте утврдили да ли се брисање ХДАЦ3 побољшавамеморијакод старијих мишева, тестирали смо ефекте делеције ХДАЦ3 хипокампуса (ХДАЦ3флок/флок) или поремећаја активности (ХДАЦ3 (И298Х)) на дуготрајну меморију за ОЛМ (слика 1а). У складу са бројним извештајима о недостатку памћења хипокампуса у вези са узрастом, открили смо да старење, 18-мо дивљи тип (ХДАЦ3 плус / плус) мишеви показују слабо памћење на ОЛМ након 10-мин тренинга, не показујући значајно повећање у ДИ између тренинга и тестирања (слика 1б, сиве траке). Важно је да 10-минута тренинга.
2 КОМУНИКАЦИЈЕ У ПРИРОДИ|(2018)9:3323 |ДОИ: 10.1038/с41467-018-05868-0 |ввв.натуре.цом/натурецоммуницатионс
Слика 1 Брисањем или ометањем ХДАЦ3 побољшавају се оштећења хипокампалне меморије повезана са старењем. ОЛМ процедура. ААВ је инфундиран 2 недеље пре тренинга. б 18-мо ХДАЦ3флок/флок мишеви су показали значајно бољу меморију за ОЛМ у поређењу са дивљим типом (ХДАЦ3 плус / плус ) легла (двосмерна АНОВА: значајна интеракција генотип к сесија (Ф(1,29) {{1{ {12}}}.96, п < 0.001),="" сидакови="" постхоц="" тестови,="" ***п="">< 0.001,="" н="" {{="" 16}}(5ф),="" 17(6ф)).="" ц="" укупно="" истраживање="" је="" било="" слично="" за="" обе="" групе="" на="" тесту="" (т(29)="1.67," ***п="0.11)." д="" ометање="" хдац3="" активности="" у="" дорзалном="" хипокампусу="" помоћу="" аав-хдац3="" (и298х)-в5="" такође="" је="" побољшало="" оштећења="" хипокампалне="" меморије="" код="" 18-мој="" мишева="" (двосмерна="" анова:="" главни="" ефекат="" сесије="" (ф(1,16)="" {{35="" }}.96,="" п="">< 0,001),="" сидакови="" пост="" хоц="" тестови,="" ***п="">< 0,001,="" *п="">< 0,05,="" н="9,10;" сви="" мушкарци).="" е="" укупно="" време="" истраживања="" је="" било="" слично="" за="" обе="" групе="" на="" тесту="" (т(16)="0.28," п="0.78)." ф="" орм="" експериментална="" процедура,="" 2="" недеље="" након="" завршетка="" олм.="" г="" и="" 18-мо="" хдац3флок/флок="" мишеви="" и="" хдац3="" плус/плус="" другови="" у="" леглу="" показали="" су="" малу="" предност="" према="" новом="" објекту="" (двосмерна="" анова,="" без="" главних="" ефеката="" или="" интеракције,="" н="14(5" ф),="" 17(="" 6="" ф)).="" х="" укупно="" време="" истраживања="" је="" било="" слично="" за="" обе="" групе="" на="" тесту="" (т(29)="0.59," п="0.56)." и="" ометање="" хдац3="" активности="" у="" дорзалном="" хипокампусу="" помоћу="" аав-хдац3(и298х)="" такође="" није="" имало="" утицаја="" на="" орм,="" при="" чему="" ниједна="" група="" није="" показала="" преференцију="" за="" нови="" објекат="" (двосмерна="" анова,="" без="" главних="" ефеката="" или="" интеракције,="" н="9" ,10;="" сви="" мушкарци).="" ј="" групе="" су="" показале="" слично="" укупно="" време="" истраживања="" на="" тесту="" (т(16)="0.28," п="0.78)." подаци="" су="" представљени="" као="" средња="" вредност="" ±="" сем;="" црни="" кругови,="" мужјаци;="" сиви="" квадрати,="" женке="" нормално="" производе="" јаку="" дугорочну="" меморију="" код="" младих="" мишева20.="" насупрот="" томе,="" 18-мо="" хдац3флок/флок="" легла="" су="" формирала="" робусну="" дуготрајну="" меморију="" (слика="" 1б,="" црне="" траке),="" са="" значајним="" повећањем="" преференције="" према="" покретном="" објекту="" у="" мировању="" у="" односу="" на="" тренинг.="" хдац3флок/флок="" мишеви="" су="" показали="" значајно="" већи="" ди="" на="" тесту="" од="" хдац3="" плус/плус="" мишева="" упркос="" сличним="" нивоима="" укупног="" истраживања="" током="" тест="" сесије="" (слика="" 1ц).="" приметили="" смо="" сличне="" ефекте="" код="" вируса="" аав-хдац3(и298х)="" специфичног="" за="" активност.="" контролни="" мишеви="" са="" 18-мопразним="" вектором="" (ев)="" показали="" су="" слабо="" памћење="" за="" олм,="" док="" су="" мишеви="" који="" су="" унесени="" аав-хдац3="" (и298х)="" у="" дх="" показали="" значајно="" већу="" преференцију="" према="" покретном="" објекту="" без="" промене="" у="" укупном="" истраживању="" (сл.="" 1д,="" е).="" за="" разлику="" од="" лошег="" дугорочног="" памћења="" уоченог="" код="" 18-мо="" дивљих="">
(Сл. 1б, д), краткорочно памћење за ОЛМ (тестирано 60 м после
аквизиција; Додатна слика 2а) била је нетакнута за ХДАЦ3 плус / плус и ХДАЦ3флок / флок мишеве (додатна слика 2б, ц) и није било значајне разлике у анксиозности између ових група (додатна слика 2д). Такође нисмо приметили значајну разлику у кретању између група током хабитуације (додатне слике 2е, ф, 8а, б). Заједно, ови резултати показују да се оштећења везана за узраст у ОЛМ-у побољшавају брисањем или прекидом ХДАЦ3 у дорзалном хипокампусу.
Затим смо тестирали да ли наша фокусна ХДАЦ3 манипулација утиче на препознавање објекатамеморија(ОРМ), који не захтева дорзални хипокампус за преузимање20. У овом задатку, један познати објекат је замењен новим предметом (слика 1ф). Брисање ХДАЦ3 у дорзалном хипокампусу није спасломеморијаза ОРМ, при чему и ХДАЦ3 плус / плус и ХДАЦ3флок/флок мишеви не показују преференцију за нови објекат на тесту у поређењу са тренингом (слика 1г). Опет, групе се нису разликовале у укупним нивоима истраживања током тест сесије (слика 1х). Слично томе, поремећај ХДАЦ3 у хипокампусу специфичан за активност није био у стању да ублажи оштећења ОРМ-а повезана са узрастом (Слика 1и, ј). Дакле, оштећења везана за узраст у дуготрајном ОРМ-у нису побољшана брисањем хипокампуса или поремећајем ХДАЦ3.
Заједно, наши резултати показују да брисање или поремећај ХДАЦ3 у дорзалном хипокампусу може дугорочно побољшати старењемеморијадефицити за задатак зависан од хипокампуса (ОЛМ; сл. 1а–е) без утицаја на меморију за задатак независан од хипокампуса (ОРМ; сл. 1ф–ј). Важно је да су сви мишеви краткорочно показали нетакнутимеморијаза ОЛМ (додатна слика 2), што сугерише да ове животиње нормално стичу памћење, али не успевају да консолидују ове информације у видљиве дугорочнемеморија. Пошто је краткорочно памћење независно од транскрипције (за преглед21), овај налаз је у складу са идејом да се експресија гена изазвана учењем мења код старијих мишева, што доводи до оштећења дуготрајног памћења везаних за узраст.
Поремећај ХДАЦ3 поништава оштећења везана за узраст у ЛТП.
Да бисмо тестирали да ли ХДАЦ3 такође доприноси оштећењима синаптичке пластичности везаним за узраст, испитали смо дуготрајну потенцирање (ЛТП) у акутним резовима хипокампуса након брисања или прекида ХДАЦ3. ЛТП је такође оштећен са годинама, посебно када је протокол стимулације близу прага индукције ЛТП22. Две недеље након вирусне инфузије, припремили смо резове хипокампуса и индуковали ЛТП са једним низом од 5 тхета рафала до Сцхаффер колатералних улаза и снимили ЕПСП поља из апикалних дендрита ЦА1б. Овај релативно благ облик стимулације произвео је стабилан ниво ЛТП у младим ХДАЦ3 плус / плус резовима (слика 2а). Брисањем ХДАЦ3 у хипокампусу је побољшан ЛТП, при чему ХДАЦ3флок/флок мишеви показују значајно већу потенцирање од контрола дивљег типа. Као што је предвиђено, старење-18-мо ХДАЦ3 плус/плус мишеви показали су ослабљен ЛТП и делеција ХДАЦ3 је ублажила овај недостатак, производећи ЛТП упоредиву са оним код младих мишева дивљег типа (Слика 2б, ц) без утицаја на почетну синаптичку линију пренос (сл. 2г, х).
Приметили смо сличне резултате са поремећајем специфичним за активност. Овде смо користили дизајн унутар субјеката у којем су млади и стари мишеви дивљег типа инфузирани са контролним вирусом (ААВ-ЕВ) у један хипокампус и ААВ-ХДАЦ3 (И298Х) у контралатерални хипокампус. Као и раније, открили смо да је нарушавање активности ХДАЦ3 побољшало ЛТП у резовима младих мишева (слика 2д) и побољшало оштећења ЛТП-а повезана са старењем у резовима старијих мишева (слика 2е, ф) без ометања почетне синаптичке трансмисије (слика 2и). , ј). Или брисање или прекид ХДАЦ3 стога може побољшати оштећења повезана са старењем у хипокампалном ЛТП.
Подскуп гена оштећених у старости је побољшан брисањем ХДАЦ3. Наши подаци сугеришу да брисање или ометање ХДАЦ3 побољшава оштећења у дуготрајној меморији и синаптичкој пластичности повезана са старењем. Затим смо питали да ли се дефицити у експресији гена хипокампуса такође могу побољшати брисањем ХДАЦ3. Претпоставили смо да дисрегулација активности ХДАЦ3 у старом мозгу доводи до необично репресивне структуре хроматина која ограничава експресију гена, што на крају нарушава дугорочномеморија. Да бисмо идентификовали које специфичне гене регулише ХДАЦ3 у младом и остарелом мозгу, извели смо експеримент секвенционирања РНК у коме смо упоредили младе (3- мес.) мишеве дивљег типа, старење (18- мес.) ХДАЦ3 плус / плус мишеви и стари (18- мес.) ХДАЦ3флок/флок легла. Да би се идентификовале промене у експресији гена токоммеморијаконсолидацијом, животиње у свакој групи су убијене 60 м после 10-мин ОЛМ тренинга и упоређене са контролама у кућном кавезу (ХЦ). Након мапирања и разматрања хаплоидног генома23,24, процењен је квалитет секвенцирања (додатна слика 3а, б) и испитане су значајне разлике у профилима експресије између свих парова узорака за п <>
Очекивали смо да ће експресија гена изазвана искуством бити измењена у старом мозгу, као што је претходно описано, са подскупом гена који не успе да се експресује након учења. Стога смо се фокусирали на оне гене који су експримирани на значајно вишим нивоима у обученим групама у поређењу са контролама у кућном кавезу. Док је свака група (Иоунг ВТ, Олд ВТ, Олд ХДАЦ3флок/флок) показала значајан број гена индукованих ОЛМ тренингом, свака група је показала јединствени профил експресије гена (слика 3а, додатне табеле 1-3). Стари мозговиповећана регулација и код младих дивљих и старих ХДАЦ3флок/флок група које не показују повећање изазвано искуством у хипокампусу старог дивљег типа. Ово су гени који не успевају нормално да се експримирају у старом мозгу након ОЛМ тренинга, али су спашени брисањем ХДАЦ3 и стога могу функционисати као механизам кроз који брисање ХДАЦ3 побољшава оштећења памћења повезана са узрастом. У овој групи су идентификована четири гена: Нр4а1, Егр1, Тсц22д3 и Пер1. Сви ови гени су широко укључени у формирање меморије6,26,27, иако је ово прва студија која показује да је експресија ових гена изазвана искуством оштећена са годинама и спасена брисањем ХДАЦ3.
Брисањем ХДАЦ3 ублажавају се дефицити везани за узраст у Пер1. Од гена идентификованих кроз наш РНА-сек, Период1 (Пер1) је био најјаче индукован ОЛМ тренингом у групи ХДАЦ3флок/флок (слика 3ц). Овај циљ је посебно интригантан, јер се Пер1 обично проучава у контексту циркадијалних ритмова, али је такође укључен у хипокампалнимеморијаформација6,28,29. Пошто је познато да је старење праћено оштећењима циркадијалних ритмова5 и памћење је повезано са временом дана2,30, овај циљ ХДАЦ3 може представљати критичан и недовољно истражен интерфејс између старења, модификације хроматина и циркадијалног сата.
Да бисмо даље испитали експресију Пер1 код старих ХДАЦ3 плус / плус и старих ХДАЦ3флок / флок животиња, користили смо РТ-кПЦР и ЦхИП-кПЦР. Открили смо да ОЛМ тренинг није успео да изазове повећање регулације Пер1 у дорзалном хипокампусу 18-мо ХДАЦ3 плус / плус мишева, али у одсуству ХДАЦ3 (ХДАЦ3флок/флок), ОЛМ тренинг је изазвао значајно повећање Пер1 мРНА ( Слика 3ф). Такође смо измерили експресију два додатна гена која дугорочно играју добро документовану улогумеморијаформирање: Арц и цФос31. Експресија Арц изазвана искуством била је нетакнута у старењу дивљег типа мозга и није била под утицајем брисања ХДАЦ3 (додатна слика 3ц). Експресија цФос, с друге стране, није успела да се индукује ОЛМ тренингом у старом ХДАЦ3 плус / плус хипокампусу, али брисање ХДАЦ3 није било довољно за обнављање ове неуспеле индукције (додатна слика 3д). Брисање ХДАЦ3 стога само обнавља експресију подскупа гена изазваних искуством у мозгу који стари, укључујући Пер1.
Да бисмо утврдили да ли брисање ХДАЦ3 обнавља експресију Пер1 промовишући ацетилацију хистона заједно са његовим промотером, затим смо измерили ацетилацију хистона 4, лизина 8 (Х4К8Ац) на месту промотора Пер1 ЦРЕ користећи имунопреципитацију хроматина (ЦхИП-кПЦР). Х4К8Ац је маркер транскрипционе активације32 и сматра се да је мета ХДАЦ311,12. ОЛМ тренинг није променио нивое Х4К8Ац на Пер1 промотору у мозгу старог дивљег типа, али у одсуству ХДАЦ3, нивои Х4К8Ац на Пер1 промотеру су значајно повећани као одговор на ОЛМ тренинг (Слика 3г). За Арц и цФос, нисмо видели промену попуњености Х4К8Ац у групама (додатна слика 3е, ф). Заједно, ови резултати сугеришу да брисање ХДАЦ3 повећава ацетилацију на Пер1 промотору и експресију Пер1 мРНА као одговор на учење.
Једно важно питање је да ли су уочене промене у Пер1 последица промена у циркадијалном ритму ХДАЦ3флок/флок мишева. Ако брисање ХДАЦ3 у дорзалном хипокампусу промени циркадијални ритмичност, то би могло објаснити уочене промене у експресији Пер1 и дугорочномеморијаформација. Да бисмо ово искључили, проценили смо циркадијални ритмичност младих (3-месеца) и старења (18-месеца) ХДАЦ3флок/флок мишева и њихових ХДАЦ3 плус/п легла после инфузије ААВ-ЦаМКИИ-Цре. После 2 недеље увлачења у циклус светлости/мрака од 12 сати (ЛД), мишеви су стављени у константну таму (ДД) да би се измерили ендогени циркадијални ритмови (додатна слика 4а). Нисмо приметили никакву разлику у обрасцима циркадијалне активности између ХДАЦ3 плус / плус и ХДАЦ3флок / флок мишева у било којој старосној групи (допунска слика 4б-ф), што сугерише да ХДАЦ3 хипокампуса нема утицај на циркадијални ритмичност. Дакле, уочене промене у експресији Пер1 и формирању дуготрајне меморије након брисања ХДАЦ3 не могу се објаснити променама у циркадијалном ритмику.
Пер1 се индукује ОЛМ обуком и регулише ХДАЦ3.
Затим смо желели да утврдимо да ли је хипокампални Пер1 потребан дугорочномеморијаформација. Прво смо проценили да ли учење зависно од хипокампуса типично индукује експресију Пер1 мРНА. Жртвовали смо младе (3- мес.) мишеве дивљег типа 60 м након стицања или ОЛМ-а или условљавања контекста страха (ЦФЦ)12. Експресија Пер1 мРНК је значајно повећана код животиња које су трениране или са ОЛМ (Слика 4а) или ЦФЦ (Слика 4б) у поређењу са контролама у кућном кавезу, што указује да се експресија Пер1 мРНА типично индукује у хипокампусу током консолидације меморије за више задатака.
Да бисмо утврдили да ли ово повећање Пер1 изазвано искуством може бити посредовано преко ХДАЦ3, затим смо користили ЦхИП-кПЦР за мерење попуњености ХДАЦ3 након ОЛМ тренинга на различитим местима заједно са промотором Пер1 у младом хипокампусу (слика 4ц, врх). Открили смо да је попуњеност ХДАЦ3 на Пер1 промотеру смањена на сва три тестирана места након ОЛМ обуке (слика 4ц, доле). Заједно са нашим претходним открићем да брисање ХДАЦ3 обнавља обе ацетилације при експресији мРНА Пер1 и Пер1 (слика 3), ово снажно сугерише да ХДАЦ3 регулише експресију Пер1 у дорзалном хипокампусу, а дисрегулација ХДАЦ3 може допринети оштећењима везаним за узраст у искуством изазваним Пер1 израз. ПЕР1 стога може бити део кључног механизма кроз који брисање ХДАЦ3 дугорочно побољшава оштећења хипокампуса повезана са старењем.меморијаформација.