Галектин-3 поседује антинекроптотичке и антиапоптотичке ефекте код акутне тубуларне некрозе изазване цисплатином

Контакт: ali.ma@wecistanche.com

Сухаил Ал-Салама и др

Дозирање Цистанцхе тубулоса за болест бубрега, кликните овде да бисте добили узорак

Апстрактан

Позадина/циљеви:Акутнабубрегаповреда (АКИ) је терет јавног здравља са повећаним морбидитетом, морталитетом и трошковима здравствене заштите. Повезан је са повећаним ризиком за развој хроничнебубрегаболести и смрти. Акутна тубуларна некроза (АТН) је најчешћи узрок АКИ. Апоптоза и некроза ткива играју важну улогу у АТН. Познато је да галектин 3 (ГАЛ-3), бета галактозид везујући лектин, има улогу у инфламацији, апоптози и оксидативном стресу, али његова улога у акутној тубуларној некрози изазваној цисплатином није јасно разјашњена.

Методе:Мужјаци Ц57Б6-Ј и Ц57БЛ-6 –ГАЛ-3 нокаут мишева су коришћени да изазову АТН коришћењем цисплатин мишјег модела акутне тубуларне некрозе. ГАЛ-3 експресија, апоптотички, некротични и некроптотични протеини убубрезимерене су коришћењем стандардних хистолошких, имунохистохемијских и ензимски везаних имуносорбентних техника. Подаци су представљени као средња вредност ± СЕ Статистички значајне разлике (стр<0.05) were="" calculated="" between="" experimental="" groups="" and="" corresponding="" control="" groups="" by="" one-way="" analysis="" of="">

Резултати:Дошло је до значајног повећања ГАЛ-3 убубрезиГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином у поређењу са контролним мишевима. Поред тога, постојали су значајно већи проценти АТН, виши нивои урее и креатинина у плазми, и виши нивои катепсина Б и катепсина Д, убубрезиГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином него ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином. Исто тако, постојали су значајно виши нивои протеина некроптозе РИПК1, РИПК3 и МЛКЛ убубрезиГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином него ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином. Штавише, било је знатно виших нивоабубрегапро-апоптотички протеини; цепао каспазу-3, цепао ПАРП, ТРАИЛ и ФАС код ГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином у поређењу са ГАЛ-3 дивљим мишевима третираним цисплатином.

Закључак:ГАЛ-3 може да утиче на преживљавање и смрт ћелије кроз интеракцију са некроптотичким, апоптотичким и протеинима који подржавају преживљавање у бубрежним тубулима током акутне тубуларне некрозе изазване цисплатином.

Кључне речи: Бубрег• Акутна тубуларна некроза • Цисплатин • Галектин-3 • Некроптоза • Апоптоза

Увод

Акутнабубрегаповреда (АКИ) карактерише нагло смањење убубрегафункција заснована на повећању нивоа креатинина у серуму, смањењу излучивања урина, потреби за терапијом замене бубрега или комбинацији ових фактора [1].

ТхеБубрегСмерница клиничке праксе за побољшање глобалног исхода болести (КДИГО) дефинише АКИ или као повећање серумског креатинина за више од или једнако 0,3 мг/дл (веће или једнако 26,5 µмол/л) унутар 48 сати; или повећање серумског креатинина на више или једнако 1,5 пута почетне вредности, за које се зна или се претпоставља да се догодило у претходних 7 дана; или запремину урина<0.5 ml/kg/h="" for="" 6="" hours="">

Акутна тубуларна некроза (АТН) је чест узрок АКИ [3]. Исхемијски и нефротоксични поремећаји су главни узроци АТН [3]. Упркос опсежним студијама о АТН, које укључују повреде ћелија, ћелијску смрт и регенерацију, основни механизми нису јасно дефинисани.

Апоптоза је облик програмиране ћелијске смрти посредоване каспазама. Значајни извештаји су показали да апоптоза игра важну улогу у АТН [3, 4]. С друге стране, некроза је облик ћелијске смрти коју карактерише рана пермеабилизација плазма мембране, отицање органела и дезинтеграција ћелијског садржаја [5]. Некроза се често јавља када су ћелије изложене претераном спољашњем стресу. Некроза се традиционално сматра пасивном и непрограмираном; стога је учињено врло мало напора да се истражи механизам некрозе, упркос њеној преваленци у људским болестима [5]. Добро познат тип некрозе је некроптоза [5]. Некроптоза је програмирана неапоптотичка ћелијска смрт изазвана бројним екстрацелуларним стимулусима, као што је фактор некрозе тумора (ТНФ) [5]. Првобитно је дефинисана као ћелијска смрт коју карактерише некротична морфологија смрти ћелије уз истовремену активацију серин/треонин-протеин киназе 1 (РИПК1) у интеракцији са рецептором. РИПК1 активира серин/треонин-протеин киназу 3 (РИПК3) у интеракцији са рецептором да би се формирао комплекс који се назива некрозом [6]. Касније, активирани РИПК3 добија способност да фосфорилира и активира мешовиту лозу киназу налик домену (МЛКЛ) [6]. Фосфориловани МЛКЛ молекули су у стању да формирају олигомере како би олакшали њихову транслокацију на ћелијску мембрану везивањем за фосфатидилинозитол липиде и кардиолипин. Транслоцирани МЛКЛ олигомери делују као канали у ћелијској мембрани да индукују или прилив натријума и ефлукс калијумових јона [7] или алтернативно прилив јона калцијума [8]. На оба начина то ће довести до некротичне смрти ћелије кроз пермеабилизацију и руптуре плазма мембране, што ће довести до изливања интрацелуларног садржаја у орган.

У овом пројекту користили смо цисплатин (Цис) за индукцију акутне тубуларне некрозе. Цис има широк спектар антитуморских ефеката и користи се за лечење различитих малигних тумора [9]. Ипак, нефротоксичност је главни нежељени ефекат и карактерише је некроза бубрежних тубуларних ћелија, оштећење ткива, бубрежна дисфункција и акутнабубреганеуспех [10]. Упркос разним мерама које су предузете да би се превазишла повреда бубрега, скоро 4–23 процента пацијената је погођено АКИ [11]. Познати механизми бубрежне повреде изазване цисплатином укључују апоптозу, оксидативни стрес и инфламаторни одговор услед директне повреде бубрежних тубуларних епителних ћелија и бубрежних судова [12].

Галектин-3 (ГАЛ-3), 35 кДа протеин, је јединствена химера која има један Ц-терминални домен за препознавање угљених хидрата (ЦРД) повезан са дугим Н-терминалним доменом (НД) [13 ].ГАЛ-3 се налази на површини ћелије, цитоплазми и језгру ћелија, као иу екстрацелуларном матриксу [13].

Интрацелуларни ГАЛ-3 је укључен у пролиферацију ћелија и анти-апоптотичке механизме [14, 15]. Он утиче на К-Рас и Акт протеине и тако такође регулише преживљавање диференцијације и смрт [14, 15]. Док екстрацелуларни ГАЛ-3 посредује у адхезији ћелија-ћелија, интеракцији ћелије и матрикса и сигнализацији, запаљењу и апоптози [16].

Показало се да се ГАЛ-3 транслоцира или из цитосола или из језгра у митохондрије након излагања апоптотичким стимулусима и да блокира промене у потенцијалу митохондријалне мембране, чиме се спречава апоптоза [17]. Студије су такође показале да ГАЛ-3 може инхибирати апоптозу изазвану ТНФ-ом кроз активацију АКТ [18]. Друге студије су показале да су ГАЛ-3 и Бецлин1 укључени у два координирана пута програмиране ћелијске смрти, апоптозе и аутофагије [18]. У овом пројекту претпостављамо да ГАЛ-3 има заштитну улогу на бубрежном тубуларном епителу код акутне тубуларне повреде. Користили смо мишји модел акутне тубуларне повреде да бисмо истражили заштитну улогу ГАЛ-3 код акутне тубуларне повреде изазване цисплатином кроз мерење бубрежних функција (уреа у плазми и креатинин),бубрегапротеини некроптозе (РИП-1, РИП-3 и МЛКЛ), протеини некрозе (катепсин Д и катепсин Б), протеини апоптозе (исцепљена каспаза-3, расцепљени ПАРП, ТРАИЛ и ФАС) , и маркери преживљавања ћелија (п-НФ-κБ, бета-катенин и Внт), коришћењем стандардног ензимског имуносорбентног теста, биохемијског анализатора, хистолошких и имунохистохемијских процедура.

Материјали и методе

Користили смо мишји експериментални модел акутногбубрегаповреда која је опширно описана у литератури и коришћена за проучавање акутнихбубрегаповреде у лабораторијама широм света [19].

Мишји модел акутне тубуларне некрозе

Коришћени су Ц57БЛ/6 и Ц57БЛ/6 –ГАЛ-3 нокаут (КО) мишеви тежине 25-30 г. Мишеви су држани на стандардној исхрани. Мишеви су смештени по пет по кавезу под 12-х светлосним и тамним распоредом најмање 1 недељу пре примене Цисплатина.

Цисплатин (ЕБЕВЕ Пхарма ГмбХ Нфг. КГ, Унтерацх, АУСТРИА) је свеже коришћен на дан примене у концентрацији од 0.5 мг/мл. Мишевима је дато или 30 мг/кг телесне тежине цисплатина [11] или вехикулум (нормални физиолошки раствор) интраперитонеално (ИП), након чега су мишеви поново имали слободан приступ храни и води. Метода еутаназије започета је интраперитонеалном ињекцијом анестетика, која је укључивала комбинацију кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг), затим су уклоњени бубрези и узети узорци крви 96 сати након примене цисплатина. Крв је сакупљена у ЕДТА вацутаинерс.Бубрезису затим ресецирани, испрани у ледено хладном фосфатном пуферу (ПБС), једна половина сваког бубрега је одмах замрзнута у течном азоту и касније ускладиштена у замрзивачу од -80 степени. Друга половина је одмах фиксирана у 10% пуферованом формалном раствору соли током 24 сата. Сакупљена крв је центрифугирана на 3000 РПМ током 15 минута. Плазма је сакупљена, подељена на аликвоте и чувана на -80 степени до даље анализе.

Обрада узорка за екстракцију протеина

Укупни протеин је екстрахован избубрегаузорке хомогенизацијом пуфером за лизу и сакупљањем супернатанта након центрифугирања. За укупни ћелијски лизат, узорци бубрега су одмрзнути, извагани и стављени у хладни пуфер за лизу који садржи 5{{20}} мМ Трис, 300 мМ НаЦл, 1 мМ МгЦл2, 3 мМ ЕДТА, 20 мМ -глицерофосфат, 25 мМ НаФ, 1 проценат Тритон Кс-100, 10 проценат в/в глицерол и таблета инхибитора протеазе (Роцхе Цомплете инхибитор протеасе коктел таблете). Бубрези су хомогенизовани на леду помоћу хомогенизатора (ИКА Т25 Ултра Туррак). Узорци су затим центрифугирани на 14000 РПМ у трајању од 15 минута на 4 степена, супернатант је сакупљен, подељен на аликвоте и чуван на −80 степени до даље анализе. Екстракција нуклеарног и цитоплазматског протеина је урађена према протоколу описаном на другом месту [19]. Укратко, узорци бубрега су одмрзнути на леду, измерени и хомогенизовани на леду пуфером који садржи Трис ХЦл 10 ммол/л, ЦаЦл2 3 ммол/л, МгЦл2 2 ммол/л, ЕДТА 0,1 ммол/л , Фенилметансулфонил флуорид (ПМСФ) 0,5 ммол/л, сахароза 0,32 ммол/л, дитиотреитол (ДТТ) 1 ммол/л, Нонидет П-40 (НП-40) 0,5 процената и коктел инхибитора протеазе 1 проценат. Хомогенати су центрифугирани на 800 РПМ током 10 минута. Супернатант је уклоњен и чуван као цитоплазматске фракције. Пелет је два пута испран пуфером за хомогенизацију без НП-40 и ресуспендован пуфером са мало соли који садржи ХЕПЕС 20 ммол/л, МгЦл2 1.5 ммол/л, КЦл 20 ммол/л, ЕДТА 0,2 ммол /л. Глицерол 25 процената, ПМСФ 0,5 ммол/л и ДТТ 0,5 ммол/л. После инкубације на леду у трајању од 5 минута, једнака запремина пуфера велике соли који садржи ХЕПЕС 20 ммол/л, МгЦл2 1.5 ммол/л, КЦл 800 ммол/л, ЕДТА 0,2 ммол/л. Додати су глицерол 25 процената, ПМСФ 0,5 ммол/л, ДТТ 0,5 ммол/л, НП-40 1 проценат и коктел инхибитора протеазе 1 проценат, смеша је инкубирана на леду 30 минута, центрифугирана на 14000 РПМ током 15 минута на 4 степена, а супернатанти су сачувани као нуклеарна фракција. Укупна концентрација протеина је одређена методом БЦА протеина (Тхермо Сциентифиц Пиерце БЦА Протеин Ассаи Кит).

Обрада узорка за хистологију

Бубрези су изрезани, испрани ледено хладним ПБС-ом и измерени. Свакибубрегаје подељен на две половине, а свака половина је била касета и фиксирана директно у 10% пуферованог формалина. Секције су дехидриране у растућим концентрацијама етанола, очишћене ксиленом и уметнуте парафином. Секције од три µм су припремљене од парафинских блокова и обојене хематоксилином и еозином и шифовим (ПАС) бојама по стандардним процедурама [20]. Обојене пресеке је проценио хистопатолог који је учествовао у овом пројекту.

Имунохистоцхемистри

Секције од пет µм су депарафинизоване ксиленом и рехидриране са степенастим алкохолом. Секције су затим стављене у Ретриевал Солутион са високим пХ (пХ 9) у водено купатило на 95оЦ током 20 минута. Секције су затим испиране дестилованом водом током 5 минута, а затим ТБСТ пуфером током 5 минута. Секције су затим третиране блоком пероксидазе током 10 минута, а затим протеинским блоком током 10 минута. Секције су затим инкубиране један сат на собној температури са антителом против цепања каспазе-3 (Раббит Полицлонал, 1:300, Целл сигналинг тецхнологи, Данверс, МА САД), антителом против цепања ПАРП (Раббит Полицлонал, 1: 100, Технологија ћелијске сигнализације, Данверс, МА, САД), анти-бета-катенин антитело (зечји поликлонални, 1:100, Абцам, Кембриџ, МА, САД), анти-фосфо-НФ-κБ антитело (зечји поликлонални, 1: 100, Абцам, Цамбридге, МА, САД), анти-Внт-3 (Раббит Полицлонал, 1:100, Абцам, Цамбридге, МА, САД), анти-РИПК1 (Раббит полицлонал,1:100, Тхермо Сциентифиц, Валтхам, МА, САД), анти-РИПК3 (зечји поликлонални, 1:100, Тхермо Сциентифиц, Валтхам, МА, САД) и анти-МЛКЛ 1 (зечји моноклонални, 1:100, Тхермо Сциентифиц, Валтхам, МА, САД) . Након коњугације са примарним антителима, секције су инкубиране са секундарним антителом (ЕнВисионТМ Детецтион Систем, ДАКО, Агилент, УСА) 20 минута на собној температури, након чега је додат ДАБ хромоген (ЕнВисионТМ Детецтион Систем, ДАКО, Агилент, Санта Цлара, ЦА, САД) и контра бојење је урађено хематоксилином. Коришћене су одговарајуће позитивне контроле. За негативну контролу, примарно антитело није додато у секције. Позитивне и негативне контроле су коришћене у свакој серији обојених плочица (није приказано на сликама).

Имунофлуоресцентно обележавање

Секције од пет μм су депарафинизоване ксиленом и рехидриране са степенастим алкохолом. Секције су стављене у Ретриевал Солутион са високим пХ (пХ 9) у водено купатило на 95 степени током 20 минута. Секције су затим испиране дестилованом водом током 5 минута, а затим ТБСТ пуфером током 5 минута. Секције су затим инкубиране са анти-ГАЛ-3 антителом (Раббит Полицлонал,1:50, Санта Цруз Биотецхнологи, Даллас, Тексас, САД), анти-РИПК1 (Раббит полицлонал,1:50, Тхермо Сциентифиц, Тхермо Сциентифиц, Валтхам, МА, САД), анти-РИПК3 1 (зечји поликлонални, 1:50, Тхермо Сциентифиц, Тхермо Сциентифиц, Валтхам, МА, САД) и анти-МЛКЛ 1 (зечји моноклонални, 1:50, Тхермо Сциентифиц, Тхермо Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА) преко ноћи на собној температури. Секције су накнадно инкубиране са магарећом анти-зечијом Алека Флуор 488, (Јацксон Иммуне Ресеарцх Лабораториес, Бар Харбор, Мејн, САД, 1:100) антителом. Коначно, секције су монтиране у ДАПИ-растворљиви медиј за монтажу (Абцам, Цамбридге, МА, САД) и прегледани Олимпус флуоресцентним микроскопом. Коришћени су одговарајући делови позитивне контроле. За негативну контролу, примарно антитело није додато у секције и цела процедура је спроведена на исти начин као што је горе поменуто. Позитивне и негативне контроле су коришћене у свакој серији обојених плочица (није приказано на сликама).

Морфометријска анализа

Морфометријску анализу акутне тубуларне некрозе урадила су два истраживача која су учествовала у овој студији. Морфометријска анализа одцепљене каспазе-3, расцепљене ПАРП, РИПК1, РИПК3, МЛКЛ, фосфо-НФК-Б, Внт-3, бета-катенина, експресије у бубрежним тубуларним ћелијама урађена је коришћењем софтвера ИмагеЈ (хттп: //рсбвеб.них.гов/иј/). Одцепљена каспаза-3, одцепљена ПАРП, РИПК1, РИПК3, МЛКЛ, фосфо-НФК-Б, Внт-3, Бета-катенин, обележавање је одређено пребројавањем броја позитивних ћелија у насумично одабраним великим снагама поља (ХПФ) у бубрегу. Средњи број позитивних ћелија биће конвертован из по ХПФ у по мм2 (Сваки мм2= 4ХПФ). За, раздвојену каспазу-3, цепљену ПАРП, РИПК1, РИПК3 и Внт-3, означавање, ћелије су узете у обзир

позитиван када је постојао цитоплазматски образац бојења. За обележавање МЛКЛ, ћелије су се сматрале позитивним када је постојао мембрански и цитоплазматски образац бојења. За фосфо-НФК-Б и бета-катенин, обележавање, ћелије су се сматрале позитивним када је постојао узорак нуклеарног бојења.

Ензимски имуносорбентни тест

Бубрегконцентрације ГАЛ-3, катепсина Д, катепсина Б, расцепљене каспазе-3, ТРАИЛ-а и ФАС-а одређене су коришћењем комплета за развој ДуоСет ензимског имуносорбентног теста (ЕЛИСА) (Р&Д Системс, Минеаполис, МН, САД ) за сендвич ЕЛИСА, користећи стандардну процедуру према упутствима произвођача. Концентрације ПАРП раздвојеног у бубрезима одређене су коришћењем Елиса комплета за ћелијску сигнализацију (Данверс, МА, САД) за сендвич Елиса, применом стандардне процедуре према упутствима произвођача. Концентрације РИПК1, РИПК3 и МЛКЛ у бубрезима су одређене коришћењем МиБиоСоурце (Сан Дијего, Калифорнија, САД) Елиса комплета за сендвич Елиса, применом стандардне процедуре према упутствима произвођача. Очитавања апсорпције су направљена на 450 нм, коришћењем 96- спектрофотометра за плочу (БиоТек ЕЛк800 микроплоча Елиса читач, Винооски, ВТ, САД). Концентрације ГАЛ-3, катепсин Д, катепсин Б, расцепљена каспаза-3, ТРАИЛ, РИПК1, РИПК3, МЛКЛ, расцепљени ПАРП и ФАС у узорцима бубрега одређене су интерполацијом из стандардне криве. Нивои су нормализовани на укупне концентрације протеина.

Статистичка анализа

Све статистичке анализе су урађене коришћењем Грапх Пад Присм Софтваре верзије 5. Вишеструка поређења између различитих група су постигнута једносмерном анализом варијансе (АНОВА), праћено Невман Кеулс пост хоц тестовима вишеструког опсега. Поређења између две групе остварена су Студентовим т-тестом. Подаци су приказани као средња вредност ± стандардна грешка (СЕ). П вредности < 0.05="" се="" сматрају="">

Резултати

Акутна тубуларна некроза изазвана цисплатином

ГАЛ-3 дивља група третирана цисплатином показује АТН који укључује (67,29 процената ± 2,392) бубрежног паренхима (слика 1) са губитком ивица четкице, отицањем тубуларних ћелија, интратубуларним падајућим ћелијама, интратубуларним секретом и митозом ( сл. 2Б и 3Б).

ГАЛ-3 КО група третирана цисплатином показује АТН који укључује (78,54 процената ± 0.8120) бубрежног паренхима (слика 1) са губитком ивица четкице, отицањем тубуларних ћелија, интратубуларним падајућим ћелијама, интратубуларни секрет и митоза (Слика 2Д и 3Д).

Постоји знатно већи проценат АТН убубрезикод ГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином од ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином (П<0.002) (fig.="">

ГАЛ-3 се изражава у акутној тубуларној некрози

Постоји значајно повећање концентрације цитоплазматске фракције ГАЛ-3 убубрезиу дивљој групи ГАЛ-3 третираној цисплатином (6084 ± 587,3 пг/мг) у поређењу са дивљом контролном групом ГАЛ-3 (1620 ± 62,3 пг/мг), (П<0.001), (fig.="" 4e).="" there="" is="" a="" significant="" increase="" in="" the="" nuclear="" fraction="" concentration="" of="" gal-3="" in="">бубрезиу дивљини ГАЛ-3 третираној цисплатином

група (841,8 ± 41,11 пг/мг) у поређењу са ГАЛ-3 дивљом контролном групом (429,2 ± 39,56 пг/мг), (П<0.001), (fig.="" 4e).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Имунофлуоресцентно бојење представникабубрегасекције су показале значајно већу експресију ГАЛ-3 у бубрежним тубулима захваћеним акутном тубуларном некрозом (слика 4Б-Д) у поређењу са ГАЛ-3 дивљим контролним мишевима (слика 4А).

ГАЛ-3 је анти-некроптотички посредник

Серин/треонин-протеин киназа 1 (РИПК1) у интеракцији са рецептором. Дошло је до значајног повећања концентрације РИПК-1 (55,33 ± 3,766 пг/мг) убубрезиГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином у поређењу са ГАЛ-3 дивљим контролним мишевима (14,22 ± 1,687 пг/мг), (П<0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-1="" concentration="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (39.59="" ±="" 1.808="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-1="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.33="" ±="" 3.766="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Вишеструка поређења између четири експерименталне групе користећи једносмерну АНОВА, праћена Невман-Кеулс пост хоц тестом су била статистички значајна (П<>

Имунохистохемијско бојење за РИПК-1 показало је значајно већи број ћелија које експримирају РИПК-1 убубрезиГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином него ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином (П<0.001), (fig.="">

Серин/треонин-протеин киназа 3 која интерагује на рецепторе (РИПК3). Дошло је до значајног повећања концентрације РИПК-3 (616,4 ± 27,07 пг/мг) у бубрезима ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином у поређењу са ГАЛ-3 дивљим контролним мишевима (17,46 ± 7,002 пг/мг), (П<0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-3="" concentration="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (203.1="" ±="" 6.443="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-3="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="">бубрезиГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином него код ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином (616,4 ± 27,07 пг/мг), (П<0.001), (fig.="">

Имунохистохемијско бојење за РИПК-3 показало је значајно већи број ћелија које експримирају РИПК-3 у бубрезима ГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином него ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином ( П<0.001), (fig.="" 7).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Киназа мешовите лозе налик домену (МЛКЛ). Дошло је до значајног повећања концентрације МЛКЛ (71,46 ± 1,757 пг/мг) убубрезиГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином у поређењу са ГАЛ-3 дивљим контролним мишевима (23,30 ± 0,5897 пг/мг), (П<0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" mlkl="" concentration="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (40.30="" ±="" 1.090="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" mlkl="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (71.46="" ±="" 1.757="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" immunohistochemical="" staining="" for="" mlkl="" showed="" a="" significantly="" higher="" number="" of="" cells="" expressing="" mlkl="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice=""><0.001), (fig.="" 8).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Катепсин Б. Дошло је до значајног повећања концентрације катепсина-Б убубрезидивљих ГАЛ-3 мишева третираних цисплатином (55,79 ± 4,141 пг/мг) у поређењу са ГАЛ-3 дивљим контролним мишевима (37,99 ± 1,206 пг/мг), (П<0.05), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-b="" concentration="" in="">бубрезиГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином (85,87 ± 9,220 пг/мг у поређењу са ГАЛ-3 дивљим контролним мишевима (32,81 ± 1,570 пг/мг), (П<0.001), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-b="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (85.87="" ±="" 9.220="" pg/mg="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.79="" ±="" 4.141="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Вишеструка поређења између четири експерименталне групе користећи једносмерну АНОВА, праћена Невман-Кеулс пост хоц тестом су била статистички значајна (П<>

Цатхепсин-Д. Дошло је до значајног повећања концентрације катепсин-Д убубрезидивљих ГАЛ-3 мишева третираних цисплатином (5145 ± 286,1 пг/мг) у поређењу са ГАЛ-3 дивљим контролним мишевима (4066 ± 107,7 пг/мг), (П<0.05), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-d="" concentration="" in="">бубрезиГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином (6695 ± 587,7 пг/мг) у поређењу са ГАЛ-3 дивљим контролним мишевима (3914 ± 87,51 пг/мг), (П<0.001), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-d="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (6695="" ±="" 587.7="" pg/mg)="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4066="" ±="" 107.7="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="">

Вишеструка поређења између четири експерименталне групе користећи једносмерну АНОВА, праћена Невман-Кеулс пост хоц тестом су била статистички значајна (П<>

ГАЛ-3 је посредник против апоптозе

Одцепљена каспаза-3. Дошло је до значајног повећања концентрације цепане каспазе-3 (4665 ± 330,9 пг/мг) убубрезиГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином у поређењу са ГАЛ-3 дивљим контролним мишевима (3193 ± 75,30 пг/мг), (П<0.05), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" caspase-3="" concentration="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (3022="" ±="" 78.57="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" caspase-3="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4665="" ±="" 330.9="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="" 10a).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Имунохистохемијско бојење одцепљене каспазе-3 показало је значајно већи број апоптотичких ћелија у бубрезима ГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином него дивљих ГАЛ-3 мишева третираних цисплатином (П<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="" i).cleaved="">

Цлеавед ПАРП. Дошло је до значајног повећања концентрације Ццеавед ПАРП (1446 ± 56,97 пг/мг) убубрезиГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином у поређењу са ГАЛ-3 дивљим контролним мишевима (171,5 ± 3,926 пг/мг), (П<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (236.1="" ±="" 11.86="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Имунохистохемијско бојење за цепани ПАРП показало је значајно већи број позитивних ћелија у бубрезима ГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином него ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином (П<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

Лиганд који индукује апоптозу (ТРАИЛ) повезан са ТНФ-ом. Дошло је до значајног повећања концентрације ТРАИЛ-а (120,9 ± 4,748 пг/мг) убубрезиГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином у поређењу са ГАЛ-3 дивљим контролним мишевима (86.14 ± 2,879 пг/мг), (П<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (120.9="" ±="" 4.748="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Имунохистохемијско бојење за цепану каспазу-3 показало је значајно већи број апоптотичких ћелија убубрезиГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином него ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином (П<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="">

Цлеавед ПАРП. Дошло је до значајног повећања концентрације Цлеавед ПАРП (1446 ± 56,97 пг/мг) у бубрезима ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином у поређењу са ГАЛ-3 дивљим контролним мишевима (171,5 ± 3,926 пг/ мг), (П<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="">бубрезиГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином у поређењу са ГАЛ-3 КО контролним мишевима (236,1 ± 11.86 пг/мг), (П<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Имунохистохемијско бојење за цепани ПАРП показало је значајно већи број позитивних ћелија убубрезиГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином него ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином (П<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

Лиганд који индукује апоптозу (ТРАИЛ) повезан са ТНФ-ом. Дошло је до значајног повећања концентрације ТРАИЛ (120,9 ± 4,748 пг/мг) у бубрезима ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином у поређењу са ГАЛ-3 дивљим контролним мишевима (86.14 ± 2,879 пг/мг), (П<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="">бубрезиГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином него код ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином (120,9 ± 4,748 пг/мг), (П<0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

ФАС легенда.Дошло је до значајног повећања концентрације ФАС (332,5 ± 6,395 пг/мг) убубрезиГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином у поређењу са ГАЛ-3 дивљим контролним мишевима (77,72 ± 2,805 пг/мг), (П<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" fas="" concentration="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="">бубрезиГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином у поређењу са ГАЛ-3 КО контролним мишевима (134,1 ± 3,597 пг/мг), (П<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" fas="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (332.5="" ±="" 6.395="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Вишеструка поређења између четири експерименталне групе користећи једносмерну АНОВА, праћена Невман-Кеулс пост хоц тестом су била статистички значајна (П<>

ГАЛ-3 и сигнали за преживљавање

НФ-κБ.Имунохистохемијско бојење за фосфор-НФ-κБ показало је значајно већи број ћелија обојених фосфором-НФ-κБ убубрезиГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином него ГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином (П<0.001), (fig.="" 12="">

Бета Цатенин.Имунохистохемијско бојење за бета-катенин показало је значајно већи број ћелија обојених бета-катенином убубрезиГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином него ГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином (П<0.001), (fig.="" 12="">

Внт-3а.Имунохистохемијско бојење за Внт-3а показало је значајно већи број ћелија обојених са Внт-3а у бубрезима ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином него ГАЛ третираних цисплатином-3 КО мишеви (П<0.001), (fig.="" 12="">

Пласма УреаДошло је до значајног повећања концентрације урее у плазми (23,88 ± 6,715 ммол/Л) код ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином у поређењу са ГАЛ-3 дивљим контролним мишевима (6,688 ± 0). 6066 ммол/Л), (П<0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (8.331="" ±="" 0.5194="" mmol/l),=""><0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (23.88="" ±="" 6.715mmol/l),=""><0.001), (fig.="">

Вишеструка поређења између четири експерименталне групе користећи једносмерну АНОВА, праћена Невман-Кеулс пост хоц тестом су била статистички значајна (П<>

Креатинин у плазми

Дошло је до значајног повећања концентрације креатинина у плазми (48,42 ± 3,992 умол/Л) код ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином у поређењу са ГАЛ-3 дивљим контролним мишевима (13,27 ± 0). 3106 умол/Л), (П<0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (13.88="" ±="" 0.4183="" umol/l),=""><0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (48.42="" ±="" 3.992="" umol/l),=""><0.01), (fig.="" 13b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Дискусија

Акутнабубрегаповреда је уобичајен здравствени проблем широм света. Сваке године има око 13,3 милиона акутних случајевабубрегаповреда (АКИ). Оптерећење које постаје посебно велико у земљама у развоју [21]. Глобално, постоји 1,7 милиона смртних случајева годишње узрокованих АКИ. Од тога, око 1,4 милиона се јавља у земљама са ниским и средњим приходима [21]. АКИ се често може спречити и лечити са само неколико, ако их има, дугорочних здравствених последица. Идентификовање главних механизама и актера који учествују у развоју АКИ одразиће се на побољшање неге пацијената и минимизирање морталитета и морбидитета.

Показали смо значајно повећање концентрације ГАЛ-3 убубрезиподвргнут АКИ. Такође смо показали значајно већу експресију ГАЛ-3 у бубрежним тубулима захваћеним акутном тубуларном некрозом код дивљих мишева третираних ГАЛ-3 цисплатином него у бубрежним тубулима у контролној групи третираној сланим раствором. И цитоплазматске и нуклеарне концентрације ГАЛ-3 значајно су повећане у бубрежним тубулима након АТН у поређењу са мишевима третираним сланим раствором. Повишен ниво ГАЛ-3 у повређеним бубрежним тубулима сугерише ГАЛ-3 као важног играча у АТН.

Такође смо користили ГАЛ-3 КО мишеве да бисмо истражили механичку улогу ГАЛ-3 у АТН-у. Ово нам помаже да изблиза сагледамо модулације про-апоптотичких, про-некроптотских и протеина за преживљавање у присуству и одсуству ГАЛ-3 и утврдимо да ли ГАЛ-3 има било какав утицај на ове промене или не .

Показали смо значајно већи проценат тубула захваћених АТН код ГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином него код ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином. Наши резултати су такође показали значајно повећање катепсина Б и катепсина Д у бубрезима захваћеним АТН. Поред тога, постоје значајно виши нивои катепсина Б и катепсина Д убубрезиГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином него код дивљих ГАЛ-3 мишева третираних цисплатином. Катепсини играју важну улогу у сигналним путевима који покрећу апоптотичку и некротичну ћелијску смрт, тако што разграђују различите супстрате и/или доприносе дестабилизацији митохондрија [22]. Лизозомалне протеазе, катепсин Б и катепсин Д су обилно експримирани у бубрезима [23].

Катепсин Б, цистеин протеиназа која има оптималну активност у киселој средини, учествује у многим физиолошким и патолошким процесима. Он вари структурне протеине и ензиме у ћелији, разграђује главне елементе базалне мембране и активира проензиме, хормоне и факторе раста [24]. Повећани нивои експресије и активација катепсина Б примећени су у хуманој ћелијској линији проксималних тубуларних епитела ХК-2 која пролази кроз апоптозу [25].

Катепсин Д је значајно експримиран у проксималним тубуларним ћелијама. Катепсин Д је кључна лизозомална аспарагинска протеаза која је одговорна за деградацију протеина и органела аутофагијом-лизозомалном, као и током ћелијске некрозе и руптуре лизозомалне мембране [26]. Катепсин Д је значајно повећан у повређеним тубулима након оштећења бубрежне исхемије/реперфузије, што подржава наш налаз о значајном повећању катепсина Д убубрезиса акутном тубуларном некрозом [27].

Виши нивои катепсина Б и Д са већим процентом АТН убубрезиГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином него ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином сугеришу ГАЛ-3 као анти-некротични медијатор.

Такође смо показали значајно више нивое протеина некроптозе; РИПК1, РИПК3 и МЛКЛ убубрезимишева третираних цисплатином. Штавише, идентификовали смо значајно веће концентрације РИПК1, РИПК3 и МЛКЛ у бубрезима ГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином него ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином.

Студије су показале да је цисплатин повезан са повећаним оксидативним стресом [28]. Генерисање реактивних врста кисеоника (РОС), акумулација продуката пероксидације липида убубрези, а сматра се да су потиснути антиоксидативни системи главни механизми АКИ изазваног цисплатином [29]. Унутар ћелије, цисплатин се претвара у високо реактивни облик који брзо реагује са антиоксидативним молекулима који садрже тиол као што је глутатион [30]. Цисплатин такође може да изазове митохондријалну дисфункцију и повећану производњу РОС кроз оштећен респираторни ланац [31]. РОС олакшава аутофосфорилацију РИПК1 и промовише регрутовање РИПК-3 и формирање некрозома [32]. Поред тога, РОС је критичан индуктор пермеабилности лизозомалне мембране (ЛМП) [33].

Цаи ет ал. [34] су показали да је ЛМП посредован са РОС укључен у индукцију некроптозе у ћелијама интервертебралног диска кунића. Слично, РИПК1-индукована производња митохондрија-РОС праћена је ЛМП и митохондријалном дисфункцијом као резултат позитивне повратне спреге између Ца2 плус и ЈНК, што доводи до некроптозе А549 и Х1299 ћелија [35, 36].

Штавише, показано је да повишени РИПК3 у некроптози индукује стрес ендоплазматског ретикулума који повећава ћелијску концентрацију Ца2 плус и експресију ксантин оксидазе што доводи до појачаног стварања РОС [37].

Катепсини Б и Д су главни функционални садржаји који се ослобађају из лизозома са повећаним ЛМП током процеса ћелијске смрти [34]. Активација катепсина Б и Д може повећати некроптотички пут [38]. Дакле, некроптоза се може индуковати на начин независан од рецептора [39]. Осим тога, извештаји су показали да постоје додатни стимуланси, осим РОС, катепсина Б и Д, за индукцију некроптозе, а они укључују уп-регулацију ТРАИЛ и ФАС легенд протеина [40]. Дакле, повећани РОС, било због цисплатина или индукције РИПК1 или РИПК3, може довести до повећања ЛМП и ослобађања катепсина Б и Д који заузврат повећавају некроптозу. Слично, повећани РОС може активирати РИПК1, регрутовање РИПК3, побољшање формирања некрозома, фосфорилацију МЛКЛ, транслокацију фосфорилисаног МЛКЛ на ћелијску мембрану што доводи до некротичне смрти ћелије кроз пермеабилизацију и руптуру плазма мембране.

У овој студији верујемо да су повећани РОС, катепсин Б, катепсин Д, ТРАИЛ и ФАС укључени у индукцију некроптозе у АТН.

Да бисмо утврдили улогу ГАЛ-3 у некроптози, измерили смо концентрације РИПК1, РИПк3 и МЛКЛ у присуству и одсуству ГАЛ-3 коришћењем ГАЛ-3 вилд и ГАЛ{{5 }} КО мишеви.

Значајно веће концентрације РИПК1, РИПК3 и МЛКЛ код ГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином од ГАЛ-3 мишева третираних цисплатином указују на то да је избацивање ГАЛ-3 повезано са значајно повећање протеина некроптозе, што указује на анти-некроптотичку улогу ГАЛ-3.

Штавише, показали смо значајно више нивое про-апоптотичких протеина; цепао каспазу-3, цепао ПАРП, ТРАИЛ, ФАС и апоптотичка тела убубрезипратећи АТН.

Током АТН, пермеабилизација лизозомалне мембране омогућава транслокацију катепсина Д и катепсина Б из лизозома у цитосол где може да изврши своју про-апоптотичку функцију. Цитосолни катепсин Д цепа Бид протеин у тБид изазивајући уметање Бак протеина у митохондријалну мембрану. Ово доводи до ослобађања цитохрома ц из митохондрија у цитосол и активације прокапаза 9 и 3 [41]. У овој студији, и имунофлуоресцентно бојење и концентрација протеина су показали значајно већу експресију интрацелуларног ГАЛ-3, и цитоплазматске и нуклеарне фракције, у АТН убубрезиод ГАЛ-3 дивљих мишева у поређењу са контролним мишевима.

Дакле, виши нивои про-апоптотичких протеина; цепао каспазу-3, ТРАИЛ, ФАС и апоптотска тела убубрезиГАЛ-3 КО мишева третираних цисплатином него код ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином сугерише анти-апоптотичку улогу ГАЛ-3. Утврђено је да је ГАЛ-3 критично укључен у апоптозу у зависности од његове субћелијске локализације. Студије су показале да интрацелуларни ГАЛ-3 може инхибирати апоптозу [42-44]. У прилог анти-апоптотичкој улози ГАЛ-3, идентификовали смо значајно већи број ћелија које експримирају фосфо-НФ-κБ, бета-катенин и Внт протеине у бубрезима ГАЛ-а третираног цисплатином{{15} } дивљих мишева него ГАЛ-3 КО мишева. НФ-κБ је фактор транскрипције који игра важну улогу у регулисању упале, пролиферације ћелија и преживљавања ћелија. Фосфорилација игра кључну улогу у активацији НФ-κБ низводно од свих ових стимулуса [45]. НФ-κБ је сада препознат као важан фактор који доприноси преживљавању ћелија и заштити од апоптозе [46]. Показало се да Внт протеини имају заштитне ефекте на повређене ћелије кроз своју анти-апоптотичку функцију путем активације -катенина и ц-Миц [47].

Ву ет ал. такође су показали значајно повећање п-НФ-κБ инбубрезиса АТН-ом [48]. Ванг и др. такође су показали појачану регулацију Внт/-катенин сигналног пута код акутне повреде бубрега [49]. Студије су показале да је НФ-κБ укључен у индукцију ГАЛ-3 [50], као и да је ГАЛ-3 укључен у активацију НФ-κБ [51]. Занимљиво је да је откривено да је ГАЛ-3 нови везујући партнер -катенина [52].

Ови налази сугеришу да анти-апоптотичка улога ГАЛ-3 такође може бити посредована активацијом НФ-κБ и Внт/-катенин путева. Чини се да ГАЛ-3 повезује ове путеве трансдукције сигнала за преживљавање који су истражени у нашој студији. Ови путеви такође имају унакрсне разговоре између себе на различитим нивоима. Играчи Внт/-катенинског пута модулирају многе своје ефекте кроз интеракцију са НФ-κБ и реципрочно НФ-κБ такође утиче на сигнални пут Внт/-катенина [53]. Стога је разумљиво да ГАЛ-3 игра централну улогу конектора у путевима трансдукције сигнала за преживљавање.

Наша студија показује да је присуство или одсуство интрацелуларног ГАЛ-3 повезано са значајним променама у проапоптотичким, пронекроптотским и просурвивал протеинима у АТН изазваном цисплатином и да је висок ниво ГАЛ-3 у бубрежним тубулима посредовање у анти-апоптотичном, антинекроптотичном и просурвивалном окружењу које може обликовати будући ток болести. Ово указује на заштитну улогу ГАЛ-3 у акутном АТН изазваном цисплатином, што је подржано значајно нижим нивоима урее и креатинина у плазми код ГАЛ-3 дивљих мишева третираних цисплатином него ГАЛ-3 КО мишеви третирани цисплатином (слика 13).

Закључак

ГАЛ-3 може да утиче на преживљавање и смрт ћелије кроз интеракцију са некроптотичким, апоптотичким и протеинима који подржавају преживљавање у бубрежним тубулима током акутне тубуларне некрозе изазване цисплатином.

Признања

Прилози аутора

Сви аутори су прегледали и одобрили достављену верзију рукописа. СА је представио концепт, дизајнирао студију, анализирао и интерпретирао податке, дизајнирао фигуре и написао рад. ГЈ је извршио експерименте на животињама и ЕЛИСА технику, МС је извршио имунохистохемијско и имунофлуоресцентно бојење и сродну обраду ткива. ХТ је извео експерименте на животињама и ЕЛИСА технику. ЈИ је извршио биохемијску анализу функције бубрега и доставио добијене податке.

Обелодањивање изјава

Аутори изјављују да немају супротстављених интереса.

Референце

1 Ламеире НХ, Багга А, Цруз Д, Де Маесенеер Ј, Ендре З, Келлум ЈА, Лиу КД, Мехта РЛ, Панну Н, Ван Биесен В, Ванхолдер Р: Акутна повреда бубрега: све већа глобална забринутост. Ланцет 2013;382:170-179.

2 КДИГО: Упутство за клиничку праксу за акутну повреду бубрега. Киднеи Инт 2012;2:1–138.

3 Сцхумер М, Цоломбел МЦ, Савцзук ИС, Глобе Г, Цоннор Ј, О'Тооле КМ, Олссон ЦА, Висе ГЈ, Буттиан Р: Морфолошки, биохемијски и молекуларни докази апоптозе током фазе реперфузије након кратких периода исхемије бубрега Ам Ј Патхол 1992;140:831-838.

4 Сцхумер АТ, Давиес ДР, МцЛарен АЈ, Церундоло Л, Моррис ПЈ, Фуггле СВ: Апоптоза у исхемијској/реперфузионој повреди хуманих бубрежних алографта. Трансплантација 1998;66:872-876.

5 Дегтерев А, Хуанг З, Боице М, Ли И, Јагтап П, Мизусхима Н, Цуни ГД, Митцхисон ТЈ, Московитз МА, Иуан Ј: Хемијски инхибитор неапоптотске ћелијске смрти са терапеутским потенцијалом за исхемијску повреду мозга. Нат Цхем Биол 2005; 1:112–119.

6 Ванденабееле П, Галлуззи Л, Ванден Бергхе Т, Кроемер Г: Молекуларни механизми некроптозе: уређена ћелијска експлозија. Нат Рев Мол Целл Биол 2010;11:700–714.

7 Цхен Кс, Ли В, Рен Ј, Хуанг Д, Хе ВТ, Сонг И, Ианг Ц, Ли В, Зхенг Кс, Цхен П, Хан Ј: Транслокација мешовитог лозног протеина налик домену киназе у плазма мембрану доводи до некротичне ћелије смрти. Целл Рес 2014; 24:105–121.

8 Цаи З, Јиткаев С, Зхао Ј, Цхианг ХЦ, Цхокси С, Лиу Ј, Вард И, Ву ЛГ, Лиу ЗГ: Транслокација плазма мембране тримеризованог МЛКЛ протеина је потребна за ТНФ-индуковану некроптозу. Нат Целл Биол 2014; 16:55–65.

9 Ванг И, Лиу И, Лиу И, Зхоу В, Ванг Х, Ван Г, Сун Д, Зханг Н, Ванг И: Полимерни пролек цисплатина на бази пулулана за циљану терапију против хепатоцелуларног карцинома. Инт Ј Пхарм 2015; 483:89–100.

10 Пабло Н, Донг З: Нефротоксичност цисплатина: механизми и ренопротективне стратегије. Киднеи Инт 2008;73:994–1007.

11 Ми КСЈ, Хоу ЈГ, Ванг З, Хан И, Рен С, Ху ЈН, Цхен Ц, Ли В: Заштитни ефекти малтола на нефротоксичност изазвану цисплатином кроз АМПК-посредоване ПИ3К/Акт и п53 сигналне путеве. Сци Реп 2018;8:15922.

12 Озкок А, Еделстеин ЦЛ: Патофизиологија акутне повреде бубрега изазване цисплатином. Биомед Рес Инт 2014;2014:1–17.

13 Хугхес РЦ: Секреција породице галектина протеина који везују угљене хидрате сисара. Биоцхим Биопхис Ацта 1999;1473:172-185.

14 Лиу ФТ, Паттерсон РЈ, Ванг ЈЛ: Интрацелуларне функције галектина. Биоцхим Биопхис Ацта 2002;1572:263- 273.

15 ван ден Бруле ФА, Валтрегни Д, Лиу ФТ, Цастроново В: Промена обрасца цитоплазматске/нуклеарне експресије галектина-3 корелира са прогресијом карцинома простате. Инт Ј Цанцер 2000;89:361-367.

16 Ксуе Ј, Гао Кс, Фу Ц, Цонг З, Јианг Х, Ванг В, Цхен Т, Веи К, Кин Ц: Регулација галектином-3-индуковане апоптозе Јуркат ћелија и О-гликанима и Н-гликанима на ЦД45. ФЕБС Летт 2013;587:3986-3994.

17 Матарресе П, Фусцо О, Тинари Н, Натоли Ц, Лиу ФТ, Семераро МЛ, Малорни В, Иацобелли С: Прекомерна експресија галектина{1}} штити од апоптозе побољшавајући својства ћелијске адхезије. Инт Ј Цанцер 2000;85:545- 554.

18 Ока Н, Накахара С, Такенака И, Фукумори Т, Хоган В, Канаиама ХО, Ианагава Т, Раз А: Галектин-3 инхибира апоптозу изазвану лигандом изазвану фактором некрозе тумора лигандом тако што активира Акт у људској бешици ћелије карцинома. Цанцер Рес 2005;65:7546-7553.

19 Хасхми С, Ал-Салам С: Галектин-3 је изражен у миокарду врло рано након инфаркта миокарда. Цардиовасц Патхол 2015;24:213-223.

20 Зханг С, Ли Р, Донг В, Ианг Х, Зханг Л, Цхен И, Ванг В, Ли Ц, Ву И, Ие З, Зхао Кс, Ли З, Зханг М, Лиу С, Лианг Кс: РИПК3 посредује у бубрежним тубулама апоптоза епителних ћелија код акутне повреде бубрега изазване ендотоксином. Мол Мед Реп 2019;20:1613-1620.

21 Лиианаге Т, Ниномииа Т, Јха В, Неал Б, Патрице ХМ, Окпецхи И, Зхао МХ, Лв Ј, Гарг АКС, Книгхт Ј, Родгерс А, Галлагхер М, Котвал С, Цасс А, Перковић В: Приступ лијечењу широм свијета за крајњу болест бубрега: систематски преглед. Ланцет 2015;385:1975-1982.

22 Турк Б, Стока В: Сигнализација протеазе у ћелијској смрти: каспазе у односу на цистеин катепсине. ФЕБС Летт 2007;581:2761–2767.

23 Павлоцк ГС, Соутхард ЈХ, Старлинг ЈР, Белзер ФО: Ослобађање лизозомалног ензима у хиподермално перфузираним бубрезима пса. Цриобиологи 1984;21:521-528.

24 Верле Б, Јулке Б, Лах Т, Спиесс Е, Еберт В: Фракција катепсина Б активна при физиолошком пХ од 7,5 је од прогностичког значаја у карциному сквамозних ћелија људских плућа. Бр Ј Цанцер 1997; 75: 1137–1143.

25 Ванг Ц, Јианг З, Иао Ј, Ву Кс, Сун Л, Лиу Ц, Дуан В, Иан М, Сун Л, Лиу Ј, Зханг Л: Учешће катепсина Б у апоптози изазваној емодином у ХК-2 Ћелије. Токицол Летт 2008;181:196–204.

26 Сузуки Ц, Танида И, Охмураиа М, Олива Трејо ЈА, Какута С, Сунабори Т, Уцхииама И: Недостатак катепсина Д у бубрежним проксималним тубуларним ћелијама резултирао је повећаном осетљивошћу против реналне исхемије/реперфузијске повреде. Инт Ј Мол Сци 2019; 20:1711.

27 Ламеире Н, Ван Биесен В, Ванхолдер Р. Акутна бубрежна инсуфицијенција. Ланцет 2005;365:417-430.

28 Иу В, Цхен И, Дубрулле Ј, Стасси Ф, Путлури В, Среекумар А, Путлури Н, Балуиа Д, Лаи СИ, Сандулацхе ВЦ: Цисплатин генерише оксидативни стрес који је праћен брзим променама у централном метаболизму угљеника. Научни представник 2018;8:4306.

29 Аидиноз С, Узун Х, Цермикетал Г: Ефекти различитих доза хипербаричног кисеоника на нефротоксичност изазвану цисплатином. Бубрежна инсуфицијенција 2007;29:257–263.

30 Сиддик ЗХ: Цисплатин: начин цитотоксичног деловања и молекуларна основа резистенције. Онцогене 2003; 22:7265–7279.