Парт 1|Генетске варијације имплицирају ангиопоетин у плазми-2 у развоју субфенотипова акутне повреде бубрега

Паван К. Бхатрају1,2*, Мак Цохен1, Риан Ј. Нагао3,4, Ериц Д. Моррелл1, Сусанна Косамо1, Ксин-Иа Цхаи1, Робин Нанце5, Вицториа Дмитерко1, Јосепх Деланеи5, Јасон Д. Цхристие6, Катхлеен Д. Лиу7, Цармен Микацениц1, Сина А. Гхариб1, В. Цонрад Лилес8, Иинг Зхенг3,4, Давид Ц. Цхристиани9,10, Јонатхан Химмелфарб2 и Марк М. Вурфел1,2

Апстрактан

Позадина:Раније смо идентификовали дваакутнабубрегаповреда(АКИ) субфенотипови (АКИ-СП1 и АКИ-СП2) са различитим ризицима од лоших клиничких исхода и одговора на терапију вазопресорима. Биомаркери ендотелне дисфункције у плазми (рецептор фактора некрозе тумора-1, ангиопоетин-1 и 2) разликовали су подфенотипове АКИ.

Међутим, није познато да ли су ови биомаркери само маркери или узрочни посредници у развоју подфенотипова АКИ.

Методе:Тестирали смо повезаност између једнонуклеотидних полиморфизама унутарангиопоетин-1, ангиопоетин-2,иРецептор фактора некрозе тумора 1Агена и АКИ-СП2 код 421 критично болесног субјекта европског порекла. Једнонуклеотидни полиморфизми са најбољим учинком (ФДР < 0.05)="" су="" тестирани="" на="" експресију="" цис-биомаркера="" и="" да="" ли="" је="" генетски="" ризик="" за="" аки-сп2="" посредован="" кроз="" циркулишуће="" биомаркере.="" такође="" смо="" завршили="" ин="" витро="" студије="" користећи="" микроваскуларне="" ендотелне="" ћелије="" људског="" бубрега.="" коначно,="" израчунали="" смо="" бубрежни="" клиренс="" биомаркера="" у="" плазми="" користећи="" 20="" различитих="" временских="" колекција="">

Резултати:Генетска варијанта, рс2920656Ц > Т, близуАНГПТ2је био повезан са смањеним ризиком од АКИ-СП2 (однос шансе, 0.45; 95 процената ЦИ, 0.31–0.66; прилагођени ФДР=0.003 ) и смањен ангиопоетин у плазми-2 (p = 0.002). Анализа узрочних закључака је показала да се за сваки мањи алел (Т) ризик од развоја АКИ-СП2 смањује за 16 процената. Ангиопоетин у плазми{5}} је посредовао у 41,5 процената ризика везаног за рс2920656 за АКИ-СП2. Микроваскуларне ендотелне ћелије људског бубрега које носе Т алел рс2920656 произвеле су нумерички ниже нивое ангиопоетина-2 иако то није било статистички значајно (p = 0.07). Коначно, анализе су показале да се ангиопоетин-2 минимално чисти код критично болесних субјеката.

Закључак:Анализа генетског посредовања пружа поткрепљујуће доказе да ангиопоетин-2 игра узрочну улогу у ризику од АКИ-СП2.

Кључне речи: Акутна повреда бубрега, генетика, ендотел

За више информација контактирајте:emily.li@wecistanche.com

Цистанцхе десертицола спречава болест бубрега, кликните овде да бисте добили узорак

Позадина

Акутнабубрегаповреда(АКИ) погађа 40–60 процената пацијената примљених на јединицу интензивне неге (ИЦУ) и доприноси лошим краткорочним и дугорочним исходима. Досадашње генетске студије су се фокусирале на повезаност између генетских варијанти и ризика за АКИ упоређујући случајеве (АКИ) са контролама (без АКИ). Међутим, овај оквир може бити ограничен због случајеваАкутнабубрегаповредасу веома хетерогени са различитим таложницима и биолошким профилима. Комбиновање таквих пацијената са АКИ да би се максимизирала величина узорка може довести до разблажења генетских статистичких сигнала који могу бити присутни само у једној патофизиолошки различитој подскупини популације АКИ. Друго ограничење је да је АКИ код критично болесних популација често компликација озбиљних увреда, као што су сепса, операција, шок, упала плућа и траума. Употреба контрола без развојаАкутнабубрегаповредаможе бити проблематично. Контроле које носе генетску варијанту високог ризика можда неће развити АКИ ако такође не доживе сличну акутну увреду као случајеви, и стога би биле класификоване као не-случајеви, умањујући сваки потенцијални сигнал повезаности. Употреба биолошки различитих подфенотипова АКИ у студијама генетских асоцијација превазилази претходна ограничења у фенотипизацији АКИ тако што се посебно фокусира на АКИ популацију и упоређује два биолошки различита субфенотипа.

Недавно смо идентификовали два подфенотипа АКИ (АКИ-СП1 и АКИ-СП2) применом методологије анализе латентне класе на панел од 29 клиничких и биомаркерских варијабли у две независне критично болесне популације АКИ. Значајно је да је АКИ-СП2 био повезан са лошијим болничким исходима (нпр. морталитет, нова дијализа и 7-дневни бубрежни неопоравак) у поређењу са АКИ-СП1. Затим смо идентификовали ове подфенотипове АКИ у претходно завршеном мултицентричном рандомизованом контролном испитивању, инфузија вазопресина против норепинефрина код пацијената са септичким шоком (ВАССТ). Испитивање ВАССТ је проучавало да ли је избор терапије вазопресором побољшао морталитет код субјеката са септичким шоком. Док популација АКИ у клиничком испитивању није имала разлику у морталитету од терапије вазопресорима, АКИ-СП1 је имао корист од морталитета са вазопресином у поређењу са АКИ-СП2 без разлике у морталитету. Колико знамо, ово је први пример идентификације подгрупа АКИ које реагују на лечење код критично болесних.

Значајно је да ниједна појединачна варијабла није била статистички боља од осталих варијабли за идентификацију АКИ-СП2 (Табела 1). Насупрот томе, модел са три варијабле, који користи ангиопоетин-2 у плазми (АНГ-2), ангиопоетин-1 (АНГ-1) и растворљиви рецептор фактора туморске некрозе{{8 }} (сТНФР-1), имао је оптималне предиктивне перформансе за разликовањеАкутнабубрегаповредасубфенотипови (Ц-статистика 0.93). Нижи АНГ-2, нижи сТНФР-1 и виши АНГ-1 били су повезани са мањим ризиком од АКИ-СП2. Студије на животињским моделима АКИ су показале да су ови биомаркери у плазми укључени у

патофизиологија и тежина АКИ. Међутим, није познато да ли ови биомаркери у плазми играју узрочну улогу у развоју клиничке сликеАкутнабубрегаповредасубфенотипови. Идентификација узрочних маркера би могла да информише циљеве за развој лекова за спречавање или лечење развојаАкутнабубрегаповредакод критично болесних и може помоћи у стратификацији ризика пацијената.

Анализа генетског посредовања је један од неколико приступа каузалног закључивања који може да идентификује потенцијални механизам којим независна варијабла (нпр. генетска варијанта) утиче на исход (нпр. АКИ подфенотипови) преко објашњавајућег посредника (нпр. биомаркера ендотелне дисфункције) . Овај приступ је широко примењен у клиничким подацима да би се разумели узрочни механизми болести. Претпоставили смо да су локуси цис-квантитативних особина (КТЛ) уАНГПТ1, АНГПТ2 и ТНФРСФ1Агени утичу на развој подфенотипова АКИ тако што регулишу циркулишуће нивое својих одговарајућих биомаркера (АНГ-1, АНГ-2 или сТНФР-1).

Методе

Проучавајте популације

Претходно смо известили о идентификацији подфенотипова АКИ-а користећи проспективно прикупљену кохорту интензивне неге: идентификација полиморфизама појединачних нуклеотида (СНП) који предиспонирају измењени ризик од акутне повреде плућа (иСПААР). иСПААР популација је студија случаја и контроле ризика од синдрома акутног респираторног дистреса (АРДС) која обухвата пацијенте са и без АРДС-а. иСПААР популација је укључивала субјекте из претходно завршених рандомизованих контролних испитивања и из проспективно уписане кохорте интензивне неге. Детаљи дизајна студије за сваку популацију уписану у иСПААР су претходно описани; Албутерол за лечење акутне повреде плућа (АЛТА), испитивање течности и катетера (ФАЦТТ), ентерална омега{3}} масна киселина, гама-линоленска киселина и додатак антиоксидансима код акутне повреде плућа (ОМЕГА)

и Молекуларна епидемиологија акутног респираторног дистреса (МЕА) у Општој болници у Масачусетсу. У оквиру иСПААР-а, упис у студију се десио 48 х након пријема у интензивну негу. Приликом уписа у студију ДНК и плазма су сакупљени за генотипизацију и анализу биомаркера, а затим суАкутнабубрегаповредаконстатација. АКИ је дефинисан као повећање серумског креатинина (СЦр) већег од или једнако 0.3 мг/дл или 50 процената од „основног“ СЦр. Основни СЦр је дефинисан као најнижа вредност пре уписа у студију. АКИ је такође дефинисан коришћењем модификованих критеријума за излучивање урина (дневно излучивање уместо сваких 6 х).

Да бисмо одредили бубрежни клиренс биомаркера у плазми, уписали смо проспективну кохорту у медицинске и хируршке јединице интензивне неге Харборвиев, критична болестАкутнабубрегаповредаКохорта (ЦИА). Субјекти су били подобни за упис ако су испунили 2 од 4 критеријума синдрома системског инфламаторног одговора, имали су клинички сумњиву инфекцију и имали су стални уринарни катетер. Завршено је темпирано прикупљање урина које је трајало најмање 2–4 х, а узорци ЕДТА плазме су сакупљени на почетку и на крају временског прикупљања урина. Клиренс је израчунат коришћењем формуле Клиренс(X) = U(X) * V/ P(X), гдеU(X) представља концентрацију растворене супстанце у уринуX, V означава запремину урина током периода сакупљања од 2–4- х, иP (X) представља просечне концентрације растворене супстанце у плазмиX из почетних и завршних узимања крви.

Стратегија генотипизације

Генотипизација је обављена код 421 пацијента европског порекла коришћењем платформе Иллумина 660 (Иллумина, Сан Диего, ЦА). Квалитет генотипизованих података је контролисан коришћењем филтера стопе позива узорка > 0.97, фреквенције мањег алела (МАФ) > 0.01 и СНП стопе позива > 0.95. Након контроле квалитета, 238 СНП ±50 килобаза одАНГПТ1, АНГПТ2,иТНФРСФ1Анађена. После неравнотеже везе (ЛД) орезивање р²од {{0}}.8, 48 СНП-ова је уклоњено што је довело до укупно 190 СНП-ова коришћених у тестовима асоцијације. Импутација је спроведена коришћењем референтног панела пројекта 1000 Геномес користећи ИМПУТЕ2 в2.3.0.

Процена протеина у плазми

Биомаркери плазме и урина мерени су коришћењем електрохемилуминисцентних имунотестова (Месо Сцале Дисцовери (МСД), Роцквилле, МД), као што је претходно описано. Крв је сакупљена у стерилне епрувете третиране ЕДТА, урин је сакупљен у стерилне контејнере и обе су одмах центрифугиране. Плазма и урин су затим подељени на аликвоте и замрзнути на -80 степени. Узорци су чувани различито време, али су одмрзнути у једној серији и само једном за спровођење мерења биомаркера за ову студију. Сва мерења биомаркера обављена су у дупликатима у Харборвиев Пулмонари Ресеарцх Лабораториес.

Ин Силицо анализе

Да бисмо тестирали СНП за експресију КТЛ ефеката, упитали смо портал Генотипе-Тиссуе Екпрессион (ГТЕк).

Ћелијска култура

Микроваскуларне ендотелне ћелије људског бубрега (ХКМЕ Цс) су пречишћене из феталних бубрега након добровољних прекида трудноће између 100 и 135 дана након зачећа. Од пацијената је добијен информисани пристанак за употребу феталних ткива. Затим смо насумично изабрали 9 различитих ХКМЕЦ-а донатора, одмрзнули и ставили пола милиона ћелија у Т25 боце обложене са 0,2 процента желатина и држане у ЕБМ-2 базалном медијуму који садржи 1 проценат антибиотика-антимикотика (Лифе Тецхнологиес), 10 процената ФБС, 100 уг/мЛ ЕЦГС, 50 уг/мЛ хепарина и 20 нг/мЛ ВЕГФ (Р&Д), 48 х до конфлуенције. Након 48 х, пречистили смо геномску ДНК из ХКМЕЦ-а и сакупљени су ћелијски супернатанти. Успешно смо генотиповали ћелије од 8 донора.

Статистичка анализа

Демографске варијабле пацијената су пријављене као средња вредност плус /-стандардна девијација или као медијана и квартили. Прво смо користили логистичку регресију да тестирамо повезаност између 190 СНП-ова и развоја АКИ-СП2 у поређењу са АКИ-СП1 користећи адитивни генетски модел (Голден Хелик, МТ). Наш модел је коришћен за следеће коваријате: старост, пол, сепса и првих пет главних компоненти. За израчунавање главних компоненти коришћена је Еигенстрат метода в4.2, а првих пет је укључено као коваријате. Односи шансе (ОР) су пријављени са интервалима поверења од 95 процената. За анализу између генетских варијанти и под-фенотипова АКИ, исправили смо вишеструка поређења користећи праг Бењамини-Хоцхбергове стопе лажног откривања (ФДР) < 0,10,="" што="" процењује="" да="" је="" мање="" од="" 10="" процената="" асоцијација="" са="" фдр="" вредношћу="" на="" или="" испод="" овај="" ниво="" су="" лажно="" позитивни="" [31].="" у="" анализи="" осетљивости,="" импутирани="" генотип="" је="" коришћен="" за="" идентификацију="" додатних="" снп="" повезаних="" са="">

Друго, користили смо прилагођавање линеарне регресије за старост, пол и сепсу да бисмо утврдили повезаност између СНП-а са најбољим учинком и лог₂трансформисане концентрације биомаркера. Треће, завршили смо анализу узрочних закључака да бисмо тестирали повезаност између генетских варијанти и АКИ-СП2 и потенцијално посредовање те повезаности концентрацијама биомаркера у плазми. Анализа медијације је извршена коришћењем нелинеарне имплементације моделирања структурне једначине имплементиране у пакету медијације за СТАТА [32, 33]. Додатни детаљи анализе каузалних закључака дати су у онлине додатку. Четврто, утврдили смо повезаност између генетских варијанти и тежине АКИ, мерене максималним серумским креатинином, путем логистичке регресије. Додатни детаљи о материјалима и методама дати су у онлине додатку. У анализи смо проценили 190 СНП-а и користили конзервативнуп-вредностод 0.05/190 =2.6 × 10^{− 4}. Имајући у виду да приближно 40 процената пацијената на интензивној нези развије АКИ, а очекивани однос контроле (АКИ-СП1) и случаја (АКИ-СП2) је 1,5, очекивана величина узорка од 421 и МАФ од најмање { {16}}.30, имаћемо 81 проценат снаге да откријемо релативни ризик од 1,5 или већи [34]. Анализе су завршене коришћењем СТАТА (верзија 15) и Голденхелик-а (верзија 4.0). Све студије је одобрио Одсек за људске субјекте Универзитета у Вашингтону. Од свих уписаних субјеката добијена је писмена информисана сагласност.

Резултати

Карактеристике популација Од 425 пацијената из кохорте за валидацију у нашем претходном раду, 421 је имао податке о генотипизацији. Демографија и основне клиничке карактеристике описане су у табели 1. Сви испитаници су били европског порекла. Укупно 267 (63 процента) је класификовано као АКИ-СП1 и 154 (37 процената) као АКИ-СП2. Субјекти који су развили АКИ-СП2 имали су већу озбиљност болести на презентацији (средња оцена акутне физиологије и хроничне здравствене процене (АПАЦХЕ) ИИИ, 111 ± 26 наспрам 74 ± 24), већа је вероватноћа да ће имати сепсу (84 процента наспрам 66 процената), и већа је вероватноћа да ће бити лечени вазопресорима (79 процената наспрам 42 процента) у поређењу са АКИ-СП1.

Генетска варијација у близини АНГПТ2, рс2920656, повезана је са АКИ-СП2

Од 190 СНП-ова ±50 килобаза гена, 72 је било близу АНГПТ1, 100 је било близу АНГПТ2, а 18 је било близу гена ТНФРСФ1А. Идентификовали смо један СНП који је имао ФДР < 0,05="" који="" је="" био="" повезан="" са="" аки-сп2="" у="" поређењу="" са="" аки-сп1="" (табела="" 2="" и="" слика="" 1).="" нису="" примећене="" значајне="" везе="" са="" снп-овима="" у="" или="" близу="" ангпт1="" или="" тнфрсф1а="" (табела="" с2="" и="" с3).="" снп="" који="" показује="" најјачу="" повезаност="" са="" ризиком="" за="" аки-сп2="" био="" је="" рс2920656="" (ор,="" 0,45;="" 95="" процената="" ци,="" 0,31–0,66;="" п="">< 1,4="" ×="" 10−5;="" фдр="0.003)." овај="" интронички="" снп="" је="" ≈="" 30="" кб="" низводно="" до="" 3′="" позиције="" ангп="" т2="" и="" објашњава="" приближно="" 3="" процента="" варијансе="">

развој АКИ-СП2 (Р2). Пошто је само мали број испитаника био хомозиготан рс2920656 (н=26), такође смо тестирали повезаност између рс2920656 и АКИ-СП2 у доминантном генетском моделу, што је дало конзистентан резултати (ОР, 0,42; 95 процената ЦИ, 0,28–0,64; п < 1,4="" ×="" 10−6).="" такође="" смо="" тестирали="" додатне,="" потенцијално="" јаче,="" асоцијације="" унутар="" ангпт2="" локуса="" користећи="" импутиране="" генотипове,="" али="" нисмо="" пронашли="" ниједну="" јачу="" асоцијацију="" од="" оне="" која="" је="" примећена="" код="" рс2920656="" (табела="" с4).="" у="" анализи="" осетљивости="" тестирали="" смо="" да="" ли="" је="" укључивање="" критично="" болесних="" пацијената="">Акутнабубрегаповредаби утицало на генетску асоцијацију. Груписали смо пацијенте без АКИ и АКИ-СП1 заједно и утврдили да ли је рс2920656 још увек снажно повезан са смањеним ризиком од АКИ-СП2. У овој анализи, 839 пацијената није имало АКИ или АКИ-СП1, а 154 је имало АКИ-СП2. Ризик од поновног развоја АКИ-СП2 је значајно смањен са постојањем најмање једног Т алела за рс2920656 (ОР 0.31; 95 процената ЦИ, 0.19–0.52; п < 0,001)="" (табела="" с5).="" у="" другој="" анализи="" осетљивости,="" тестирали="" смо="" да="" ли="" је="" рс2920656="" повезан="" са="" смањеним="" ризиком="" од="" аки-сп2="" у="" оквиру="" сваке="" од="" четири="" различите="" студије="" које="" су="" укључене="" у="" испаар.="" у="" оквиру="" сваког="" од="" три="" рандомизована="" контролна="" испитивања="" (алта,="" фацтт="" и="" омега)="" и="" проспективне="" кохорте="" интензивне="" неге="" (меа),="" процена="" тачке="" је="" била="" у="" складу="" са="" мањим="" алелом="" рс2920656="" који="" показује="" смањени="" ризик="" за="" развој="" аки-сп2="" (табела="" с6="" ).="" стога="" је="" рс2920656="" даље="" анализиран="" да="" би="" се="" утврдила="" повезаност="" са="" концентрацијама="" биомаркера="" у="">

Т алел рс2920656 је повезан са смањеним АНГ у плазми-2

Затим смо анализирали повезаност између концентрација рс2920656 и АНГ-2 у плазми. Прилагођавање старости, пола и сепсе, свака копија Т алела рс2920656 била је повезана са смањеним лог2 концентрацијама АНГ-2 у плазми (= − 0,09; 95 процената ЦИ {{9} }.15, − 0.04; П=0.002). Испитаници хомозиготни за алел Ц показали су највеће концентрације АНГ-2 у плазми (40,683 пг/мл; интерквартилни опсег (ИКР) 19,374-73,205), док су субјекти хомозиготни за алел Т показали најнижу концентрације АНГ-2 у плазми (28,308 пг/мл (ИКР 14,340-42, 944). Поред тога, од 100 СНП-ова тестираних у близини АНГП Т2 генског региона, рс29206565 је био најјаче повезан са АНГ у плазми -2 концентрације (слика 2).

Анализа посредовања сугерише да је АНГ-2 узрочник у развоју АКИ-СП2

Тестирали смо за доказе да је повезаност између рс2920656 и ризика за АКИ-СП2 посредована концентрацијама АНГ-2 у плазми (слика 3). Укупан ефекат рс2920656 на АКИ-СП2 био је укупан=− 0.16 по алелу (95 процената ЦИ -0.24, − 0 .10, п=1.0 × 10− 4), што сугерише да се за сваки мањи алел (Т алел) генетске варијанте ризик од развоја АКИ-СП2 смањује за 16 процената. Анализа узрочне медијације открила је значајан индиректан ефекат за рс2920656 на АКИ-СП2 који је посредован концентрацијама АНГ-2 у плазми (индиректно, − 0,07 по алелу; 95 процената ЦИ -0.11, − 0,03; п { {34}}.001), што значи да је пропорција ефекта између рс2920656 и АКИ-СП2 посредована концентрацијама АНГ-2 41,5 процената.

Т алел рс2920656 је повезан са смањеном тежином АКИ након 7 дана

Затим смо тестирали повезаност рс2920656 са традиционалним критеријумима за озбиљност АКИ, као што су максимални креатинин у серуму и повећање серумског креатинина у року од 7 дана након уписа у студију. У доминантном генетском моделу, алел Т од рс2920656 је био повезан са смањењем серумског креатинина од −0.44 мг/дЛ (95 процената ЦИ, −0.77 , − 0.10), п=0.01) након прилагођавања старости, пола, индекса телесне масе и статуса сепсе. Мањи алел рс2920656 је такође повезан са смањењем пораста серумског креатинина између почетне вредности и 7. дана (= − 0,25, 95 процената ЦИ, − 0,46, − 0,03; п=0.03)

Т алел рс2920656 је повезан са нижим АНГ-2 у ћелијској култури

Спровели смо ин витро експерименте и ин силико анализе да бисмо утврдили функционални значај рс2920656. Од 8 различитих људских фетусабубрегаткиваузорци, 2 су били ЦЦ, 5 су били ЦТ, а 1 је био ТТ за рс2920656. У доминантном генетском моделу, концентрације АНГ-2 биле су нумерички највеће у ендотелним ћелијама донора хомозиготних за алел Ц и ниже код носилаца алела Т, п=0.07 (слика 4). У бази података пројекта ГТЕк, рс2920656 није био повезан са експресијом гена АНГПТ2. Међутим, два друга СНП-а (рс41311412 и рс2515591) која су у умереној ЛД (р2=0.23 и Д'=0.86) са рс2920656 су повезана са смањеном експресијом гена АНГПТ2 (п=4.1 × 10− 5 ) у тибијалној артерији, ткиву које је високо обогаћено ендотелним ћелијама (Табела С7).

АНГ-2 плазме минимално чисте бубрези Да би се утврдило да ли су разлике убубрегафункцијаможе утицати на концентрацију АНГ{{0}} у плазми, измерили смо бубрежни клиренс АНГ-2 код критично болесних субјеката са и без АКИ. У 20 различите временске колекције узорака урина са резервисаним узорцима плазме, средњи креатинин у серуму је био 0.86 мг/дЛ са интерквартилним опсегом (ИКР) од 0,69 до 1,45 мг/дЛ. Средња концентрација АНГ-2 у плазми била је 10,261 пг/мЛ (ИКР 6210–19,115 пг/мЛ). Насупрот томе, концентрације АНГ-2 у урину су биле 50-пута ниже са медијаном од 206 пг/мЛ (ИКР 11–839 пг/мЛ). Израчунати бубрежни клиренс АНГ-2 био је < 1="" мл/мин="" за="" све="" временске="" колекције="" урина,="" што="" сугерише="" да="" концентрације="" анг-2="" у="" плазми="" нису="" повећане="" само="" као="" функција="" погоршања="" аки="" (табела="">