Парт 1|Хиперактивност гликоген синтазе киназе 3б у ћелијама ексфолијираних урина предвиђа прогресију дијабетесне болести бубрега

Ксианхуи Лианг, ет ал

1Центар за пречишћавање крви, Институт за нефрологију, Прва придружена болница Универзитета Џенгџоу, Џенгџоу, Кина; 2 Одељење за медицину, Одсек за бубрежне болести и хипертензију, болница Рходе Исланд, Медицински факултет Универзитета Браун, Провиденс, Род Ајленд, САД; и 3 Одсек за медицину, Одсек за нефрологију, Медицински факултет Универзитета у Толеду, Толедо, Охајо, САД

За више информација контактирајте:emily.li@wecistanche.com

Цистанцхе тубулоса спречава болест бубрега, кликните овде да бисте добили узорак

Све већи докази указују на то да је гликоген синтаза киназа (ГСК)3б кључни играч у различитимболести бубрега. Међутим, као централни претварач сигналног пута инсулина, улога ГСК3б код дијабетичарабубрега болестостаје неизвесно. Код ДБ/ДБ мишева, бубрежна експресија укупног и активираног ГСК3б је била све више повишена. Ово је претходило развоју дијабетичарабубрега болести у корелацији са прогресијом знаковадијабетичарбубрегаповреда, укључујући албуминурију и акумулацију екстрацелуларног матрикса у гломерулима и тубулоинтерстицијалним. Ин витро, излагање гломеруларних подоцита, мезангијалних ћелија и бубрежних тубуларних ћелија дијабетичком миљеу изазвало је ГСК3боверекспресију и хиперактивност, што се чини неопходним и довољним за изазивањедијабетичарћелијска оштећења у ћелијама бубрега, јер је цитопатски ефекат дијабетичког миљеа ублажен обарањем ГСК3б, али је опонашан ектопичном експресијом конститутивно активног ГСК3б чак и у нормалном окружењу. Недоследност, узорци биопсије бубрега добијени од пацијената са различитим стадијумима дијабетичке нефропатије открили су појачану експресију укупног и активираног ГСК3б у гломерулима и бубрежним тубулима, повезану са озбиљношћу дијабетичке нефропатије. Штавише, у ретроспективним кохортама пацијената са дијабетесом типа 2 које су праћене више од пет година, релативна активност ГСК3б у ћелијама ексфолијираних уринарних ћелија представљала је независни фактор ризика за развој или прогресију оштећења бубрега. Штавише, анализа оперативне карактеристичне криве пријемника показала је да активност ГСК3б у ћелијама ексфолијираних у урину даје много бољу снагу од албуминурије код разликовања пацијената са дијабетесом са прогресивним оштећењем бубрега од оних са стабилном функцијом бубрега. Дакле, бубрежна експресија и активност ГСК3б се појачавају у експерименталној и клиничкој дијабетичкој нефропатији. Дакле, ГСК3б у ћелијама ексфолијираних у урину може послужити као нови биомаркер за предвиђање дијабетичарабубрегаболестнапредовање.

Дијабетичка болест бубрега(ДКД) и даље представља водећи узрок завршног стадијума затајења бубрега у Сједињеним Државама и другим развијеним земљама.1,2 Међутим, не развијају сваки пацијент са дијабетес мелитусом дијабетичку нефропатију (ДН), о чему сведочи низ дуготрајних термин епидемиолошких накнадних студија.3 Разлог за овај хетерогени исход није у потпуности схваћен, али је наизглед мултифакторски, укључујући различите узрочне факторе, укључујући генетику, окружење, постојећебубрегаболести озбиљност дијабетеса.4,5 Лоша контрола гликемије је добро познати фактор ризика за албуминурију и ДН. Ипак, значајан део пацијената и даље развија ДН упркос строгој контроли гликемије.6 У клиничкој пракси, неопходно је усвојити осетљив и прецизан биомаркер за стратификацију дијабетичара са ризиком од прогресије до оштећења бубрега. Годинама се албуминурија сматрала сурогат маркером бубрежних компликација код дијабетеса.7,8 Ипак, све већи број доказа сугерише да албуминурија можда није тачна.9,10 Примећена је значајна неслагања између албуминурије и оштећења бубрега у ДН. 11,12 Према подацима Проспективне студије о дијабетесу Уједињеног Краљевства,13 од оних пацијената који су развили оштећење бубрега, 61 проценат није претходно имало албуминурију, а 39 процената никада није развило албуминурију током студије. Исто тако, од оних пацијената који су развили албуминурију, само 24 процента је касније развило оштећење бубрега током студије. Другим речима, код пацијената са микроалбуминуријом или макроалбуминуријом, преовлађујућа већина можда неће развити оштећење бубрега. Ови подаци стога оспоравају класичну парадигму албуминурије која увек претходи оштећењу бубрега током прогресије ДКД. Као такав, императив је идентификовати нове биомаркере.

за предвиђање ДН или за рану дијагнозу ДН. У протеклој деценији тестиран је низ нових молекула.14–16 Међу њима, гликоген синтаза киназа 3 (ГСК3) се појавила као атрактиван кандидат. ГСК3 је високо очувана, свеприсутно експримирана серин/треонин-протеин киназа која је првобитно била окарактерисана као кључни претварач сигналне каскаде инсулина и управља гликогенезом. Интерес за ГСК3 се увелико повећао са спознајом да он такође делује као тачка конвергенције за вишеструке ћелијске сигналне путеве укључене уупала, имуномодулација, ембриогенеза, повреда ткива, поправка и регенерација.17–19 ГСК3 постоји као 2 изоформе: ГСК3а и ГСК3б. У различитим ткивима органа, 2 изоформе су различито изражене. У кортексу бубрега, б изоформа је претежно експримирана и лоцирана у гломерулима и проксималним тубуларним ћелијама.20,21 Прекомерна активност бубрежног ГСК3б повезана је са различитим низом болести бубрега, укључујући протеинуричне гло-неуропатије и прогресивну хроничну болест бубрега.22 Ипак , као кључног трансдуктора сигналног пута инсулина, улога ГСК3б у патогенези ДН је још непозната. Остаје да се разјасни да ли је дисрегулација ГСК3б у бубрезима укључена у ДН. Да би се позабавило овим питањем, ова студија је испитала профиле експресије укупног и активираног ГСК3б у узорцима бубрега добијеним из дБ/дБ мишјих модела ДН не-зависног од инсулина и у ткивима биопсије бубрега пацијената са различитим стадијумима ДН типа 2. Поред тога, у ретроспективним групама пацијената са дијабетесом типа 2, мерени су нивои експресије укупног и активираног ГСК3б у ћелијама ексфолијираних урина, које су узорковане као течна биопсија бубрега на бази урина. Испитивали смо однос између нивоа експресије ГСК3б или његовог активираног облика у основним уринарним ексфолијираним ћелијама и развоја или прогресије оштећења бубрега код пацијената са дијабетесом.

РЕЗУЛТАТИ

ГСК3б је прекомерно експримиран и хиперактиван у бубрежним паренхимским ћелијама код дб/дб мишева, повезан са прогресијом албуминурије и дијабетичком повредом бубрега

дб/дб мишеви са недостатком рецептора лептина су добро успостављени модели за дијабетес мелитус типа 2 и ДН. Почевши од 10 недеља старости, дб/дб мишеви спонтано развијају ране знакеповреде бубрега, коју карактерише прогресивна албуминурија и акумулација матрикса у гломерулима.23 Насупрот томе, контролни (дб/м) мишеви имају нормалну гликемију и нема видљивих доказа ообољење бубрега. У експерименту који је почео са 10 недеља старости, бубрежна експресија укупног (Слика 1) и активираног (Слика 2) ГСК3б (фосфорилисаног на И216 [п-ГСК3Б]) код дб/дб мишева у односу на контролне дб/м мишеве је прогресивно повећана ( Слика 1б и 2б). Ово је углавном било локализовано на подоците и мезангијалне ћелије у гломерулима (Слика 1а) и на тубуларне епителне ћелије у тубулоинтерстицијалним (Слика 2а), као што је приказано имунохистохемијским бојењем. Морфолошки налази су потврђени имуноблот анализом хомогената целог бубрега (Слике 1ц и 2ц). Регресиона анализа је показала да је интензитет бојења укупног (Слика 1д) и активираног (Слика 2д) ГСК3б у гломерулима позитивно корелирао са излучивањем албуминурије у урину код дб/дб мишева у различитим годинама. Чак иу раној фази дијабетеса код дб/дб мишева, као што је 10 или 14 недеља старости, активност ГСК3б је била значајно повишена у бубрезима, што се одражава значајном индукцијом п-ГСК3б (слика 2). Чини се да се хиперактивност ГСК3б у бубрезима дб/дб мишева у раној фази у великој мери може приписати пост-транслационим модификацијама, као што је фосфорилација на И216, али у каснијој фази, то је углавном било због повећане експресије укупног ГСК3б.

Прогресија ДН карактерише повећање акумулације екстрацелуларног матрикса у гломерулима и интерстицијалу. Заиста, као што је показано ФЛ флуоресцентним имунохистохемијским бојењем, дб/дб мишји бубрези су показали прогресивно повећану експресију фибронектина и у гломерулима и у интерстицијалу (Слика 3а). Ово је даље потврђено имуноблот анализом хомогената бубрега на фибронектин и колаген ИВ (Слике 3б и ц). Штавише, експресија укупног и активираног ГСК3б позитивно је корелирала са експресијом фибронектина уткива бубрега(Слика 3д).

Да би се даље утврдило да ли појачана активација ГСК3б претходи развоју ДКД, дб/дб и дб/м мишеви су праћени у одвојеном експерименту почевши од 4 недеље старости током фазе предијабетеса. У седмици 7, дб/дб мишеви су показали евидентну хипергликемију (додатна слика С1А), што указује на дијабетес, али без знакова ДКД, као што је приказано нормалном албуминуријом (додатна слика С1Б). Треба напоменути да је чак иу тако раној фази дијабетеса, експресија ГСК3б и п-ГСК3б у бубрезима, као и релативна активност ГСК3б изражена као однос п-ГСК3б/ГСК3б, променљиво повећана, што је мерено имуноблот анализом ткива бубрежне биопсије. након чега следи дензитометрија (додатна слика С1Ц и Д). Поред тога, анализа линеарне регресије показала је да је активност ГСК3б бубрега у 7. недељи позитивно корелирала са развојем албуминурије и ДКД у 13. недељи (додатна слика С1Е). Штавише, анализа криве оперативних карактеристика пријемника (РОЦ) показала је да је активност ГСК3б бубрега код дб/дб мишева у доби од 7 недеља, када није било знакова ДКД, дала одличну тачност и моћ у предвиђању развоја албуминурије и ДКД (додатна слика С1Ф).

Излагање ћелија бубрега дијабетичком миљеу изазива прекомерну експресију и хиперактивност ГСК3б, што доводи до дијабетичких цитопатских промена

Да би се утврдило да ли дијабетичко стање директно повећава активацију ГСК3б ућелије бубрега, ин витро културе различитих ћелијских линија бубрега, укључујући мишје подоците, мезангијалне ћелије и тубуларне епителне ћелије, коришћене су и изложене дијабетичком миљеу који се састоји од високе амбијенталне глукозе и трансформишућег фактора раста (ТГФ) б1. Изложеност подоцита дијабетичком миљеу резултирала је упечатљивом повредом подоцита, обележеном губитком протеина маркера подоцита синаптоподина. Ово је у складу са рентом са истакнутом индукцијом укупног и активираног ГСК3б, као што је приказано ФЛ флуоресцентним имуноцитохемијским бојењем (Слике 4а и б) и потврђено имуноблот анализом

(Слика 4ц и д). У култивисаним мезангијалним ћелијама, експресија укупног (Слика 5а) и активираног (Слика 5б) ГСК3б је такође повећана након излагања дијабетичком миљеу, паралелно са повећаном експресијом молекула екстрацелуларног матрикса као што је фибронектин (Слика 5). Слично, култивисане бубрежне тубуларне епителне ћелије су имале прекомерну експресију укупног и активираног ГСК3б након третмана дијабетичког миљеа, а то је било праћено дисфункцијом и дедиференцијацијом тубуларних ћелија, обележено смањеном и поремећеном експресијом епителних тесних спојних молекула} као што су ЗО{зо{6} -1) (Слика 6а–д). Насупрот томе, као контрола осмолалитета, третман манитолом свих ћелија бубрега резултирао је ефектом који се није разликовао од онога што је пренео нормалан миље који садржи нормалну амбијенталну глукозу. Људски дијабетес укључује не само хипергликемију, већ и инсулинску резистенцију. Иако је немогуће потпуно раздвојити хипергликемију од инсулинске резистенције на животињским моделима или код пацијената, ин витро модели су искоришћени да испитају изоловани ефекат високе глукозе у односу на инсулинску резистенцију. Да би се опонашало стање инсулинске резистенције, б изоформа инсулинског рецептора је срушена у култивисаним подоцитима, мезангијалним ћелијама и бубрежним тубуларним ћелијама (додатна слика С2А-Ц), а ово је појачало експресију и активност ГСК3б чак иу нормалном миљеа, што показује имуноблот анализа и дензитометрија. Ова акција је појачана након излагања дијабетичком миљеу, означавајући синергистички ефекат инсулинске резистенције и високе глукозе на активирање ГСК3б.

Хиперактивност ГСК3б је неопходна и довољна за повреду ћелија бубрега и дисфункцију изазвану дијабетичким миљеом

Да би се истражило да ли је хиперактивност ГСК3б укључена у цитопатске промене у ћелијама бубрега, активност ГСК3б укултивисани бубрегћелије су вештачки манипулисане интерференцијом РНК

(РНАи) или прекомерна експресија гена. Као што је приказано на слици 7а, РНАи коришћењем мале, интерферентне РНК једва утиче на цитопатски ефекат дијабетичког миљеа у свим ћелијама бубрега. Насупрот томе, утишавање ГСК3б је значајно укинуло супресију синаптоподина изазвану дијабетичким миљеом у подоцитима, индукцију фибронектина у мезангијалним ћелијама и поремећај ЗО-1 у бубрежним тубуларним ћелијама, што сугерише да је ГСК3б вероватно неопходан за изазивање промена повезаних са дијабетесом у цитопатима. ћелије бубрега. Да би се утврдило да ли су прекомерна експресија и хиперактивност ГСК3б довољни за цитопатске ефекте изазване дијабетичким миљеом, ћелије су пролазно трансфектоване или празним вектором или вектором који кодира конститутивно активни мутант ГСК3б (С9А). Иако трансфекција празног вектора једва да је имала било какве ефекте, ектопична прекомерна експресија С9А довела је до губитка експресије синаптоподина у подоцитима, повећане производње фибронектина у мезангијалним ћелијама и смањене експресије ЗО-1 у бубрежним тубуларним ћелијама чак иу нормалном миљеу (Слика 7б), подсећа на цитопатски ефекат дијабетичког миљеа.

Прогресија хуманог ДН се поклапа са прекомерном експресијом ГСК3б и хиперактивношћу у бубрежним гломерулима и тубулима

Да би се даље потврдило да ли су горњи налази у моделима животињских и ћелијских култура такође применљиви на клинички ДН, архивирана ткива биопсије бубрега нормалних субјеката и пацијената са различитим стадијумима ДН обрађена су за пероксидазно имунохистохемијско бојење за ГСК3б и п-ГСК3б. Карактеристике контролних субјеката и пацијената сумиране су у Додатној табели С1. Као што је приказано на слици 8а, бубрежни

експресија укупног и активираног ГСК3б се све више повећавала заједно са прогресијом ДН како је степенована према патолошкој класификацији заснованој на бојењу периодичном киселином-Сцхифф. Ово је у складу са подацима Непхросек-а, који такође показују значајно повећану експресију ГСК3б у ткивима биопсије бубрега код пацијената са ДН (додатна слика С3). Повећана експресија укупног и активираног ГСК3б била је претежно лоцирана у подоцитима и мезангијалним ћелијама у гломерулима и у бубрежним тубуларним епителним ћелијама у тубулоинтерстицијалним (слика 8а), у складу са налазима код дб/дб мишева. Морфолошки резултати су додатно потврђени компјутеризованом морфометријском анализом, која је открила позитивну повезаност између нивоа експресије укупног (слика 8б) или активираног (слика 8ц) ГСК3б и тежине ДН.

ГСК3б је хиперактиван у ексфолијираним ћелијама уринарним путем прикупљеним код пацијената са дијабетесом и предвиђа прогресију бубрежне инсуфицијенције, како у физиолошким тако иу болесним условима, обрт и одвајање епителних ћелија бубрега, као што су гломеруларни подоцити и тубуларне епителне ћелије, се дешавају константно, што доводи до континуираног излучивања. паренхимских ћелија бубрега у урину. Уринарне ексфолијиране ћелије су успешно коришћене као неинвазивна течна биопсија бубрега заснована на урину за истраживачке и дијагностичке сврхе.24,25 Под условом да је експресија укупног и активираног ГСК3б повећана у бубрежним паренхимским ћелијама код пацијената са ДН и у ДБ/ДБ мишеви чак и у раној фази пре него што се албуминурија манифестовала, питали смо се да ли се мерење ГСК3б у ћелијама ексфолијираних у урину може искористити за предвиђање

развој или напредовање људске ДКД. У ту сврху користили смо биобанку дијабетеса и спровели ретроспективну кохортну студију. Укупно, 127 пацијената са дијабетесом меллитусом типа 2, који су праћени у Првој придруженој болници Универзитета Џенгџоу од 2010. са узорцима фракционисаног урина, прегледано је за укључивање у ову студију. Од ових пацијената, 67 је искључено, а 10 је изгубљено због праћења, 52 је имало дисфункцију бубрега или очигледну протеинурију на почетку болести, а 5 је касније дијагностиковано као друге болести бубрега биопсијом или снимањем бубрега. На крају, 60 пацијената је било укључено у ову ретроспективну кохортну студију (Слика 9). Демографске и клиничке карактеристике ових пацијената на почетку су сумиране у табели 1. Ниједан од пацијената није имао дисфункцију бубрега или очигледну протеинурију на почетку, и ниједан није започео терапију дијализом током периода праћења. Према величини албуминурије, пацијенти су категорисани у 2 подгрупе: нормоалбуминуријске и микроалбуминуријске. Осим за нивое излучивања албумина у урину (УАЕ), 2 подгрупе пацијената нису се статистички разликовале на почетку у свим другим клиничким, биохемијским и физиолошким параметрима, укључујући трајање дијабетеса, ниво гликованог хемоглобина, функцију бубрега, крвни притисак и прописане третмане . Након 5 година праћења, 29 од 60 пацијената показало је прогресију оштећења бубрега, која је дефинисана или као смањење процењене брзине гломеруларне филтрације (еГФР) од 25% или прогресија статуса албуминурије, што је назначено ескалацијом озбиљности. албуминурије дуж различитих клиничких стадијума ДН, односно нормоалбуминурије, микроалбуминурије, микроалбуминурије или очигледне протеинурије. Насупрот томе, преостали 31 пацијент није показивао знаке прогресије болести бубрега (Слика 9). Основни подаци пацијената су стратификовани према статусу прогресије бубрежне инсуфицијенције након 5 година праћења (Табела 2). Пацијенти са прогресијом оштећења бубрега, у поређењу са онима без прогресије, показали су значајно смањење еГФР и значајно повећање УАЕ. Да би се утврдило да ли је ГСК3б био прекомерно изражен или прекомерно активиран у бубрежним ћелијама и

мерено да би се проценила осетљивост и специфичност ГСК3б активности у ћелијама ексфолијације урина у односу на почетну албуминурију за предвиђање прогресије оштећења бубрега. Као што је приказано на слици 11, релативна активност ГСК3б у ћелијама ексфолијираних урина, изражена као п-ГСК3б/ГСК3б однос, показала је одличну тачност и моћ у разликовању пацијената са прогресивним оштећењем бубрега од оних са стабилном функцијом бубрега, са површином испод РОЦ-а. крива је 0.844 (95 процената интервала поверења, 0.747–0.941; П ¼ 0.001 ), што је било много боље од површине испод РОЦ криве за основну линију Лн (УАЕ) ({{20}}.750; интервал поверења од 95 процената, 0.626–0.874). Граница која је максимизирала Иоуденов индекс била је 1,24 за однос п-ГСК3б/ГСК3б и 76 мг/24 х за УАЕ. На овим граничним вредностима, осетљивост и специфичност су биле 69 процената и 87,1 процената за однос п-ГСК3б/ГСК3б и 69 процената и 77,4 процената за Лн (УАЕ). Штавише, комбинација п-ГСК3б/ГСК3б односа са укупним нивоом ГСК3б у ћелијама ексфолијираних урина значајно је побољшала дискриминаторну моћ, са површином испод РОЦ криве 0,971 (95 процената интервала поверења, 0,931–1.{48} }). Ови резултати сугеришу да мерења ГСК3б активности у ћелијама ексфолијираних у урину могу пружити много бољу тачност од УАЕ у предвиђању прогресије оштећења бубрега код пацијената са дијабетесом.

To further explore whether enhanced GSK3b activation also predicts the development of DKD, a separate cohort of patients with type 2 diabetes but no signs of kidney disease, who started follow-up between 2010 and 2013, were retrospectively screened and examined (Supplementary Table S2). The baseline characteristics of patients were stratified according to the presence or absence of renal impairment or DKD after 5 years' follow-up (Supplementary Table S3), which was defined as either a $25% reduction in eGFR or the persistent presence of albuminuria (>30 мг/24 х). Уринарне ексфолијиране ћелије на почетној линији су извучене и испитане имуноблот анализом за ГСК3б и п-ГСК3б (додатна слика С4А и Б). Активност ГСК3б процењена је дензитометријским односима п-ГСК3б према укупном ГСК3б за сваки узорак у односу на вредност контролних узорака (додатна слика С4Ц).

Међу различитим клиничким/биохемијским варијаблама, примећено је да је активност ГСК3б (однос п-ГСК3б/ГСК3б) у основним ћелијама уринарног ексфолијације значајно већа код пацијената који су развили ДКД него код оних који нису (додатна табела С3). Штавише, анализа РОЦ криве сугерише да је релативна активност ГСК3б (однос п-ГСК3б/ГСК3б) у ћелијама ексфолијираних урина обезбедила одличну тачност и моћ у предвиђању развоја ДКД код пацијената са дијабетесом у раној фази (додатна слика С4Д).