Парт 1|Екстракт Херба Цистанцхе побољшава стварање митохондријалног АТП у срцима пацова и ћелијама Х9ц2

Контакт: emily.li@wecistanche.com

Хои Јан Леунг и Кам Минг Ко

Одсек за биохемију, Универзитет науке и технологије у Хонг Конгу, Цлеар Ватер Баи, Хонг Конг САР, Кина

Кључне речи: АТП,Цистанцхе десертицола, Х9ц2 ћелије, срце, митохондрије

Апстрактан

Да истражи фармаколошку основу "Јанг- окрепљујући" дејство Хербал Цистанцхе [осушене целе биљкеЦистанцхе десертицолаИЦ Ма (Оробанцхацеае)], у кинеској медицини, ефекти метанолног екстракта Херба Цистанцхе на капацитет генерисања митохондријалног АТП-а су испитивани коришћењем ек виво модела срца пацова и ин ситу теста ћелија Х9ц2. Третман са Херба Цистанцхе екстрактом повећао је капацитет миокардног митохондријалног генерисања АТП-а на начин који зависи од дозе код пацова, као што је процењено ин витро мерењем. Стимулација капацитета генерисања АТП-а била је повезана са паралелним повећањем митохондријалног транспорта електрона подржаног пируватом, али не и сукцинатом. Третман Херба Цистанцхе такође је повећао активности миокардног митохондријалног комплекса И и комплекса ИИИ, при чему је степен стимулације на активност комплекса И био већи. Третман Херба Цистанцхеом је произвео повећање капацитета митохондријалног АТП-а у ћелијама Х9ц2 зависно од дозе и времена. Резултати показују да Херба Цистанцхе третман можеповећати производњу митохондријалног АТП-ау срцима пацова ек виво и ћелијама Х9ц2 ин ситу, могуће крозпојачавање оксидативне фосфорилације.

Цистанцхе може побољшати функцију срца, смањити крвни притисак и смањити липиде у крви

Увод

„Јанг оснаживање“, које оличава генерализовано побољшање функције тела у кинеској медицини, укључује употребу енергије у покретању различитих биохемијских процеса.

С тим у вези, АТП, који је универзална валута енергије за подстицање ћелијске функције, углавном се генерише кроз оксидативну фосфорилацију у митохондријама. Претпоставили смо да „јанг окрепљује“ биљепоседују способност да повећају капацитет производње митохондријалног АТП-а(Ко ет ал., 2004). Ово је поткријепљено нашим недавним открићем да кинеско тонизирајуће биље које „јанг оснажује“, али не и „храни јином“, може повећати капацитет производње АТП-а миокарда у мишјим срцима ек виво (Ко ет ал., 2006). Херба Цистанцхе, осушена цела паразитска биљка (искључујући цвет) Цистанцхе десертицола ИЦ Ма (Оробанцхацеае), класификована је као'Ианг-окрепљујућа "тонизирајућа биљка у традиционалној кинеској медицини (Цхен, 1998), а појављује се као најпопуларнији састојак у бројним кинеским патентираним формулацијама које се користе за Ианг-ојачавање". У Кини и Јапану, Херба Цистанцхе се широко користи за лечење низа симптома недостатка Јанга. Фармаколошке студије су показале да Херба Цистанцхе можеочистити слободне радикале(Ксионг ет ал., 1996),производи седатив(Лу, 1998),против старења(Лее ет ал., 1990),антиноцицептивни и антиинфламаторни ефекти(Лин ет ал., 2002), ипобољшати имунолошку функцију(Ву ет ал., 2005). Главни активни састојак Херба Цистанцхе јефенилетаноидни гликозиди(Оуианг ет ал., 2003), за које је утврђено да имајуантибактеријско, антистресно и антиоксидативносвојства (Ксионг ет ал., 1998), као и анти-апоптотички ефекти на култивисане неуроне (Тиан & Пу, 2005). У тренутној студији, да би се истражила фармаколошка основа деловања Херба Цистанцхе који оснажује Јанг, испитивани су ефекти третмана Херба Цистанцхе на капацитет генерисања АТП-а у митохондријама изолованим из срца пацова ек виво и култивисаним Х9ц2 кардиомиоцитима ин ситу. Да би се истражио биохемијски механизам који лежи у основи акције повећања генерисања АТП-а, ефекти третмана Херба Цистанцхе на транспорт митохондријалних електрона и комплексне И-ИВ активности такође су испитани у срцима пацова.

Ефикасни састојци Цистанцхе-а могу уклонити различите активне слободне радикале кисеоника

Материјали и методе

Хемикалије, ћелијске културе и биљни материјали

АТП, АДП и 3-[4,5-диметилтиозол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразолијум бромид (МТТ) су купљени од Сигма Цхемицал Цо (Сент Луис, МО, САД). Раствор луциферазе (АТПлите) је добијен од ПеркинЕлмер (Бостон, МА, САД). Дулбеков модификовани орлов медијум (ДМЕМ) и фетални говеђи серум (ФБС) купљени су од ГИБЦО БРЛ Лифе Тецхнологиес (Гранд Исланд, Њујорк, САД). Ћелијска линија Х9ц2 је купљена од АТТЦ-а (Роцквилле, МД, САД). Херба Цистанцхе је испоручио локални трговац биљем (Лее Хоонг Кее). Добављач је потврдио аутентичност биљке, а узорак ваучера (ХКУСТИ00301) депонован је на Одељењу за биохемију Универзитета науке и технологије у Хонг Конгу (ХКУСТ).

Биљна екстракција

Херба Цистанцхе (100г) је исечена на мале комаде, а затим екстрахована загревањем под рефлуксом у 300 мЛ метанола на 65°Ц током 2 х. Поступак је поновљен два пута. Сакупљени екстракт је осушен упаравањем растварача под сниженим притиском, а метанолни екстракт Херба Цистанцхе је добијен са приносом од 39 процената (в/в). Хемијска анализа је показала да метанолни екстракт Херба Цистанцхе садржи укупне сапонине, укупне флавоноиде, укупне лигнане и полисахариде у концентрацијама од 1,62 процента (в/в), 0,08 процената, 0,15 процената и 75,6 процената, респективно.

Брига о животињама

Одрасли мужјаци Спрагуе-Давлеи пацова (8–10 недеља; 250–300 г) држани су у циклусу од 12- х тамно/светло у просторији са контролисаном влагом на око 22◦Ц и дозвољена је храна и вода ад либитум у објектима за негу животиња у ХКУСТ-у. Експерименталне протоколе одобрио је Одбор за истраживачку праксу при ХКУСТ-у.

Лечење лековима

Животиње су насумично подељене у групе, са пет до шест животиња у свакој. У групама за лечење, пацовима је интрагастрично даван метанолни екстракт Херба Цистанцхе (растворен/суспендован у води) у растућим дневним дозама ({{0}}.031–0,5 г/кг) током 3 дана. Контролне животиње су добијале само воду. Двадесет четири сата након последње дозе, срце је добијено од животиња анестезираних фенобарбиталом и подвргнуто биохемијској анализи.

Припрема митохондријалних фракција и мерење капацитета генерисања АТП (АТП-ГЦ) ек виво

Узорци ткива леве коморе срца су изрезани и испрани ледено хладним изотоничним пуфером (0.32 М сахароза, 1 мМ ЕДТА, 50 мМ Трис/ХЦл, пХ 7,4). Фракције срчаних митохондрија су припремљене диференцијалним центрифугирањем у изотоничном пуферу на 4°Ц. 10% (в/в) срчани хомогенат је припремљен хомогенизацијом млевеног вентрикуларног ткива са хомогенизатором од тефлонског стакла на 4000 о/мин за 20-30 комплетних потеза. Хомогенат је центрифугиран на 600 × г током 10 минута да би се уклонили језгра и ћелијски остаци. Супернатант је затим центрифугиран на 8000 × г током 30 минута да би се седиментирали митохондрије (Еван, 1992). Пелете су ресуспендоване у 1 мЛ изотоничног пуфера и реконституисане митохондријалне фракције. Митохондријски АТП-ГЦ нетретираних животиња је мерен методом Леунга ет ал. (2005)

Цистанцхе полисахариди могу одложити физиолошку дегенерацију органа и дегенерацију ћелијске морфологије

Мерење митохондријалног транспорта електрона

Мерење транспорта електрона у изолованим митохондријама, које се заснива на редукцији МТТ, према [1] формираном како су описали Цохен ет ал. (1997). Митохондрије су припремљене у концентрацији протеина од 1 мг/мЛ са пуфером за инкубацију (250 мМ сахарозе, 50 мМ ХЕПЕС, 10 мМ КХ2ПО4, 2 мМ МгЦл2, 1 мМ ЕГТА, пХ 7,4) . Аликвот (40 µЛ) митохондрија је помешан са 100 µЛ сваког од 15 мМ пирувата или 0,5 мМ сукцината и 0,42 мг/мЛ МТТ. Реакциона смеша је инкубирана на 37°Ц током 10 мин уз лагано мућкање. После инкубације, реакциона смеша је прекинута додавањем 100 µЛ пуфера за лизу (10 процената, в/в, натријум додецил сулфат и 45 процената диметилформамида, подешен на пХ 4,7 са глацијалном сирћетном киселином). После стајања од 5 минута, очитавања апсорпције реакционе смеше су узета читачем микротитарских плоча (Био-Рад, Херцулес, Калифорнија, САД) и пријављена као разлика између 570 нм и 630 нм. Подаци су изражени као проценат средње вредности контролне (тј. Херба Цистанцхе–нетретиране) групе.

Ћелијска култура

Ћелије Х9ц2, трајна ћелијска линија изведена из срчаних миобласта (Хесцхелер ет ал., 1991), култивисане су као монослојеви у ДМЕМ са додатком 10 процената (в/в) ФБС. Медијум је садржао глукозу (4,5 г/Л) и глутамин (4,5 мМ), уз додатак НаХЦ03 (17 мМ), пеницилина (100 ИУ/мЛ) и стрептомицина (100 µг/мЛ). Све ћелије су узгајане у атмосфери од 5 процената (в/в) ЦО2 у ваздуху на 37°Ц. Подлога је замењена свежом подлогом свака 2 или 3 дана. Залиха ћелија је узгајана у посуди за културу од 75 цм2 и подељена пре спајања у односу субкултивације од 1:10. За АТП-ГЦ тест, ћелије Х9ц2 су засејане у густини од 2,5 × 104 ћелија/бунарићу у плочу са 24- бунарчићем. Након везивања ћелија, екстракт Херба Цистанцхе (растворен у физиолошком раствору пуферованом са фосфатом; ПБС) је примењен у медијум, а ћелије су инкубиране током дужих периода (2-16 х). Контролним (нетретираним) ћелијама је дат само ПБС.

Мерење АТП-ГЦ ин ситу

После назначених периода инкубације са ХербаЦистанцхе екстрактом у растућим концентрацијама (5{{10}}–300µг/мЛ), извршен је АТП-ГЦ тест. Медијум је аспириран и ћелије су третиране дигитонином (50 µг/мЛ) у инкубационом пуферу (120 мМ КЦл, 5 мМКХ2ПО4, 2 мМ ЕГТА, 10 мМ ХЕПЕС, 0,1 мМ МгЦл2, 0,3 мин. при 4% пХ, 7% БСА) ◦Ц. Након аспирације дигитонина, глутамат (5 мМ), малат (5 мМ) и АДП (60 µМ) су додати ћелијама за стварање митохондријалног АТП-а, што је праћено у растућим временским интервалима у распону од 0 до 15 мин. Реакција је прекинута додавањем 60 µЛ перхлорне киселине (30 процената, в/в), а реакционе смеше су затим центрифугиране на 600 × г током 10 минута на 4°Ц. Аликвот (120 µЛ) супернатанта је помешан са 90 µЛ 1,4 М КХЦО3 за неутрализацију. Смеше су поново центрифугиране на 600 × г на 4°Ц, а у супернатантима је измерен садржај АТП-а као што је раније описано. АТП-ГЦ нетретираних ћелија је процењен израчунавањем површине испод криве графикона (АУЦ1) који приказује АТП генерисан (нмол/мг протеин) у односу на време (0–15 мин) и изражен у произвољним јединицама. За ћелије третиране ХербаЦистанцхеом, вредности АУЦ1 повећања времена инкубације (3, 5, 7, 10 и 15 мин) су нормализоване на одговарајућу средњу контролну вредност из необрађених узорака и изражене као проценат контроле. Затим је израчуната површина испод криве (АУЦ2) на графикону који приказује процентуалне контролне вредности у односу на време инкубације (3–15 мин) и изражена у произвољним јединицама. Подаци група третираних Херба Цистанцхе изражени су као проценат контроле из једначине:

[АУЦ2 (ХербаЦистанцхе − третирано)/АУЦ2 (нетретирано)]×100 процената

Мерење активности комплекса И–ИВ и цитратне синтазе

Активности комплекса И–ИИИ митохондријалног ланца транспорта електрона (ЕТЦ) мерене су спектрофотометријским методама коришћењем супстрата специфичних за комплекс (НАДХ за комплекс И, сукцинат за комплекс ИИ и децилубихинол за комплекс ИИИ) како је описано (Град & Лемире, 2004; Хсу ет ал. , 2005; Марк ет ал., 2001). Активност комплекса ИВ је мерена коришћењем комплета за анализу цитокром ц оксидазе из Сигме. Активност митохондријалне цитрат синтазе мерена је методом Срере (1969).

Протеин тест

Концентрације протеина митохондријалних фракција и ћелизата одређиване су коришћењем БиоРад протеинског теста коришћењем говеђег серумског албумина као стандарда ({{0}}.038–0.600мг/мЛ).

Статистичка анализа

Сви подаци су изражени као средња вредност ± стандардна грешка средње вредности (СЕМ). Они су анализирани једносмерном анализом варијансе (АНОВА). Пост хоц вишеструка поређења су урађена са ЛСД-ом. П вредности<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Резултати

Ефекти третмана Херба Цистанцхе на миокардијски митохондријски АТП-ГЦ код пацова

Као што је приказано на слици 1, третман са Херба Цистанцхе екстрактом у дозама до 0.5 г/кг повећао је миокардни митохондријални АТП-ГЦ на начин зависан од дозе код пацова, са степеном стимулације од 89 процената при дози од 0.5 г/кг.

Ефекти третмана Херба Цистанцхе на митохондријски транспорт електрона у срцима пацова

Степен транспорта електрона у изолованим митохондријама мерен је праћењем смањења МТТ. Супстрат коришћен за испитивање је био пируват или сукцинат.

Слика 1. Ефекат третмана Херба Цистанцхе на капацитет производње митохондријалног АТП у срцима пацова ек виво

Свака трака представља средњу вредност ± СЕМ, са н {{0}}. Животиње су орално третиране ХербаЦистанцхеом у назначеним дневним дозама током 3 дана. Капацитет производње АТП-а је мерен како је описано у „Материјали и методе“. Подаци су изражени у процентима контроле у ​​односу на вредности (АУЦ2) одговарајуће нетретиране контролне групе. ∗Значајно различита од одговарајуће нетретиране контролне групе; значајно се разликује од групе која је третирана Херба Цистанцхе на 0,5 г/кг.

Слика 2. Ефекти третмана Херба Цистанцхе на митохондријски транспорт електрона у срцима пацова

Свака трака представља средњу вредност ± СЕМ, са н {{0}}. (а) Митохондријални транспорт електрона на бази пирувата (б) митохондријалног транспорта електрона уз подршку сукцината мерен је редукцијом МТТ, као што је описано у „Материјали и методе“. Подаци су изражени у процентима нетретираних контролних вредности [подржани пируват: ОД570нм− ОД630нм =0.0206 ± 0,0001 (СЕМ), н {{ 10}}; подржани сукцинатом: мушки, 0,255 ±0,015, н=5]. ∗Значајно различита од одговарајуће нетретиране контролне групе; значајно се разликује од групе од 0,5 г/кг.

Као што је приказано на слици 2а, третман Херба Цистанцхеом је дозно-зависно повећао обим митохондријалног транспорта електрона подржаног пируватом у срцима пацова, са оптималном стимулацијом примећеном при дозама од 0.5 г/кг. Међутим, у срцима пацова третираним Херба Цистанцхе нису откривене никакве значајне промене у обиму транспорта митохондријалног електрона подржаног сукцинатом (слика 2б).

За други део,кликните овде.