Део 1: Идентификација допаминергичких неурона који могу да успоставе асоцијативну меморију и акутно прекину њену експресију понашања

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ ВхатсАпп: 008618081934791

Мицхаел Сцхлеиер, 1* Алице Веиглеин, 1 Јулиане Тхоенер, 1 Мартин Страуцх, 2 Волкер Хартенстеин, 3

Мелиса Кантар Веигелт,1 Сарах Сцхуллер,1 Тимо Саумвебер,1 Катхарина Еицхлер,4,5,6 Астрид Рохведдер,4,7 Дорит Мерхоф,2 Марта Златић,5,7 Андреас С. Тхум,4,8 и Бертрам Гербер1,9 ,10*

1Лајбницов институт за неуробиологију, одељење за генетику учења иМеморија, 39118 Магдебург, Немачка, 2 Институт за снимање и компјутерски вид, РВТХ Универзитет у Ахену, 52056 Ахен, Немачка, 3 Одсек за молекуларну, ћелијску и развојну биологију, Универзитет Калифорније, Лос Анђелес, Калифорнија 90095-1606, 4 Универзитет у Констанцу, Институт за биологију, 78464 Констанц, Немачка, 5ХХМИ Јанелиа Ресеарцх Цампус, Асхбурн, Виргиниа 20147, 6 Институт за неуробиологију, Универзитет у Порторику за медицинске науке, Олд Сан Хуан, Порторико 00901, 7Департмент{, ЦБ, Университи оф Цамбридге, Кембриџ {12}}ЕЈ, Уједињено Краљевство, 8 Универзитет у Лајпцигу, Институт за биологију, 04103 Лајпциг, Немачка, 9 Центар за бихевиоралне науке о мозгу, 39108 Магдебург, Немачка, и 10 Институт за биологију, Универзитет Ото фон Герике у Магдебургу, 39106 Магдебург

Прилагодљиви прелазак са истраживања околине у потрази за виталним ресурсима на искоришћавање ових ресурса након што је потрага била успешна важна је за све животиње. Овде проучавамо неуронска кола која омогућавају ларви Дросопхила меланогастер оба пола да преговара о овој транзицији истраживања и експлоатације. То радимо комбиновањем Павловљевог кондиционирања са праћењем понашања високе резолуције, оптогенетском манипулацијом индивидуално идентификованих неурона и ЕМ анализама синаптичке организације засноване на подацима. Открили смо да оптогенетска активација допаминергичког неурона ДАН-и1 може и да успоставимеморијатоком тренинга и акутно прекинути научено понашање претраживања у следећем тесту присећања. Међутим, његова активација не утиче на урођено понашање. Конкретно, активација ДАН-и1 може успоставити асоцијативна сећања супротне валенције након упареног и неупареног тренинга са мирисом, а његова активација током теста присећања може да прекине понашање претраге које је резултат било које од ових сећања. Наши резултати даље сугеришу да по свом понашајном значају активација ДАН-и1 личи, али није једнака награди за шећер. Дендрограмске анализе свих синаптичких веза између ДАН-и1 и његове две главне мете, Кенион ћелија, и неурона излазног тела печурке МБОН-и1, даље сугеришу да би ДАН-и1 сигнали током тренинга и током теста опозива могли да се испоруче ћелије Кенион и МБОН-и1, респективно, унутар претходно непрепознатих, локално ограничених структура гранања. Ово би обезбедило елегантан мотив кола за завршетак претраге након успешног завршетка.

Кључне речи: допамин; истраживање-експлоатација; тело печурке; оптогенетика; ојачање; Претрага

Цистанцхеможе побољшати памћење

Изјава о значају

У борби за опстанак, животиње морају да истражују своју околину у потрази за храном. Међутим, када се храна пронађе, прилагодљиво је дати предност њеном искоришћавању у односу на наставак потраге која би сада била бесмислена као и тражење наочара које носите. Овај компромис између истраживања и експлоатације је важан за животиње и људе, као и за техничке уређаје за претраживање. Истражујемо који од само 10,000 неурона ларве воћне мушице може да промени равнотежу у овом компромису и идентификујемо један допамински неурон који се зове ДАН-и1 који то може да уради. С обзиром на сличности у функцији неурона допамина код животињског краља-

дом, ово може одражавати општи принцип о томе како се претрага прекида када је успешна.

Увод

Животиња која истражује своју околину може користити прошло искуство да води своју потрагу за храном. Међутим, када се пронађе храна, адаптивно је прекинути потрагу и уместо тога искористити извор хране. Овде проучавамо кола која омогућавају ларви Дросопхила меланогастер да преговара о овој транзицији истраживања и експлоатације. Нумеричка једноставност мозга ларве, комбинована са ћелијском специфичном трансгенском експресијом и познавањем њене синаптичке повезаности (Пфеиффер ет ал., 2010; Ли ет ал., 2014; Еицхлер ет ал., 2017; Саумвебер ет ал., 2018; Есцхбацх ет ал., 2020), омогућава да се ово истражи на нивоу појединачно идентификованих неурона.

Ларве Д. меланогастер лако повезују мирисе са наградом за храну (Сцхерер ет ал., 2003; Гербер и Хендел, 2006; Сцхипански ет ал., 2008; Рохведдер ет ал., 2012; Апостолопоулоу ет ал., Кудов ет ал., 201. , 2017, 2019). Критично је да научено понашање засновано на овим асоцијацијама мирис-храна престаје ако је током теста опозива награда присутна (слика 1А). Научено понашање се стога може посматрати као потрага, која се адаптивно завршава траженим исходом (тј. наградом) (Сцхлеиер ет ал., 2011, 2013, 2015а). На урођено олфакторно понашање такође не утиче (слика 1Б), што сугерише да је такво урођено понашање организовано на рефлексни начин (Сцхлеиер ет ал., 2011, 2013, 2015а,б). Дакле, природне награде могу изазвати два ефекта: током тренинга, оне дају сигнал награде који се може повезати са знаковима који накнадно усмеравају тражење награде; и током теста опозива, они могу акутно прекинути ову научену претрагу, спречавајући животиње да се удаље од ресурса када се пронађе. Ова транзиција стога одражава промену стратегије за добијање награде, а не промену мотивације (тј. не губитак интересовања за награду).

И бескичмењаци и бескичмењаци, допаминергички неурони (ДАН) пружају појачане сигнале за асоцијативно учење (Вадделл, 2013; Сцхултз, 2015; Каун и Ротхенфлух, 2017). Код Д. меланогастер, различити скупови ДАН-а преносе апетитивно и аверзивно појачање, респективно (ларве: Сцхролл ет ал., 2006; Рохведдер ет ал., 2016; Саумвебер ет ал., 2018; Есцхбацх ет ал., 2020; одрасли флиес: Сцхваерзел ет ал., 2003; Цларидге-Цханг ет ал., 2009; Лиу ет ал., 2012) (сличан сценарио може бити и бескичмењаци у настајању: Ламмел ет ал., 2012; Гроессл ет ал., 2018; Менегас ет ал. ал., 2018). Успостављајући структуру одељења, ови ДАН-ови пресецају паралелна влакна Кенион ћелија (КЦс), интринзичне неуроне највишег олфакторног центра инсеката, названог тело печурке. Поштујући ову исту структуру одељења, излазни неурони тела печурке (МБОН) прикупљају информације преко КЦ-а и шаљу их према еферентним колима (видети слике 2А-Д) (ларве: Селцхо ет ал., 2009; Паулс ет ал., 2010. ; Еицхлер ет ал., 2017; Саумвебер ет ал., 2018; Есцхбацх ет ал., 2020; одрасли: Сејоурне ет ал., 2011; Плацес ет ал., 2013; Асо ет ал., 2014а,б; Освалд и Вадделл , 2015; Такемура и сар., 2017). Приметно је да је недавна реконструкција електронског микроскопа открила да ДАН-ови имају две главне мете: КЦ и МБОН (видети слику 2Б) (ларве: Еицхлер ет ал., 2017; одрасли: Такемура ет ал., 2017).

Код ларве Д. меланогастер, активација ДАН-ова из пПАМ кластера може имати ефекат награђивања током тренинга (Рохведдер ет ал., 2016). Од четири дана овог кластера, два могу појединачно дати такав ефекат награђивања (ДАН-х1 и ДАН-и1) (Саумвебер ет ал., 2018). Овде смо одлучили да се фокусирамо

Слика 1. Шећер може дати сигнале за награду и завршетак претраге. Ларве су обучене тако да је мирис био представљен или упарен или неупарен са шећером. У следећем тесту опозива, испитани су на њихов преферен мирис или у одсуству или у присуству шећера (скица према врху). Тестирање у одсуству шећера открило је асоцијативни мирисмеморија, квантификован као позитиван ПИ. Израз понашања овогамеморијаје прекинут у присуству шећера. Дакле, шећер може дати две врсте сигнала: током тренинга, он даје сигнал за награду који се може повезати са мирисом како би водио животиње касније у њиховој потрази за наградом; а током теста опозива, шећер као тражена награда даје сигнал за прекид ове научене претраге. Величине узорака: Н=29, Н =28. Б, Ларве су тестиране на преференцију урођеног мириса, било у одсуству или у присуству шећера (скица према врху). Шећер није утицао на урођено олфакторно понашање, што указује на његову рефлексну организацију. Величине узорака: Н=20 сваки. Различита слова изнад дијаграма оквира указују на значајност у пару (Манн–Вхитнеи У тест, п, 0.05, исправљено према Бонферони-Холму). *Значајност од нуле (тест знака једног узорка, п, 0,05, исправљено према Бонферони-Холму). нс, није значајно. Сви статистички тестови и њихови резултати се приказују заједно са изворним подацима на слици проширених података 1-1. За вредности преференције мириса које су у основи ПИ ​​резултата овог експеримента, погледајте слику 9А.

Слика 2. Коло ДАН-КЦ-МБОН матрице. Хијаза медијалног режња. Информације о мирису се обрађују како би се индуковао урођени приступ, као и према пределу чашице КЦ тела печурке (љубичаста; приказан је у потпуности један пример КЦ на десној страни). Информације о награди за укус се такође обрађују да би се водило урођено понашање, као и преко углавном аминергичних модулаторних неурона (приказано је ДАН-и1, тиркизно/црно) према појединачним одељцима режњева тела печурке (на левој страни су означени одељци). Сваки од четири одељка медијалног режња (хк) прима улаз од једног ДАН-а који такође инервира исти одељак у контралатералној хемисфери. МБОН-ови медијалног режња црпе из појединачних одељака, типично за обе хемисфере (приказано је МБОН-и1, магента/жуто), и испоручују свој излаз, у конфигурацијама које се разликују између одељака, преко хемисферне поделе. Заједно, МБОН-ови су одговорни замеморија-понашање при претраживању. Подаци су засновани на Еицхлер ет ал. (2017) и Саумвебер ет ал. (2018). Б, ДАН-КЦ-МБОН матрица у и-одјељку. ДАН-и1 и већина КЦ успостављају међусобне хемијске синапсе, а и ДАН-и1 и КЦ обезбеђују излаз за МБОН-и1. Ради једноставности, детаљно су приказане само синапсе са левим ДАН-и1 и МБОН-и1 неуронима. Иста повезаност се налази у већини, ако не и у свим другим одељцима (Еицхлер ет ал., 2017; Саумвебер ет ал., 2018). Ц, ДАН-и1 (тиркизна) прима улаз изван тела печурке (тамно сива) ипсилатерално у односу на тело своје ћелије (регион означен 1), а затим инервира и-одељак у обе хемисфере (означене 2 и 3). МБОН-и1 (магента) два пута прелази средњу линију; он прима улаз у и-одељку обе хемисфере и обезбеђује излаз у регионима који су суседни телу печурке обе хемисфере. Д, Исто као у Ц, али у благо нагнутом приказу, приказује реконструкције скелета левог ДАН-и1 и МБОН-и1 неурона и један пример КЦ (црно). Подаци су засновани на Еицхлер ет ал. (2017). Е, Дендрограм левог ДАН-и1 неурона. Обојене тачке представљају излазне синапсе из ДАН-и1. Троуглови представљају улазне синапсе у ДАН-и1. Боје представљају партнерски неурон дотичне синапсе. Све остале синапсе у телу печурке су означене као „Остало“. Нису приказане синапсе које ДАН-и1 формира са неуронима изван тела печурке, посебно у региону 1 (Есцхбацх ет ал., 2020). Испрекидане линије означавају регионе у којима неурон прелази средњу линију мозга. Ф, Исто као код Е, али за леви МБОН-и1 неурон. Нису приказане синапсе које МБОН-и1 формира са неуронима изван тела печурке. За верзије високе резолуције ДАН-и1 и МБОН-и1 неурона обе хемисфере, као и све зреле КЦ, погледајте слике проширених података 2-1, 2-2 и 2-3, респективно .

на ДАН-и1 јер је претходно анализиран детаљније (Саумвебер ет ал., 2018) и зато што даје снажнији ефекат награђивања од ДАН-х1 (Саумвебер ет ал., 2018; необјављени подаци). Прво пружамо детаљан приказ просторног распореда свих синапси између ДАН-и1 и оба његова главна излазна партнера, МБОН-и1 и КЦ-а. Затим, постављамо питање да ли оптогенетска активација ДАН-и1 може посредовати не само у сигналу награде током тренинга, већ иу сигналу да се акутно прекине научено тражење награде током теста опозива.

цистанцхе бодибуилдинг

Материјали и методе

Експериментални модел и детаљи предмета. Све време су коришћене ларве трећег степена храњења оба пола (Д. меланогастер), старе 5 дана након полагања јаја. Муве су одржаване на стандардном медијуму, у масовној култури на 25 степени, 60 процената -70 процената релативне влажности и циклусу светлости/мрака од 12/12 х. Узели смо кашику медијума за храну из бочице за храну, насумично одабрали жељени број ларви, накратко их испрали у води из чесме и започели експеримент.

Користили смо трансгене ларве за експресију ЦхР2-КСКСЛ светлосног јонског канала у ДАН-овима. У том циљу, сој ефектора УАС-ЦхР2-КСКСЛ (Давидов ет ал., 2014) (љубазно достављен од Р. Киттел, Универзитет у Лајпцигу), укрштен је са једним од два соја покретача: или 58Е{{6 }}Гал4 (Пфеиффер ет ал., 2008; Лиу ет ал., 2012; Рохведдер ет ал., 2016) (Блоомингтон Стоцк Центер бр. 41347) или сплит-Гал4 сој покретача СС00864 (Еицхлер ет ал., 2017; ет ал., 2018) за добијање двоструко хетерозиготног потомства. Возач који контролише сојеви возача пребачени су на локалну копију в1118 (Блоомингтон Стоцк Центер #3605, #5905, #6326). Како ефектор контролише сој који носи места слетања која се користе за Гал4 (аттП2) или сплит-Гал4 (аттП40/аттП2), али без уметнутог Гал4 домена („празан“) (Пфеиффер ет ал., 2010), укрштан је на УАС- ЦхР2-КСКСЛ. Потврдили смо образац експресије 58Е02 и СС00864 тако што смо их укрштали са пЈФРЦ-10кУАС-ИВС-мЦД8::ГФП (Пфеиффер ет ал., 2010) (Блоомингтон Стоцк Центер #32185). Пошто је ЦхР2-КСКСЛ довољно осетљив да се активира на дневном светлу (није приказано), муве су узгајане у бочицама које су стално затамњене црним картонским омотом. За експеримент представљен на слици 8Е, УАС-ЦхР2 (Сцхролл ет ал., 2006) је укрштен са 58Е02-Гал4.

Експериментална поставка. За експерименте у понашању, ларве су обучене у Петријевим посудама унутрашњег пречника 9 цм и тестиране у Петријевим посудама унутрашњег пречника 9 или 15 цм (обе из Сарстедта), као што је поменуто у легендама слика, у свим случајевима испуњеним 1 процентом агарозе (класа електрофорезе ; Ротх). Као и мирис, користили смо н-амил ацетат разблажен 1:20 у парафинском уљу (АМ; ЦАС: 628-63-7; Мерцк), ау неким случајевима и додатно неразређен 1-октанол (ОЦТ; ЦАС: {{ 9}}; Мерцк).

Експерименти су изведени унутар 43 43 73цм околне кутије опремљене светлосним столом направљеним по мери са 24 12 ЛЕД низом (470нм; Соларок) и 6-мм дебелом дифузионом плочом од мат плексигласа на врху да би се обезбедило једнолично плаво светло за ЦхР2-КСКСЛ активацију (120мВ/цм2). Петријеве посуде су постављене директно на врх дифузионе плоче. Петријеве посуде су биле окружене полиетиленским дифузионим прстеном; иза дифузионог прстена, постављено је 30 инфрацрвених ЛЕД диода (850нм; Соларокс) како би се обезбедило осветљење које је било невидљиво за ларве, али је омогућило снимање и праћење њиховог понашања за ванмрежну анализу. У ту сврху је изнад Петријеве посуде постављена камера (Баслер ацА204090умНИР; Баслер) опремљена инфрацрвеним филтером. За додатне детаље у вези са експерименталном поставком, погледајте Саумвебер ет ал. (2018).

цистанцхе бодибуилдинг

Асоцијативно учење мириса шећера. Експерименти учења су пратили утврђене протоколе (Мицхелс ет ал., 2017). Посуде за мирисе су припремљене додавањем 10 мл мирисне супстанце у тефлонске посуде по мери (унутрашњи пречник 5 мм са перфорираним поклопцем са 7 рупа пречника 0,5 мм свака). Петријеве посуде су прекривене модификованим поклопцима перфорираним у средини са 15 рупа пречника 1 мм свака да би се побољшала аерација.

За обуку мириса и шећера, 20 ларви је стављено у средину Петријеве посуде напуњене агарозом која је садржала 2мол/Л Д-фруктозе (ЦАС: 57-48-7; Ротх) као награду (1) и опремљена са два мириса контејнери на супротним странама, оба напуњена АМ (АМ1). После 2,5 мин, ларве су премештене у свежу Петријеву посуду са обичном, неукусном агарозом, опремљену са два празна контејнера (ЕМ), где су такође провеле 2,5 мин. Изведена су три таква "упарена" циклуса тренинга, у сваком случају користећи свеже Петријеве посуде. У половини случајева обука је почела са Петријевим посудама које садрже награде као што је назначено (АМ1/ЕМ), док је у другој половини случајева редослед био обрнут (ЕМ/АМ1). За сваку кохорту ларви обучених АМ1/ЕМ (или ЕМ/АМ1), друга кохорта је обучена реципрочно, то јест, „неспареним“ приказима мириса и награде (АМ/ЕМ1, односно ЕМ1/АМ).

Након обуке, ларве су пребачене у средину пробне Петријеве посуде и тестиране на њихов мирис. Важно је да је тест опозива спроведен или на обичној Петријевој посуди ради проценемеморија-на основу понашања претраге или на Петријевој здјелици која садржи награду како би се утврдило да ли је присуство награде прекинуломеморија-базирана претрага. У оба случаја, једна страна тестне Петријеве посуде је била опремљена АМ контејнером, а друга страна ЕМ контејнером. Број ларви са обе стране одређен је са слике камере 3 минута након почетка теста. Из ових бројева, преференција мириса је израчуната на следећи начин:

Дакле, ПИ вредности могу да се крећу од 1 до 1, са позитивним вредностима које указују на то да су ларве више волеле мирис након упарене него неупарене обуке. Позитивне вредности ПИ сходно томе указују на апетитивну асоцијативностмеморијато се најбоље тумачи каомеморија-понашање при претраживању. Негативне вредности ПИ, насупрот томе, указују на аверзивну асоцијативностмеморија.

Асоцијативно учење оптогенетском ДАН активацијом. За оптогенетске експерименте, обука и тестирање су изведени аналогно. Међутим, све Петријеве посуде су биле напуњене обичном агарозом (тј. нису коришћени никакви укусни састојци). Уместо тога, за упарени тренинг, АМ је упарен са континуираном стимулацијом плавог светла да би се активирао 58Е02-ДАН или 864- ДАН на 2,5 минута, након чега је уследило 2,5 минута таме без мириса (АМ1/ЕМ). За непарни тренинг, презентација мириса и светлосна стимулација су се десили одвојено (АМ/ЕМ1). За експеримент представљен на слици 8Е, мирис и светлост су представљени по 5 минута; тај експеримент је иначе пратио процедуре које су описали Рохведдер ет ал. (2016).

Након три таква циклуса обуке, спроведен је тест присећања, а преференција мириса и ПИ су израчунати како је описано. Најважније је да је тест опозива спроведен или без активације плавог светла да би се утврдило да ли ДАН-ови посредују у сигналу награде током тренинга или са активацијом плавог светла да би се утврдило да ли, поред тога, ДАН-ови могу посредовати сигналом за прекид претраге.

Варијације овог протокола су назначене у легендама слика.

Урођено мирисно понашање. Посуде за мирисе и Петријеве посуде су припремљене као што је горе описано. Кохорте од 20 ларви су сакупљене из бочице, накратко испране у води из славине и стављене на Петријеву посуду са АМ контејнером на једној страни и празним контејнером на другој страни. Након 3 минута, урођени преференцијални мирис је одређен према једначини 1. Овај тест преференције је спроведен или у одсуству или у присуству шећера, или у одсуству или у присуству активације плавог светла, да би се утврдило да ли се ови услови испитивања мењају. урођено олфакторно понашање.

Анализа модулација понашања након тренинга са 864-ДАН активацијом. Понашање ларви је праћено видео записом и анализирано како су детаљно описали Паисиос ет ал. (2017). Укратко, анализирана су два аспекта хемотаксе ларве. Прво, модулација кастрата главе (ХЦ у секунди) (ХЦ/с) је израчуната на следећи начин:

У овој мери, угао курса (ХА) описује оријентацију главе животиње у односу на мирис, са апсолутним угловима (абс (ХА)) од 0 степена или 180 степени, на пример, што указује да је мирис је на предњој или задњој страни ларве, респективно. Ова мера стога даје позитивне резултате за привлачност (тј. када ХЦ усмерава ларве према циљу мириса, а не даље од њих), док даје негативне резултате за аверзију.

Имунохистоцхемистри. Мозак ларви је сециран у физиолошком раствору без Ца{{0}} и фиксиран у Боуин-овом раствору разблаженом 1:2 физиолошким раствором без Ца21- 7 минута. Три корака испирања (сваки по 10 минута) у ПБСТ (0,3 процента Тритон-Кс 100 у ПБС) праћена су инкубацијом са примарним антителима преко ноћи на 4 степена. После три испирања (свако по 10 минута) у ПБС-у, ткиво је инкубирано са секундарним антителима 1 х на собној температури. После три последња корака испирања у ПБС-у (сваких 10 минута), узорци су постављени у Вецтасхиелд (Вецтор Лабораториес). Препарати су испитивани под конфокалним микроскопом ДМ 6000 ЦС (Леица Мицросистемс).

цистанцхе бодибуилдинг

Као антитела, користили смо или моноклонско анти-ФАСИИ мишје антитело (ДСХБ, разблажено 1:50 у раствору за блокирање који садржи 4 процента нормалног козјег серума) и анти-ГФП зечје антитело (А11122, Инвитроген, разблажено 1:1{ {28}}00 у раствору за блокирање који садржи 4 процента нормалног козјег серума) као примарна антитела и Ци3 анти-мишја антитела (715-165-150, Јацксон ИммуноРесеарцх Лабораториес) и Алека-488 анти-зечја антитело (А11034, Инвитроген), оба разређена 1:200 у ПБС, као секундарна антитела; или смо користили моноклонско анти-ЦхР2 мишје антитело (ПроГен Биотецхник) разблажено 1:100 у 0,3 процента ПБСТ као примарно антитело, Ци3 анти-мишје антитело (715-165-150, Јацксон ИммуноРесеарцх Лабораториес), разблажено 1:300 у 0,3 процента ПБСТ , као секундарно антитело, и Алека-488 анти-ХРП (Јацксон ИммуноРесеарцх Лабораториес), разблажен 1:300 у 0,3 процента ПБСТ, за контра-бојење.